Identificación global de genes de frutos cítricos relacionados con la infección postcosecha por Penicillium digitatum. Implicación del etileno. S. Alamar, J. Gadea, J. Forment, L. Zacarías, L. González-Candelas, y J. F. Marcos Departamento de Ciencia de los Alimentos. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA) – CSIC. Burjassot, España Palabras clave: Expresión génica, micromatrices, Clemenules, Penicillium, etileno. Resumen La infección por Penicillium digitatum ocasiona pérdidas importantes durante el almacenamiento postcosecha de frutos cítricos. Dentro del proyecto español de genómica funcional de cítricos (CFGP, http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es) se ha diseñado una micromatriz que contiene clones de cDNA pertenecientes a 6.875 genes distintos del genoma de cítricos. Esta herramienta se está utilizando para el análisis de los cambios de expresión génica a escala genómica, en distintas situaciones de interés agronómico. La hibridación y análisis de dicha micromatriz con muestras de frutos de mandarina control, frutos tratados con etileno, frutos heridos o frutos heridos e infectados por Penicillium digitatum ha permitido la identificación de grupos de genes con expresión diferencial en los distintos procesos estudiados. La anotación funcional global de los resultados muestra la relevancia del metabolismo secundario en la respuesta a la infección. Además, se ha analizado mediante hibridación Northern la expresión de determinados genes, confirmando sus cambios de expresión. Los resultados sugieren los mecanismos fisiológicos y moleculares de respuesta del fruto cítrico a la infección por P. digitatum, y confirman que el etileno está actuando como mediador de la expresión de genes implicados en este proceso. INTRODUCCIÓN La infección por hongos provoca pérdidas importantes durante la postcosecha de frutos cítricos, siendo la podredumbre verde causada por Penicillium digitatum la principal alteración patológica. A pesar de su importancia agroalimentaria, hay pocos estudios sobre la respuesta a nivel molecular de los frutos cítricos a la infección, y éstos se limitan fundamentalmente al análisis de la expresión de determinados genes implicados en patogénesis en otros vegetales. La infección de frutos cítricos por P. digitatum conlleva la producción de grandes cantidades de etileno, habiéndose demostrado la implicación de esta hormona en la defensa del fruto frente a la infección (Marcos et al., 2005). El proyecto de genómica funcional de cítricos (CFGP) ha generado una micromatriz con 6.875 genes distintos procedentes de 25 colecciones de cDNAs obtenidas a partir de distintos tejidos, en diferentes estadios fisiológicos, y en respuesta a diferentes tipos de estrés (Forment et al., 2005). Dentro del CFGP, el objetivo de este trabajo ha sido estudiar los cambios globales de transcripción génica implicados en las respuestas de defensa del fruto cítrico al proceso de infección con P. digitatum y el estudio de la implicación del etileno como mediador en estos cambios de expresión, mediante el uso de la micromatriz de cDNA. 413 MATERIALES Y MÉTODOS. Se usaron frutos maduros de clementina de Nules (Citrus clementina). Se compararon cuatro tipos de tratamientos: (i) Frutos sometidos a tratamiento con etileno (10 ppm) durante 16 horas, en ausencia de infección (condición E), (ii) frutos heridos y procesados a las 24 horas (W), (iii) frutos heridos e inoculados con P. digitatum (106 conidios/mL) y procesados a las 24 horas (I), y (iv) frutos control mantenidos 24 horas en las mismas condiciones de conservación postcosecha (C). Para el estudio de la producción de etileno y los análisis Northern de expresión se analizaron además muestras a las 8, 16, y 48 horas de los tratamientos C, W e I. Se realizaron tres réplicas biológicas durante dos campañas de recolección de fruta. En las hibridaciones de micromatrices se realizaron dos réplicas técnicas de cada una de las tres réplicas biológicas, para las condiciones C, E, W e I. Las hibridaciones se hicieron a partir de muestras de cDNA obtenidas de RNA total de la muestra problema, y frente a una muestra de referencia obtenida por mezcla de todas las muestras usadas en el experimento. Los cDNAs se marcaron con los fluoróforos Cy5 (muestra) y Cy3 (referencia). Las imágenes de hibridación se capturaron y cuantificaron con el programa GenePix Pro 6.0. El análisis estadístico de las diferencias de expresión y su anotación funcional se realizó mediante los paquetes informáticos TM4 (http://www.tm4.org) y GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es). Las hibridaciones Northern se realizaron mediante protocolos estándar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Regulación diferencial de la producción de etileno. En plantas superiores, los dos pasos finales de la biosíntesis de etileno están catalizados por la ACC sintasa (ACS) y ACC oxidasa (ACO), codificadas por complejas familias multigénicas. Se midió la producción de etileno de frutos control, frutos heridos y frutos infectados a las 0, 8, 16, 24 y 48 horas y se analizó en paralelo la expresión de los genes ACO, ACS1 y ACS2 en los mismos frutos (Fig. 1). Los resultados mostraron que la producción de etileno en frutos infectados aumenta considerablemente a partir de las 24 horas (cuando la infección todavía no es visible), y que esta producción se correlaciona con la expresión de ACS1, a las 16 horas primero, y ACS2 y ACO, más tardíamente. El pico de expresión temprana de ACS2 (8 horas) parece estar relacionado con un mínimo aumento transitorio de la biosíntesis de etileno que también se observa en frutos heridos pero no infectados. Hibridaciones de micromatrices. Se realizaron un total de 24 hibridaciones (3 réplicas biológicas con 2 réplicas técnicas de cada tratamiento). El análisis de las señales de hibridación confirmó la existencia de grupos de unigenes con expresión diferencial, inducidos o reprimidos, en cada una de las condiciones estudiadas (Fig. 2). Se encontraron 302 genes inducidos durante la infección (4.3% del total de analizados), de los que 103 se inducen además por la aplicación de etileno. También se encontró un número significativo de genes con expresión diferencial específica en alguno de los tratamientos. El patrón más común es el de genes que se inducen por herida, y en mayor medida por infección (Fig. 3, DAHP, un gen clave de la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos). En muchos casos, esta inducción durante la infección estaría mediada por etileno (Fig. 3, ACT, una acetil transferasa cuya sonda hibrida con 2-3 mRNAs que, además, tienen respuestas 414 diferenciales). Algunos muestran un perfil de expresión particularmente interesante, como es el caso de la β-caroteno hidroxilasa (BCH) de la ruta de biosíntesis de carotenoides que se reprime durante la infección (Fig.3). Sin embargo, la biosíntesis de carotenoides se induce por aplicación exógena de etileno. Estos ejemplos, y su comparación con ACO, ACS1 y ACS2 (Fig. 2) son una pequeña muestra que ilustra la existencia de distintos patrones temporales de expresión, y de una regulación compleja en respuesta a la infección que en algunos casos estaría mediada al menos parcialmente por etileno. Anotación funcional de los cambios de expresión génica a escala genómica. Mediante el uso de herramientas informáticas de anotación funcional de los resultados de hibridación de micromatrices (FatiGO, http://gepas.bioinfo.cipf.es), se han encontrado ontologías génicas (GO) que se encuentran significativamente sobre- o infrarepresentadas en los grupos de genes diferenciales. Como ejemplo, se muestra el resultado resumido del análisis de los términos GO de proceso biológico en los genes inducidos por la infección (Tabla 1). Los resultados indican una implicación de rutas de metabolismo secundario, metabolismo de aminoácidos aromáticos y metabolismo de la metionina en la respuesta a la infección. Agradecimientos Estas investigaciones han sido financiadas por los proyectos GEN2001-4885-C05, AGL2000-1443 del Ministerio de Educación y Ciencia, y por ayudas de la Consellería de Agricultura, Pesca y Alimentación de la Generalitat Valenciana. Bibliografía Forment, J., Gadea, J., Huerta, L., Abizanda, L., Agusti, J., Alamar, S. et al. 2005. Development of a citrus genome-wide EST collection and cDNA microarray as resources for genomic studies. Plant Mol. Biol. 57: 375-391. Marcos, J.F., González-Candelas, L. and Zacarías, L. 2005. Involvement of ethylene biosynthesis and perception in the susceptibility of citrus fruits to Penicillium digitatum infection and the accumulation of defence-related mRNAs. J. Exp. Bot. 56: 2183-2193. Figura 1. (A) Evolución temporal de la producción de etileno en frutos cítricos control, heridos o infectados por P. digitatum, y (B) su correlación con la expresión de los tres últimos genes de su biosíntesis: ACO, ACS1 y ACS2. C2H4 (nL/g.h) (A) (B) CONTROL 7,00 CONTROL HERIDA INFECCIÓN 0 6,00 ACS1 0,80 0,40 ACS2 0,00 0 8 16 24 Tiempo (horas) 48 ACO 415 8 16 24 HERIDA 48 8 16 24 INFECCIÓN 48 8 16 24 48 Figura 2. Número de unigenes con expresión diferencial, por inducción o represión, en cada una de las condiciones de estudio o por combinación de ellas. CONTROL CONTROL ETILENO 7831 ETILENO 8020 174 21 57 54 0 41 49 HERIDA 3 INFECCIÓN 67 56 HERIDA 132 INFECCIÓN 12 0 INDUCCIÓN 251 REPRESIÓN Figura 3. Hibridación Northern de tres genes con expresión diferencial en infección y/o etileno. Por orden: 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato sintasa, β-Caroteno hidroxilasa y Acetiltransferasa. A E HERIDA CONTROL PRETR. 0 8 16 24 48 8 16 24 INFECCIÓN 48 8 16 24 48 DHAP BCH ACT Tabla 1. Ontologías Génicas (Proceso Biológico) significativas entre los genes inducidos durante la infección de frutos de Mandarina por P. digitatum Proceso Biológico * (genes inducidos/genes totales) p-valor (FDR) Nivel GO Metabolismo proteico celular (IR) (11/353) 0.0277 6 Biosíntesis de S-adenosil-metionina (SR) (3/3) 0.0303 6 Biosíntesis de derivados de aminoácidos (SR) (7/25) 0.0357 7 Metabolismo de la metionina (SR) (4/6)) 0.0375 8 Biosíntesis de ácidos grasos (SR) (6/17) 0.0483 6 * (SR) Anotación GO sobre-representada al Nivel GO especificado; (IR), ídem. infrarepresentada. 416