Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras
de alimentos para su análisis microbiológico.
OBJETIVOS
•
•
•
Comprender la importancia del muestreo para tener un análisis
microbiológico de alimentos fidedigno.
Valorar la importancia de los procedimientos para la toma, transporte y
manejo de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
Realizar la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su
análisis microbiológico.
GENERALIDADES
En el análisis microbiológico de alimentos, son de primordial importancia para
obtener resultados significativos y confiables, la adecuada selección de la
muestra, la toma correcta de ésta, los medios de conservación y su transporte
al laboratorio, Ello implica precisar el objetivo del estudio, esto es conocer la
naturaleza de las muestras, la cantidad, el tamaño o volumen del lote o partida,
para que el análisis, sea representativo del producto.
Los alimentos se muestrean principalmente por tres razones:
• Realizar el control de la calidad y determinar la vida de anaquel.
• Verificar las técnicas de manipulación y producción higiénica.
• Sospechar de intoxicaciones o infecciones a través de alimentos.
En la mayoría de los casos, el control de calidad se realiza por interés del
productor para demostrar la calidad del producto que elabora y si es posible
demostrar la superioridad frente a sus competidores. Sin embargo, el control
sanitario de los alimentos plantea la necesidad de indicar una fecha de
caducidad que garantice el periodo útil o de seguridad para consumir dichos
alimentos, esta fecha se establece con base en la vida de anaquel del
producto.
El incremento en la demanda de los consumidores por productos de buena
calidad, ha marcado la pauta sobre la producción higiénica de los alimentos,
así como el análisis para determinar las condiciones de almacenamiento o
manipulación deficientes como parte del control de calidad de los mismos.
En este sentido el muestreo debe diseñarse de tal forma que permita tomar una
muestra representativa del alimento por analizar, así como la recolección de
cualquier dato útil. Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta es la
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
1
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
uniformidad en los análisis debido a que podría llegarse a conclusiones
erróneas, por ejemplo, los resultados que se expresan como presencia o
ausencia de algún género de microorganismo, no son de valor a menos que se
especifique la cantidad del alimento analizado. Las cuentas numéricas de
microorganismos pueden variar considerablemente de acuerdo con la técnica
analítica desarrollada, así como con los medios de cultivo utilizados en la
misma, entre otros factores; esta variabilidad se elimina utilizando el mismo
método de dilución, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubación,
etc, de aquí la importancia de la aplicación de las Normas Oficiales. Finalmente
la evaluación de la higiene del producto y la aceptabilidad por parte del
consumidor, pueden seguirse apropiadamente sólo si se tiene el historial del
mismo.
En casos de envenenamiento alimentario el muestreo se dirige primordialmente
al producto consumido por el demandante, sin embargo, cualquier esfuerzo
deberá realizarse para colectar tanto los remanentes del alimento sospechoso,
platillo de la comida ingerida, así como otros lotes obtenidos durante la misma
recolección obtenida del establecimiento, incluso si no se trata del alimento
sospechoso será de gran valor, su análisis. Por otra parte si el microorganismo
causante del envenenamiento se conoce, la evaluación puede limitarse a su
búsqueda.
En el diseño del plan de muestreo es muy importante que toda persona
implicada en la recolección y envío de las muestras, así como el personal del
laboratorio y los analistas que realizan la interpretación de los resultados sean
consultados en las primeras etapas del muestreo y análisis microbiológico de
las muestras, por lo tanto deberán definirse claramente los objetivos del
análisis para evitar pérdida de tiempo y esfuerzo. Todos los análisis
microbiológicos tienen sus limitaciones y éstas se deberán tener presentes
antes de tomar cualquier acción seguida de un reporte del laboratorio.
El acondicionamiento de la muestra que se va a analizar es de importancia
fundamental, por ejemplo si las muestras se colectan inadecuadamente o no se
evalúan muestras representativas del lote, los resultados de laboratorio serán
insignificantes, ya que las interpretaciones analíticas de un lote grande se
basan en una muestra relativamente pequeña, es por esto que los
procedimientos de muestreo deben aplicarse uniformemente. Una muestra
representativa es esencial cuando están distribuidos en el alimento
microorganismos patógenos o toxinas y la comercialización del mismo depende
del contenido bacteriano demostrado en relación a los estándares legales.
El número de unidades que comprende una muestra de un lote de alimento
determinado deberá ser estadísticamente representativa, de acuerdo con la
NMX-Z-12-1987, partes 1, 2 y 3 basada en Military Standard (Mil Std 105-D),
Norma Militar Americana. La composición y naturaleza de cada lote afecta la
homogeneidad y uniformidad del total de la muestra. Un procedimiento
estadístico de muestreo correcto, dependiendo si el alimento es sólido,
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
2
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
semisólido, viscoso o líquido, deberá determinarse por el muestreador apoyado
en la NOM-109-SSA-1-1994 la cual determina los “Procedimientos para la toma
manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico”.
En un muestreo es importante tener presente el objetivo del análisis, por
ejemplo si éste se realiza como control sanitario de forma rutinaria o si por el
contrario se investiga una contaminación por algún microorganismo patógeno
en particular; otro aspecto importante para obtener resultados confiables es
que la toma de muestras al azar de cada lote, para asegurar la
representatividad del producto por analizar, además es indispensable tener un
control microbiológico de los contenedores usados en la toma de muestras lo
cual se logra manteniendo uno de ellos vacío, pero expuesto a las mismas
condiciones de recolección de la muestra; también se debe considerar que de
acuerdo a la capacidad de estos recipientes y la cantidad de muestra tomada
de cada envase correspondiente a un lote, será el número que de ellos se
necesite; en el aspecto cuantitativo una muestra unitaria consiste de un mínimo
de 100 g de alimento, que es el tamaño usual de empaque para el consumidor
del producto.
Las condiciones de conservación, transporte, tiempo comprendido entre la
recolección de la muestra, su entrega en el laboratorio, así como la realización
del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la
población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos, esto es
apreciablemente cierto en los productos perecederos.
Además se deben tomar en consideración los siguientes puntos para obtener
resultados confiables:
La recolección de las muestra se debe de efectuar evitando toda contaminación
externa, tanto ambiental, como humana para asegurar la integridad de la
misma. Si es posible, enviar las muestras al laboratorio en el empaque original
sin abrir. Si el producto es, o se encuentra en empaques de gran tamaño para
enviarlos al laboratorio, transferir la porción representativa a un contenedor
estéril bajo condiciones asépticas, para lo cual es necesario esterilizar por
separado utensilios de acero inoxidable como: cucharas, cuchillo, tenedor,
espátulas y tijeras en autoclave o en horno, para que puedan ser utilizados en
en la toma de muestra. El uso de alcohol y flamear para esterilizar utensilios o
equipo puede ser peligroso y es inadecuado.
Utilizar recipientes limpios, secos, libres de fugas, de boca ancha, estériles y de
un tamaño apropiado para la toma de las muestras del producto. En lo posible,
evitar los recipientes de vidrio que pueden romperse y contaminar el producto
alimenticio. Los contenedores como jarras de plástico o latas de metal, deberán
estar herméticamente cerrados y a prueba de fugas. Para materiales secos,
utilizar cajas de metal estériles, latas, bolsas, o empaques con sellos o cierres
adecuados. Las bolsas de plástico estériles (solamente para materiales secos,
no congelados) o botellas de plástico, son empaques útiles para líneas de
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
3
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
muestras. Se deberá tener cuidado de no sobrellenar las bolsas o fracturar la
bolsa por punción. Identificar cada muestra unitaria (definida posteriormente en
este apartado) con una etiqueta o “maskingtape”. No etiquetar con una pluma
sobre el plástico porque la tinta puede penetrar en el contenedor. De ser
posible obtener al menos 100 g de cada unidad de muestra. Enviar así mismo
controles abiertos o cerrados, dentro de contenedores estériles junto con la
muestra.
Entregar las muestras al laboratorio rápidamente, manteniendo en lo posible
las condiciones de almacenamiento originales. Cuando se colecten muestras
líquidas, tomar una muestra adicional para llevar el control de la temperatura,
se debe tomar la temperatura de la muestra control durante el muestreo y al
llegar al laboratorio. Elaborar una historia de todas las muestras para los
tiempos, fechas de recolección y llegada al laboratorio. Los alimentos enlatados
o secos que no sean perecederos y sean colectados a temperatura ambiente,
no necesitan ser refrigerados.
Transportar los alimentos refrigerados o congelados en contenedores seguros
y apropiados de construcción rígida, de tal manera que puedan llegar al
laboratorio sin cambio alguno. Colectar las muestras congeladas en
contenedores pre-enfriados. Colocar los contenedores en un congelador lo
suficientemente grande para mantenerlos fríos y espaciados; mantener en
congelación las muestras sólidas congeladas todo el tiempo. No se deberán
congelar los productos refrigerados. Enfriar en hielo entre 0-4°C las muestras
refrigeradas, excepto las de mariscos y moluscos bivalvos y colectarlas en un
contenedor con refrigerante capaz de mantener la temperatura de la muestra
entre 0-4°C hasta su llegada al laboratorio. A menos que se especifique de
otra manera, las muestras refrigeradas en general no deberán ser analizadas
en un lapso mayor a 36 h después del tiempo de recolección. Empacar las
muestras de moluscos bivalvos desconchadas en hielo frapé hasta su análisis.
Mantener los mariscos en un intervalo de temperatura entre 0 y 10°C. Examinar
los mariscos o moluscos bivalvos en un período de 6 h y no más de 24 h
después de que se hayan recolectado.
Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservación para los
alimentos perecederos ya que para fines oficiales la Ley General de Salud
señala claramente que después de la notificación de los resultados del análisis
practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de éstos, el particular
puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da
como consecuencia que la Secretaría de Salud analice la muestra testigo en un
laboratorio de tercería que ésta señale en presencia de las partes interesadas y
el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en
cuestión reúne o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo,
los alimentos aún en condiciones apropiadas de conservación, pueden sufrir
cambios significativos en sus características biológicas y/o fisicoquímicas,
provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes.
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
4
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Cualquier información relevante, como la que a continuación se señala, debe
acompañar a la muestra del alimento para asegurar que estará sujeta al
análisis más adecuado y para permitir que el analista evalúe adecuadamente
los resultados:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Nombre y autoridad del oficial muestreador.
Número de identificación de la muestra.
Fecha, hora y lugar del muestreo.
Descripción de la muestra incluyendo número de lote, código de enlatado,
etc. y datos de caducidad (úsese por tanto tiempo, mejor antes de tanto
tiempo, etc.).
Razón del muestreo.
Nombre del propietario, fabricante, manufacturador, importador, vendedor,
comprador, etc.
El proceso y fecha de cocción (si se conoce) de alimentos cocidos.
País de origen, condiciones de almacenamiento en ese país, condiciones y
tiempo de transporte (si se conocen).
Condiciones de almacenamiento del lugar del muestreo.
Otros factores importantes, por ejemplo condición del empaque, humedad,
sanitización
Método de muestreo (al azar a través del lote, al azar a través de unidades
accesibles, etc.).
Condiciones de almacenamiento y transporte desde que la muestra fue
tomada.
Detalles clínicos y epidemiológicos (en caso de sospecha de
envenenamiento alimentario, así también en caso de que se considere
como fuente de contaminación con patógenos).
Las muestras de alimentos deben ser recibidas en el laboratorio en
contenedores de varios tipos y deben utilizarse las técnicas de asepsia al
abrirse. El contenedor deberá estar desinfectado con alcohol al 70%, si es
necesario, para evitar la contaminación de la muestra. Otros lotes de un
producto similar pueden proporcionar un historial útil y deberán evaluarse junto
con cualquier muestra sospechosa. Los siguientes detalles deberán acompañar
al formato:
•
•
•
Apariencia- describir la muestra en términos generales, por ejemplo: “70.0
g de rebanada de jamón cocido, envuelta en papel, color rosado”. Deberán
registrarse los signos de deterioro, color anormal y presencia de hongos.
Textura- El deterioro bacteriano puede causar que los productos se tornen
suaves o semi-líquidos, esto aplica particularmente a los productos
cárnicos.
Olor- Este es un indicador de descomposición o contaminación. Un análisis
organoléptico incluye el sabor, pero ÉSTE NO DEBERÁ REALIZARSE EN
EL LABORATORIO.
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
5
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
A. Manejo de Muestras
Homogeneizado de Muestra
en
el
Laboratorio
y
Preparación
del
Tan pronto como la muestra de alimento llega al laboratorio, el analista deberá
anotar las condiciones físicas generales de la misma. Si la muestra no puede
ser analizada inmediatamente, deberá ser almacenada como se describe
posteriormente. Si la muestra va a ser analizada para fines regulatorios, para
investigación de un brote por consumo de un alimento, o para una inspección
bacteriológica, es esencial el seguimiento estricto a las recomendaciones
descritas a continuación.
B. Recibo de muestras.
1. Estado del contenedor de muestras. Examinar los contenedores de
muestras con el objetivo de localizar posibles defectos físicos graves.
Inspeccionar cuidadosamente bolsas y botellas para comprobar que no
presentan hoyos, fracturas, etc., además corroborar que no exista
contaminación cruzada proveniente de los defectos descritos anteriormente
y que invalidaría el análisis.
2. Etiquetado e Historial. Cada muestra debe estar sellada con tapa y
acompañada de un reporte de recolección completo (como el que se indicó
anteriormente) y registrarse el número de muestra y la fecha. Asignar a cada
muestra unitaria un número individual y analizarla separadamente a menos
de que se trate de una muestra compuesta descrita en el capítulo anterior.
3. Seguimiento de un plan de muestreo. La mayoría de los alimentos se
recolectan de acuerdo a un plan de muestreo. Dependiendo del alimento y el
tipo de análisis diseñado, determinar el plan más adecuado.
4. Almacenamiento. Si es posible, examinar las muestras inmediatamente
después de recibirlas. Sin embargo, si el análisis debe ser pospuesto,
almacenar las muestras congeladas a -20°C hasta su realización. Refrigerar
las muestras perecederas no congeladas de 0-4°C por un periodo máximo
de 36 h. Los alimentos no perecederos, enlatados o de baja humedad se
almacenarán a temperatura ambiente hasta el análisis.
C. Descongelado.
Utilizar una técnica aséptica para el manejo del producto congelado. Antes de
manipular o analizar la muestra de alimento, limpiar las áreas de trabajo y
áreas circundantes. Aunado a lo anterior humedecer el área de trabajo y las
áreas circundantes con un agente germicida comercial. De preferencia no
descongelar las muestras antes del análisis. Si es necesario atemperar la
muestra congelada para tomar una porción analítica, descongelar en el
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
6
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
empaque original o en el contenedor en el que se recibió en el laboratorio.
Cuando sea posible, evitar la transferencia de la muestra a un segundo
contenedor para descongelar. Normalmente la muestra puede ser
descongelada de 2 a 5°C en 18 h. Si se desea un descongelado rápido,
someta la muestra a una temperatura menor a 45°C por un tiempo no mayor a
15 min. Cuando se descongele una muestra a temperatura elevada (mayor a
45°C), agitar la muestra continuamente en un baño de agua con termostato.
D. Mezclado.
En las muestras alimenticias puede presentarse una distribución no
homogénea de los microorganismos. Para asegurar una distribución más
uniforme, homogenizar circularmente las muestras unitarias líquidas y las
muestras secas con una cuchara estéril u otro utensilio antes de tomar la
muestra analítica para la determinación de microorganismos mesofílicos
aerobios por el método de cuenta en placa y el número más probable para
microorganismos coliformes. Utilizar el tamaño de la muestra analítica
recomendado en cada práctica. Si el contenido del empaque es obviamente no
homogéneo (por ejemplo, una comida congelada), examinar la muestra
analítica del alimento macerado, o preferiblemente analizar cada porción por
separado, dependiendo del objetivo del análisis.
E. Pesado.
Tare el vaso de licuadora o la bolsa de Stomacher; entonces pese
asépticamente dentro del vaso de licuadora, el tamaño de muestra analítica
recomendado (si es congelado, pese antes de descongelar). Adicione la
cantidad de diluyente necesario para tener una dilución decimal (10-1). El
volumen total de muestra más diluyente deberá cubrir completamente las
aspas del vaso de licuadora.
F. Molido y Diluido.
Adicionar el volumen de solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7.2 o
agua peptonada al 0.1% estéril necesario para obtener la primera dilución
decimal al vaso de licuadora y mezclar por 2 min. Este mezclado será la
dilución 10-1. Realizar rápidamente diluciones decimales del homogenizado
original, usando pipetas que descarguen el volumen requerido con precisión.
No medir menos del 10% del volumen total de la pipeta, por ejemplo, no use
pipetas con un capacidad mayor a 10 mL para medir volúmenes menores a 1
mL; para medir volúmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas con una capacidad
mayor a 1 mL. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL de diluyente
estéril y 10 mL de la dilución previa a menos que se especifique de otra
manera. Mezclar todas la diluciones vigorosamente 25 veces en un arco de 30
cm. en 7 s. No deben excederse más de 15 min. Desde el licuado de la
muestra hasta que las diluciones correspondientes sean vertidas en el medio
de cultivo adecuado.
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
7
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
G. Homogeneización con “Stomacher”
.
La molienda con “Stomacher” como un medio para la preparación de
muestras fue introducida por Sharpe y Jackson en 1972. Fue sugerida como
una alternativa muy útil para la molienda en la preparación de alimentos para
análisis microbiológico. Los “Stomachers” (Tekmar Co., Cincinnati, OH) están
disponibles comercialmente en 3 tamaños, “Stomachers 80, 400 y 3500”, para
el manejo de volúmenes de 8-80, 40-400 y 300-3000 mL, respectivamente. El
principio de operación es muy sencillo. La muestra de alimento con el diluyente
se coloca en una bolsa de plástico estéril y se introduce en el “Stomacher”,
una caja de metal rectangular con paletas de metal dentro, de tal manera que
las paletas golpeen sobre la bolsa. Estas paletas, accionadas por un motor a
velocidad constante, se moverán hacia adelante y atrás golpeando literalmente
la muestra. Este golpeteo liberará a las bacterias de las partículas de alimento,
debido en parte a la agitación violenta del líquido y en parte por la compresión
que sufre la muestra por las paletas. No se necesita una homogenización
completa de la muestra.
Como las muestras de alimento se colocan en bolsas de plástico, los
fabricantes recomiendan que muestras con huesos u otros objetos punzantes
no se preparen con este método.
Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Química,
UNAM
8