Informe laboratorios Introducción
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Informe laboratorios Introducción La microbiología es el estudio de los microorganismos, un extenso y variado grupo de microorganismos microscópicos que existen como células aisladas o agrupaciones celulares. Estudia células vivas y su funcionamiento, trata de los microorganismos principalmente las bacterias, investiga acerca de la diversidad microbiana y de la evolución de éstos, etc. El laboratorio es una herramienta primordial para el área médica, ya que por medio de este se diagnostican diferentes patologías y además se realizan estudios para establecer el tipo de tratamiento que se debe administrar al paciente, al igual que el seguimiento del mismo. Es necesario conocer y llevar a la práctica ciertas actitudes correctas y necesarias para el buen uso de los materiales de la actividad practica en un laboratorio, es así como debemos informarnos sobre la bioseguridad y los posibles riesgos que conlleva un mal manejo de los instrumentos pertenecientes a este recinto. En el transcurso de estos cuatro pasos prácticos, logramos comprender y llevar a cabo técnicas de bioseguridad y prevención de riesgos, además aprendimos a conocer, reconocer y utilizar los elementos (herramientas) mas empleados en la siembra y análisis de microorganismos (en este caso bacterias). Las palabra bacteria (del griego, bakteria, `bastón'), es el nombre que reciben los organismos unicelulares y microscópicos, que carecen de núcleo diferenciado y se reproducen por división celular sencilla. Las bacterias son muy pequeñas, entre 1 y 10 micrómetros (µm) de longitud, y muy variables en cuanto al modo de obtener la energía y el alimento. Están en casi todos los ambientes: en el aire, el suelo y el agua, desde el hielo hasta las fuentes termales; incluso en las grietas hidrotermales de las profundidades de los fondos marinos pueden vivir bacterias metabolizadoras del azufre. También se pueden encontrar en algunos alimentos, viviendo en simbiosis con plantas, animales y otros seres vivos Trabajo Práctico 1 Procedimientos basicos y Morfología bacteriana Introducción Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar 1 accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma rutinaria. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja. Es necesario, para llevar a cabo en forma correcta la bioseguridad, conocer las técnicas de desinfección, esterilización y asepsia destinadas a la eliminación de los microorganismos presentes (o por lo menos su disminución). Entre estas técnicas contamos con: esterilización, desinfección, asepsia, sustancias bacteriostáticas y bactericidas (referencia 5, pag. 11) 8), cada una de ellas con subdivisiones y propiedades especificas. Para poder realizar actividades prácticas con microorganismos, debemos contar con medios de cultivo adecuados para el crecimiento y desarrollo de éstas bacterias. Todos los microorganismos necesitan agua, carbono, hidrógeno, calcio, fósforo y hierro como elementos vitales, hay además, microorganismo exigentes que requieres otros factores de crecimiento para poder vivir (referencia 5, pag.18). Existen medios de cultivo líquidos, sólidos y semisólidos los cuales deberemos reconocer y utilizar en los siguientes pasos prácticos. En este curso se usaran principalmente tres medios de cultivo: agar nutriente (corriente), agar sangre y agar McConkey, con los cuales podremos realizar análisis microscópicos y microscópicos. Los análisis microscópicos deben ser precedidos por una tinción (tensión de Gram) la cual permite observar claramente la forma, el tamaño y la agrupación bacteriana en un microscopio. En este practico, el objetivo general será conocer los materiales principales en la elaboración de cultivos y practicar las técnicas adecuadas y los procedimientos correctos en la elaboración de siembra y análisis microscópico. Entre los objetivos específicos encontramos: practicar diferentes tipos de siembra, describir colonias, practicar tinciones diferenciales y reconocer géneros y especies bacterianas de acuerdo a sus características macro y microscópicas. Materiales y Métodos Se utilizaron los materiales descritos en el programa necesarios para poder llevar a cabo la actividad correspondiente. a. Esterilización − asa de platino − pipeta pasteur mediante calor seco − tubos de ensayo b. Reconocimiento medios de cultivo c. Siembra y aislamiento −En tubo: de sólido a líquido Esterilización asa de platino toma de muestra desde la placa esterilización del tubo de ensayo siembra en el medio líquido esterilizar tubo de ensayo agitar esterilizar asa de platino rotular tubo de ensayo incubar a 37 ºC De líquido a sólido: 2 Esterilizar asa de platino esterilizar tubo de ensayo toma de muestra desde tubo de ensayo esterilizar tubos de ensayo siembra de muestra en agar tendido esterilizar tubo esterilizar asa de platino rotular tubo incubar a 37ºC. En placa, de sólido a sólido: Esterilizar asa de platino tomar muestra desde placa sembrar en placa de forma zig−zag esterilizar asa de platino rotular muestra incubar a 37ºC d. Análisis microscópico: Observar crecimiento describir colonias en agar sangre e. Análisis microscópico: Preparación de frotis con muestra Esterilizar asa de platino agregar tres gotas de agua al portaobjetos esterilizar asa de platino tomar muestra emulsionar secar al calor del mechero. Tinción de Gram: Frotis aplicar cristal violeta esperar dos minutos lavar con agua secar con papel absorbente agregar dos gotas de aceite de inmersión sobre la muestra observar al microscopio. Contratinción Frotis aplicar cristal violeta esperar dos minutos lavar con agua agregar safranina esperar dos minutos lavar con acetona y agua secar muestra agregar aceite de inmersión observar al microscopio. Identificar forma, agrupación y afinidad tintorial de muestras. Confeccionar tabla con estos datos. Resultados Análisis microscópico de muestras Tabla 1 Bacteria E. Coli Forma Borde Elevación Superficie Color Brillo Hemólisis Redonda Liso Convexa Semi−rugosa No se aplica Brillante gamma Streptococcus grupo A Redonda Liso Plana Granulosa No se aplica Brillante beta Streptococcus grupo B Circular Liso Convexa Lisa No se aplica Brillante Beta Staphylococcus aureus Circular Liso Convexo Lisa No se aplica Brillante beta Análisis microscópico Tabla 2 3 Nº muestra Gram Color Forma Agrupación + Morado Bacilo Cadena − Rojo Bacilo Aislado − Rojo Coccus Aislado + Morado Coccus Racimo n/a Azul Ovalado Racimo + Morado Coccus Cadena − Fucsia Bacilos Aislado n/a Verde Ovalada Aislada − Rosada Bacilo Aislado n/a Transparente Ovalada aislada Dibujo 101 Gram (+) 102 Gram (−) 103 Mezcla Gram (+) y (−) 105 Estafilococos 106 Levadura 107 Estreptococos 108 Micobacteria 109 Espora 110 bacteria cápsula Discusión En cuanto a los resultados microscópicos obtenidos en nuestra actividad, los compararemos con la información contenida en libro y en los laboratorios prácticos. En el caso de E. Coli, los resultados concuerdan con la bibliografía citada 1. En el caso de Streptococcus A y B, (referencia 1, pag.720), la hemólisis concuerda con nuestro resultado. En Estreptococos A, según pagina web, el brillo es coincidente con nuestros resultados. 4 En el resto de los resultados todos son coincidentes con lo revisado durante el laboratorio entre los alumnos y el ayudante. En cuanto a los resultados microscópicos obtenidos en nuestra actividad, en las muestras 101 y 102 hay concordancia con lo indicado en la guía, ya que al observar dichas muestras en el microscopio logramos ver los colores indicados, y por ende los gram correctos. En la muestra 103 que trataba de una mezcla de gram (+) con gram (−), no pudimos observar los gram (+), debido a problemas tales como: mala tinción, antigüedad de la muestra, muestra no representativa, etc. En la muestra 105, en cuanto al color, la forma y la agrupación esto coincide con la referencia consultada y con los visto en el laboratorio entre ayudantes y alumnos. En la muestra 106, los resultados obtenidos concuerdan con lo revisado en clases (laboratorio). La muestra 109 corresponde a una espora, no a una bacteria como las mencionadas en los ejemplos anteriores, por lo que no se aplica la tinción de Gram, si no que es aplicada la tinción con verde de malaquita, revisada en clases de laboratorio. Estos resultados coinciden con lo revisado en clases y con la referencia numero 3, pag.38 Conclusión Este paso practico, que se dividió en distintas sesiones, nos permitió conocer y aplicar de manera favorable, los procesos básicos para el estudio de microorganismos en el laboratorio, tales como la esterilización, medios de cultivo, siembra, aislamiento, tinción de Gram, análisis microscópico y macroscópico, identificación de microorganismos, etc. Los cuales son la base para realizar los pasos prácticos posteriores. También es necesario destacar que pudimos aprender sobre la seguridad en el laboratorio y las medidas necesarias para evitar riesgos, los cuales son muy importantes cuando se trabaja en éste, especialmente con microorganismos patógenos, ya que una incorrecta manipulación puede llevar a un contagio del manipulador o de quienes le rodean. Trabajo PRÁCTICO 3 Microbiota Normal Introducción El cuerpo humano contiene normalmente miles de especies bacterianas y un número menos de virus, hongos y protozoos. La mayoría de estos microorganismos desempeñan una función beneficiosa en la salud de las personas. El hospedero animal proporciona entornos favorables PATRA el crecimiento de muchos microorganismos ya que son ricos en nutrientes orgánicos y factores de crecimiento. En cada región del cuerpo hay diferentes condiciones para que los diferentes microorganismos se desarrollen, ya que difieren química y físicamente; hay ciertos entornos que son más favorables para la manutención de la microbiota normal. Estas son: • Piel: especialmente en áreas húmedas (pliegues interdigitales, axila, ingle) • Vías aéreas: nariz y nasofaringe • Aparato digestivo: boca e intestinos 5 • Vías urinarias: uretra interior • Aparato genital; vagina La composición de la flora normal varía de un individuo a otro, algunos miembros de ésta pueden transformarse en patógenos si se alteran las condiciones fisiológicas del individuo, en estos casos se altera la virulencia del microorganismo por si se introducen en localizaciones estériles. Pero también puede ser beneficiosa ya que impide la colonización por otros patógenos y producen algunos nutrientes esenciales para el organismo. El siguiente práctico tiene como objetivo general identificar la flora normal de los seres humanos y los microorganismos más comunes de las diferentes zonas del cuerpo. Como objetivos específicos se realizaran varias actividades practicas en las cuales el fin es reconocer microorganismos que están constituyendo la flora normal de un individuo en particular y también la utilización de técnicas adecuadas en la toma de muestras y análisis de la microbiota normal provenientes de diferentes partes del cuerpo. En el caso de este informe se analizara e investigara sobre la microbiota normal de dientes y encías. En un paciente sano la flora normal de la boca tiene un predominio de cocos y Gram positivos, en particular los del grupo Streptococcus alfa y beta hemolíticos y los no hemolíticos. Las especies que sé aíslan con mayor frecuencia son Streptococcus viridans, Streptococcus mitis y Streptococcus salivarius. Entre los gram positivos también figuran microorganismos del género Micrococcus y varias especies de estreptococos anaeróbios. Además de los mencionados anteriormente están presentes Staphilococcus aureus, Stafhylococcus albus, espiroquetas de Vincent, bacilos fusiformes, Sarcina lutea y Gaffkya tetragena. Los miembros de la microflora oral que les siguen en importancia son los cocos Gram negativos. Materiales y Métodos Se utilizaron los materiales descritos en el programa necesarios para poder llevar a cabo la actividad correspondiente: • tórula estéril • suero fisiológico • agar sangre • portaobjetos • pipeta pasteur • batería gram (cristal violeta, alcohol−acetona, lugol, safranina 1%) • aceite de inmersión • asa de platino Obtención de la muestra Humedecer tórula estéril con suero fisiológico frotar encías y diente sembrar en placa de agar sangre con tórula directamente incubar a 37ºC por 24 horas Individualizar colonias Estudio microscópico Frotis Tinción de Gram Estudio macroscópico Resultados En la observación microscópica vimos lo siguiente: 6 Tabla 1 Bacteria Forma Muestra boca Redonda Borde Liso Elevación Convexa Superficie Lisa Brillo Brillante Color n/a hemolisis alfa Análisis microscópico: Tabla 2 Bacteria Muestra boca Gram Color Forma Agrupación + Violeta Coccus cadena Dibujo Discusión Nuestro cultivo bacteriano en comparación con los del resto de los integrantes del grupo, difiere principalmente en el análisis microscópico. Por ejemplo, en comparación a los cultivos de células epidérmicas, la siembra obtenida de una muestra bucal es mucho mas expresiva que la anterior. Las colonias son más grandes y numerosas, lo que a primera vista nos resulta muy llamativo. A pesar de que obtuvimos un cultivo exitoso de las bacterias de la flora normal bucal, hubiese sido muy útil e interesante, el haber aplicado técnicas suficientes para reconocer el nombre de la bacteria y por lo tanto saber si se trataba de un organismo patógeno o perteneciente a la flora normal. Conclusión Las actividades realizadas durante este paso practico nos permitieron conocer las técnicas de toma de muestras de una forma teórica, de una forma practica solo la que cada integrante pudo realizar, en nuestro caso la muestra fue tomada desde la boca y encías, ya que el resto de las técnicas no pudieron ser aplicadas por falta de tiempo, ya que la muestra individual aplicando cada una de las técnicas hubiese sido un largo proceso. También fue posible aprender un poco sobre los microorganismos que constituyen la flora normal del individuo, de manera teórica, ya que mediante el análisis la muestra obtenida por nosotras no pudimos reconocer el microorganismo de manera exacta, sino mas bien tener una idea de cuales eran las posibilidades de acuerdo a la bibliografía entregada, la cual también nos permitió conocer las zonas que carecen de microorganismos y las posibles patologías que se pueden desencadenar al entrar en contacto microorganismos de la flora normal de un determinado sector del cuerpo, con otra parte del cuerpo que carezca de éste. Cuestionario 1. Que se entiende por Cuestionario Microbiota normal: 1.− Qué se entiende por: Flora normal residente o permanente: La flora normal o residente son una serie de microorganismos, especialmente bacterias, que nuestro cuerpo aloja constantemente, los cuales en condiciones normales no producen enfermedad y habitan el la piel, tracto gastrointestinal y cavidades en contacto con la superficie. La flora normal varia de un individuo a otro y cada 7 región u órgano proporciona un entorno distinto y selectivo donde se favorece a ciertos microorganismos sobre otros. Algunos miembros de la flora normal pueden transformarse en patógenos si se alteran las condiciones fisiológicas del individuo, se altera la virulencia del organismo o se introducen en localizaciones estériles. La proliferación depende de factores fisiológicos como Tº, humedad, presencia de sustancias nutrientes e inhibitorias Flora transitoria o temporal: Es la flora variable de un individuo a otro compuesta por gérmenes que colonizan en forma intermitente un determinado sector. Esta flora puede incluir bacterias potencialmente patógenas para el propio individuo u otras personas que entran en contacto con él. 2.− Enumere 3 factores benéficos de la flora normal residente • Impide la colonización por otros microorganismos patógenos • Producen algunos nutrientes esenciales para el organismo (Ej: Vitamina K es producida por la flora del intestino • Absorción de nutrientes • Producción de Ácido orgánico • Metabolismo esteroide (referencia 1, pag. 787) 3.− Acción de antibióticos de amplio espectro sobre la flora normal intestinal La administración de antibióticos puede inhibir el crecimiento de la microbiota normal como la de los patógenos, conduciendo a la esterilización virtual del TGI. En ausencia de microbiota cambian las condiciones microambientales del intestino grueso y pueden establecerse microorganismos oportunistas como el Staphylo coccus Proteus o la levadura de la Candida Albicans, quienes generalmente no crecen en el TGI, ya que no son capaces de competir con la microbiota normal. 4.− Mencione dos cuadros patológicos en los cuales gérmenes constituyentes de la flora normal, si son introducidos a localizaciones extrañas y si hay factores predisponentes, pueden actuar como gérmenes patógenos. • Infección urinaria por enterobacterias • Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Strepto coccus viridiano) 5.− Enumere los principales microorganismos que constituyen la flora normal de: Piel: • Levaduras • Staphylococcus epidermis • Difteroides • Propionibacterium acnes • Staphylococcus aureus • Staphylococcus ( incluye grupo A) • Peptococcus (micrococos anaeróbicos) • Bacilos Gram Negativos 8 Boca y Faringe: • Streptococcus (no grupo A) • Lactobacilos • Neisseria catarrhalis • Staphylococcus epidermis • Haemophilus influenzae (40−80%) • Espiroquetas • Difteroides • Pneumococcus • Candida Albicans • Klebsiella sp., E. Coli • Enterococcus • Micrococcus sp. • Staphylococcus aureus • Actinomycetes Fosas nasals: • Staphylococcus epidermis • Staphylococcus aureus (20−50%) • Neisseria catarrhalis • Streptococcus pneumoniae (neumococos) • Flora de la piel Tracto Gastro intestinal: Intestino delgado: • Lactobacilos • Enterococcus • Bacteroides Intestino grueso ( 90−95% son anaerobios obligados) • Bacteroides • E. Coli • Enterococcus • Lactobacilos • Klesbsiella sp. • Actinomycetes • Difteroides • Proteus mirabilis • Clostridium perfringens • Candida Albicans • Pseudomonas aeruginosa • Alcaligenes faecalis • Staphylococcus epidermis y aureus Extraído de referencia 3, pag.46−47−48 Pelo: 9 − Pityrospotum ovalis (ocasionalmente) Extraído de referencia 1, pag. 788 6.− Averigüe en que casos se recomienda usar medio Saboraud Este medio es recomendado en el cultivo de hongos, ya que su pH bajo favorece el crecimiento de éstos. Es también un medio selectivo que impide en crecimiento de otro tipo de microorganismos. Trabajo PRÁCTICO 3 Microbiota Patógena Introducción La flora patógena son los microorganismos que no tienen efectos beneficiosos y que además son capaces de producir enfermedad o daño en los tejidos del cuerpo, est6os se llaman patógenos. El resultados de la relación hospedero − parásito depende de la virulencia del patógeno, es decir, la capacidad de causar daño (referencia 1, pag.698), lo cual se produce porque la bacteria logro multiplicarse, para lo cual debió evadir los sistemas defensivos del hospedero. Las bacterias generalmente realizan los siguientes pasos para producir enfermedades en el hospedero. • entrada y colonización inicial • adherencia a un sitio particular • invasión o producción de toxinas • diseminación La habilidad del cuerpo humano de evitar o detener una enfermedad infecciosa a través de sus defensas, se denomina resistencia. A pesar de los mecanismos de defensa que posee el cuerpo humano las bacterias patógenas al igual que otros microorganismos patógenos son capaces de evadir estos mecanismos (referencia 9, pag.146) El objetivo general de este paso práctico es la identificación de una bacteria patógena y la investigación de su efecto en el cuerpo humano. Como objetivos específicos consideramos: • analizar una muestra clínica y conocer la adecuada toma de muestra • aislar e identificar microorganismos presentes en una muestra clínica • identificar y utilizar medios de cultivo diferenciales y selectivos en el aislamiento de bacterias, lo cual consiste en una batería bioquímica que consta de 12 pruebas estandarizadas. Materiales y Métodos Se utilizaron los materiales descritos en el programa necesarios para poder llevar a cabo la actividad correspondiente: • ⋅ muestra de bacteria N°1, en agar sangre ⋅ batería bioquímica convencional (con los tubos correspondientes) • tubo manitol 10 • tubo sorbitol • tubo citrato • agar corriente • tubo voges−proskauer • caldo urea • agar MIO • agar TSI • agar LIA • caldo corriente • caldo glucosado en campana • tubo vacío (para Voges−Proskauer) Elegir placas numeradas del 1 al 4, las cuales corresponden a las que debían ser realizadas en la primera sesión de este paso práctico, pero que a nuestro grupo se les entregó una preparación ya realizada. Sembrar en batería bioquímica incubar a 37ºC comparar condiciones iniciales con las finales. Resultados Caldo Color inicial Mn Naranjo claro Sor Rojo sandía Color final Mezcla rojo−amarillo. Rojo arriba/amarillo abajo Amarillo fuerte opaco abajo/ Reacción Lectura final (+) Alcalinidad del medio (+) Acidez del medio (+) Alcalinización del medio por liberación de amonio (por utilización de citrato como fuente de carbono) transparente abajo Cit Verde Ac Amarillo opaco Nácar transparente abajo/transparente pálido arriba Vp Amarillo aceite Azul arriba/verde fondo Amarillo pálido transparente arriba/opaco abajo (−) No hay producción de Tubo 1a: (−) acetilmetilcarbinol Tubo 1b: U Damasco Damasco (−) Mio Morado Púrpura grisáceo (+) Lia Morado Púrpura grisáceo (+) Tsi Naranjo Amarillo fuerte opaco abajo/rojo arriba K/A La bacteria no acidifico el medio a pH<4,5 La bacteria no posee ureasa Hay motilidad de bacterias La bacteria descarboxila la lisina, hay liberación de cadaverina (alcalino) neutraliza acidez. Se produjo fermentación de la glucosa, lactosa (−) y sacarosa (−) 11 Cc Gl Amarillo claro Transparente Amarillo opaco Burbuja de aire atrapada (−) AG Hay ausencia de Indol Ácido−gas No hay producción de H2S Discusión Al comparar la tabla de nuestra guía (referencia 3, pag. 71) con los resultados obtenidos, nos damos cuenta que para ninguno de los microbios mencionados, hay una completa coincidencia con las descripciones, es por eso que seleccionamos los microbios que tenían mayor cantidad de eventos a favor. Estos tres microbios son: −Salmonella paratyphi A −Salmonella paratyphi B −Enterobacter hafniae Cada una de ellas cuanta con once aciertos de trece. Para ir reduciendo las posibilidades, decidimos eliminar la bacteria enterobacter hafniae, ya que tres de sus once aciertos corresponden a eventos variables (V), por ende, las posibilidades que sea la bacteria correcta disminuyen en tres puntos. así nos quedamos con las dos bacterias salmonella paratyphi A y B. La salmonella paratyphi A coincide con todos los eventos, excepto en dos de ellos: −Citrato, el cual resulto (+) en nuestras actividades −Rojo de Metilo, el cual resulto (−) en nuestras actividades La salmonella paratyphi B coincide con todos los eventos, excepto en dos de ellos: 12 −Producción de H2S −Rojo de Metilo, el cual resulto (−) en nuestras actividades Averiguamos en varias bibliografías (referencia 1, pag.907, 938, 978) que la bacteria salmonella paratyphi B es la forma mas común, ya que tiene una fácil forma de transmitirse (contaminación fecal de alimentos o agua) y tiene síntomas típicos en la población. Microorganismos Patología causada por Período de incubación Salmonella Infección 12−36 horas Síntomas comunes Diarrea, dolor abdominal, por lo común fiebre Referencia La salmonella crece bien en agar sangre y McConkey. Es lactosa (−), oxidasa (−), móvil y produce H2S. De forma general se podría decir que la Salmonella produce dos cuadros clínicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnóstico a partir del coprocultivo. Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero está producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo está causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Choleraesuis. (referencia 6) Nuestra actividad práctica difiere con los resultados teóricos, ya que la rotulación de la placa donde tomamos la muestra indicaba la bacteria Klebsiella Pneumoniae. A pesar de esto, nosotros nos guiamos por nuestra verificación experimental de los eventos, la cual nos indicó que nuestra bacteria posiblemente sería la Salmonella Paratyphi B. Conclusión Al igual que en el paso practico anterior, uno de los objetivos de este era conocer la adecuada toma de muestra, y que al haberla estudiado en el practico anterior, en esta ocasión sirvió como reforzamiento a lo aprendido anteriormente. Esta vez la toma de muestra se aprendió de manera teórica para las distintas etapas del ciclo vital, como lactantes, niños mayores y adultos. 13 Se estudió también el como analizarla y utilizar un método y razonamiento tal que nos permita identificarla de acuerdo a la bibliografía consultada, pero esta vez con medios que no habíamos utilizado, como la batería bioquímica. La seguridad en el laboratorio fue aun más aplicada, ya que se estaba tratando con microorganismos patógenos, los cuales significarían una verdadera opción de adquirir una enfermedad en caso de entrar en contacto con éstos. La sensibilidad a antibióticos no fue practicada en este caso, solo se aprendió de manera teórica, difiriendo con los objetivos del paso practico a realizar. Cuestionario 1) ¿En que se basa la diferenciación de los microorganismos entericos cuando se utiliza el agar McConkey? La diferenciación de los microorganismos entericos mediante el agar McConkey se realiza mediante la lactosa, la cual distingue las bacterias que fermentan de las que no lo hacen. Las bacterias entéricas que utilizan lactosa forman colonias rojas debido a que los productos acídicos que se forman a partir de la lactosa afectan el indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio las especies entéricas que no usan lactosa forman colonias incoloras (referencia 5, pag. 26) 2) Averigüe cuales medios selectivos o diferenciales se usan para los siguientes microorganismos y en que se basan: • Corynebacterium Diphteriae: el cultivo de esta bacteria se realiza mediante la siembra en agar sangre, en medio de Loeffler, el que es un medio selectivo, que permite el crecimiento de C. Difteriae con morfología característica y evita el crecimiento de Streptococcus spp. Y de S. Pneumoniae de la flora faringea y en agar telurito (diferencial) donde las colonias de C. Difteriae crecen de color negro (referencia 11, pag 124) • Mycobacterium tuberculosis: Lowestein−Jensen o medio de Middlebrook altamente enriquecidos, contiene glicerina y aspargina que le sirve como fuente de nitrógeno y carbono (referencia 11, pag 165) • Salmonella typhi: McConkey , Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no forma ácidos y formara colonias incoloras. Aísla la Salmonella typhi y otros grupos de Salmonella de los excrementos, orina, aguas residuales. Agar EMB ( eosina− azul de metileno) , aísla entero bacterias Gram − pues el colorante azul de metileno inhibe el crecimiento de la mayoría de las Gram +, además la eosina es un colorante que responde a los cambios de pH, variando a incoloro al negro en condiciones de acidez. • Neisseria Meningitidis: Crece bien en agar chocolate y sangre de cordero con CO2 (referencia 11, pag 145) 3) Averigüe a que vía pertenecen cada una de las siguientes sustancias intermediarias o finales: • acetilmetilcartbinol: La acetoína o acetilmetil carbinol se forma a partir del ácido purúvico, a partir de ella se puede generar diacetilo por reducción o 2−3 butanodiol por vía oxidativa que es lo mas habitual, es mediante la enzima acetolactato descarboxilasa. • H2S: Se produce de la degradación de Tiosulfato de Sodio. Las enzimas que participan en esta reacción son enzimas proteolíticas. O−acetilserina + H2S L− cisteina + acetato. • Indol: Vía metabólica del Triptofano mediante la enzima triptofanasa • Ácidos: Vía de Enbden−Meyerhof, mecanismo de fermentación de la glucosa, se emplea cinasa y una aldosa para formar una hexosa en dos triosas. • CO2: Oxidante alternativo de la respiración celular (fuente de energía metabólica). Además se utiliza para 14 el Ciclo de Calvin. Indique para los tres primeros casos, el nombre de la enzima que hace posible su formación. 4) Cite al menos tres ejemplos de drogas bacteriostáticas y bactericidas, señalando su mecanismo de acción ¿ Que precaución se debe tener al utilizar combinaciones de drogas antimicrobianas? Las drogas bactericidas ejercen una acción letal e irreversible sobre el microbio − Metronidazol: bactericida que actúa sobre las proteínas que transportan electrones en la cadena respiratoria de las bacterias anaerobias, mientras que en otros microorganismos se introduce entre las cadenas de DNA inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos. − Vincomicina: bactericida frente a muchas bacterias Gram +, se une rápida e irreversiblemente con el extremo D−alanil−D−alanina del penta péptido del precursor del PG que se halla unido al undecaprenil−P (a nivel de membrana citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidacion. − Amoxicilina: Bactericida. Pueden atravesar la membrana externa de las bacterias Gram− . Resisten los ácidos, inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana ejerciendo una accion bactericida sobre los microorganismos sensibles. −Bacteriostáticos: agentes que afectan la función de los ribosomas bacterianos, causando la inhibición reversible de la síntesis de proteínas. Inhiben el crecimiento y multiplicación pero no matan al microorganismo. − Cloranfenicol: que actúa sobre la unidad 50s, bloquea la enzima que cataliza la síntesis del enlace peptídico − Eritromicina: macrolido que bloquea la translocacion de la unidad 50s del ribosoma − Clindamicina: impide formación de enlace peptídico en unidad 50s del ribosoma. Las precauciones que se deben tener son: ♦ Revisión de compatibilidad físico−químicas entre las drogas que se desean utilizar ♦ Prevenir la aparición de multiresistencias, respetando el tratamiento (cantidad de dosis y días), a pesar que hayan desaparecido los síntomas de la enfermedad (referencia 1) 5) Averigüe como se deben tomar las muestras de heridas y cual es su procesamiento. El mejor método para obtener una muestra de heridas y abscesos es la aspiración, a partir de lesiones purulentas, con una jeringa y aguja estériles seguida de la desinfección de la superficie cutánea con etanol o isopropanol al 70%. Las muestras de flujos internos purulentos se recogen habitualmente por biopsia o mediante resección quirúrgica de los tejidos. El transporte de las muestras desde el lugar donde se han recogido debe hacerse en estricta anaerobiosis. Conclusión General Como conclusión podemos decir que luego de nuestras clases en le laboratorio podemos ser capaces de identificar el materia habitual utilizado en la practica de microbiología, ya que su uso fue constante y necesitaba una correcta manipulación de los mismos, así como la esterilización adecuada para obtener buenos 15 resultados de los cultivos y análisis realizados. Una vez que pudimos manejar de forma adecuada los distintos materiales necesarios para las practicas de laboratorio, fue necesario conocer las distintas técnicas para la siembra y el correcto uso de microscopio para un correcto análisis, tanto microscópico, como microscópico. Ya con los datos obtenidos, y llevado al estudio y revisión de bibliografía, podemos ser capaces de identificar el tipo de bacteria que nos es entregada en clases, así como reconocer si pertenece a la flora patógena o a la residente en le hombre. Todos los procesos anteriormente mencionados, son básicos para realizar una correcta experiencia de laboratorio, así como para reforzar conocimientos teóricos en la práctica. Bibliografía http://mx.encarta.msn.com/text_761574409__1/Bacteria.html http://mx.encarta.msn.com/encyclopedia_761574409/Bacteria.html Brock Biología de los microorganismos Madigan, Michael T. 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