TEMA 1.− INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 1.− FUNCIÓN

TEMA 1.− INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO
1.− FUNCIÓN
La función del laboratorio de análisis clínicos es efectuar determinaciones analíticas cualitativas y
cuantitativas de líquidos orgánicos como sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, etc, así como heces y otras
sustancias.
2.− PELIGROS Y ACCIDENTES EN EL LABORATORIO
a.− Incendio o explosión
Ocurre cuando se utilizan solventes inflamables o sus vapores. Ej. Alcohol, éter, tolueno, etc. Se deben
manipular todos los solventes inflamables o vapores alejados de llama directa o chispa.
b.− Ácidos y Bases fuertes
• Destruyen rápidamente tejidos produciendo cicatrices.
• Nunca pipetear con la boca.
• Siempre se añadirá el ácido o la base sobre el agua, lentamente y agitando con frecuencia utilizando
vidrios resistentes. Si se realiza el agua sobre el ácido o la base, se produce una reacción exotérmica
que puede llegar incluso a explotar.
• Los vapores de amoniaco son irritantes y pueden dañar ojos y pulmones.
c.− Oxidantes fuertes
Como por ejemplo H2O2, ac. perclórico, ac. crómico, dicromato potásico, etc.
d.− Compuestos venenosos
Como ac. perclórico, ac.crómico, dicromato potásico, metanol, cianuro, arsénico, Hg, Pb, I, Ba, Zn,
hidrocarburos, derivados del petróleo, aminas aromáticas,etc.
El I y Hg son compuestos venenosos que en bajas concentraciones no son perjudiciales para el organismo y
pueden ser utilizados como antiséptico.
Todos los reactivos hay que manejarlos con mucha precaución para evitar daños en piel y ojos.
e.− Quemaduras y Escaldaduras. Choque eléctrico
Quemadura: daño en los tejidos producido por un sólido.
Escaldadura: daño en los tejidos producido por líquidos o vapores.
Medidas de Seguridad
• Atención (descuido, rapidez)
• Extintor manual
• Contaminación
• Vacunar al personal del laboratorio con gammaglobulinas
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• No pipetear con la boca. En caso de pipeteados accidentales enjuagarse con agua y/o profilácticos.
• Botiquín de urgencias
3.− CAUSAS DE ERROR EN EL LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS ( ojo cae en examen)
A.− Debido al paciente
• Error en la identificación
• Error en la petición
• Preparación del paciente
Variaciones individuales
Toma de alimentos
Hora del día al realizar las analíticas
Posición del cuerpo al realizar las analíticas, ya que puede haber variaciones de parámetros, como por ejemplo
las proteínas debido a la variación existente entre el líquido intra y extracelular en distintas proporciones.
Medicamentos que tomen los pacientes
• Recomendaciones:
estar sentado
en ayunas
mañanas de 7−9 horas
B.− Debido a la muestra
• Extracción de la muestra.
No deben utilizarse recipientes contaminados
El paciente debe estar en reposo
Cuando se vaya a realizar una extracción de sangre el éstasis no sea muy prolongado
No hemólisis en la muestra
• Transporte de la muestra. Hay que tener en cuenta:
Temperatura de la muestra
Protección frente a la luz
Tiempo (lo más rápido posible y no pasar más de 2 horas desde la toma de la muestra hasta que llega al
laboratorio)
• Separación de la muestra
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• Conservación de la muestra
Evitar la contaminación
Luz
Evitar posible evaporación de la muestra
Evitar pérdida de su estabilidad
C.− Determinación
• Método analítico. Los más adecuados son los que sean más específicos a la hora de determinar una
sustancia, generalmente son los enzimáticos.
• Errores técnicos
• Medio ambiente
• Error instrumental
Mal funcionamiento del aparato
Mal uso del instrumental
Reactivos
Pipetas
Espectrofotómetros
Tiempo y temperatura
D.− Procesos de Datos
• Tener en cuenta las prediluciones
• Trabajar con unidades concretas
E.− Resultados
• Tener en cuenta las prediluciones (multiplicar por inverso de dilución)
• Trabajar con unidades concretas
• Errores en la coma
TEMA 2.− INTRODUCCIÓN A LA BACTERIOLOGÍA
La microbiología es una disciplina que estudia la biología de los microorganismos. Los microorganismos son
seres vivos cuya característica común es que para su visualización es necesario utilizar el microscopio.
Los microorganismos se agrupan en el reino de los protistas, las creación de este nuevo reino se debe a
Haeckel (1866), discípulo de Darwin que ante la polémica de la época que incluía a unos microorganismos en
el reino animal y otros en el reino vegetal , sugirió que había microorganismos que distan mucho de parecerse
a los animales o a los vegetales y eran considerados una cosa u otra según la corriente del momento, por eso
Haeckel sugirió el nuevo reino para agrupar a los protozoos, bacterias, algas, etc.
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El reino de los protistas es muy heterogéneo, son unicelulares y lo más característico que lo diferencia
esencialmente de los animales y vegetales es que no presenta diferenciación interna, es decir, no hay
diferenciación celular ni mucho menos especialización celular en tejidos.
Mientras las células microbianas son capaces de crecer y reproducirse como seres aislados, los animales y
vegetales no son capaces de vivir solos sino en grupo.
En el reino de los protistas se aprecian claramente dos grados de evolución, cuya diferencia fundamental
radica en la estructura nuclear:
• Procariotas: no tienen estructura nuclear definida. Ej: bacterias.
• Eucariotas: si tienen estructura nuclear definida. Ej: hongos, protozoos.
Otros autores hablan de un tercer grupo que se denomina Acariota, en este grupo incluyen los virus.
1.− IMPORTANCIA Y APLICACIONES DE LA MICROBIOLOGÍA
La microbiología la podemos clasificar desde distintos puntos de vista:
• Taxonómico
• bacteriología
• viriología
• microbiología
• fitología (algas)
• Ecológico
• del suelo
• de las aguas
• de la leche
• etc.
• Aplicado
• Agrícola
• Industrial
• Clínico
2.− BACTERIOLOGÍA CLÍNICA
Estudia las bacterias que pueden causar infecciones en el hombre.
Las bacterias son microorganismos unicelulares que presentan una estructura relativamente sencilla y que se
incluyen en el reino de los protistas subgrupo procariota.
CARACTERÍSTICAS DE LAS BACTERIAS.
1.− Tamaño y forma
− Tamaño:
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Las bacterias miden 0,5 − 1m de diámetro y de 2 − 5 m de longitud.
De las más pequeñas esta el micoplasma con 0,125 − 0,250m de diámetro ( no visible al microscopio
óptico).
De las más grandes es la Espiroqueta que puede llegar a 500m de longitud, pero con un diámetro de 0,1 −
0,2m ( no visible al microscopio óptico por ser demasiado fina).
− Formas:
Las bacterias pueden ser:
• Cocos: son esféricos y exponen menos superficie al exterior distorsionándose menos. Suelen ser más
resistentes a la desecación. La relación superficie/volumen es pequeña.
• Bacilos: tienen forma cilíndrica rectangular, aparece mayor superficie al exterior. La relación
superficie/volumen es mayor que la anterior. Tienen un metabolismo muy rápido.
• Espirales: son adaptaciones al movimiento, avanzando con mayor facilidad. Tenemos:
• Vibrios: tienen media vuelta de hélice.
• Espirilos: tienen más de una vuelta de hélice y son rígidos.
• Espiroquetas: que se pueden confundir con los espirilos ya que tienen más de una vuelta de hélice,
pero son más flexibles.
• Otras formas:
♦ bacterias estrelladas.
♦ Bacterias penduladas.
♦ Bacterias con forma filamentosa.
♦ Bacterias con forma ramificada.
Cuando se dividen las bacterias pueden quedarse unidas, esto da lugar a una serie de agrupaciones. Estas
dependen de:
• que la bacteria tenga cápsula, ya que va a impedir que se separe.
• que la bacteria sea móvil o inmóvil. Las bacterias móviles tienden a separarse y las inmóviles a
juntarse.
• los planos de división.
Las agrupaciones más frecuentes en cocos son:
• Diplococos, un único plano de división. Las bacterias aparecen unidas de dos en dos y su morfología puede
variar.
• Estreptococos, se dividen en un único plano formando cadenas.
• Estafilococos, se dividen según dos planos de división. Algunas quedan unidas y otras sueltas, dan lugar a
agrupaciones irregulares (racimo de uvas).
• Lampropedia, se dividen según dos planos y permanecen unidas siempre, formándose una especie de
tableta.
• Sarcina, se dividen según tres planos de división, formando una agrupación en forma de cubo.
Las agrupaciones de bacilos más frecuentes son:
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• Estreptobacilos, son bacilos en cadena.
• Otros casos:
*pendulares
*empalizadas
2.− Estructura
Se comparan células procariotas y eucariotas. Las células eucariotas tienen núcleos definidos mientras que la
procariotas no tienen núcleo definido.
M. Nuclear
Nucléolo
ADN
División
Reproducción Sexual
Composición
Formaciones Membranosas
Ribosomas
Órganos de Membrana Simple
Respiración
Aparato Fotosintético
Flagelos
Movimiento no flagelados
Microtúbulos
PROCARIOTA
No
No
Una molécula no asociada a
proteínas
No mitosis
No meiosis
No esteroles
Son invaginaciones de la
membrana plasmática
Son 70 S
EUCARIOTA
Si
Si
Varios cromosomas constituidas
por ADN y proteínas
Si mitosis
Si meiosis
Si esteroles
Tienen retículo endoplásmico,
Ap.Golgi
Son 80 S
Están presentes vacuolas,
Están ausentes
lisosomas
Lo poseen en parte de la membrana Son órganos específicos para la
plasmática
respiración como las mitocondrias
Aparecen vesículas en continuidad Tienen órganos especializados:
de la membrana plasmática
cloroplastos
Complejos formando subunidades
Simples
de 9+2
Movimiento no deslizante y
Movimiento deslizante
ameboide
Probablemente están ausentes
Movimientos extendidos
ESTRUCTURA BASICA DE FUERA A DENTRO
1.− CAPSULA: puede existir o no.
2.− PARED
3.− MEMBRANA: por debajo de la cual puede existir o no flagelos.
4.− CITOPLASMA: se encuentra hacia el exterior, contiene gran cantidad de ribosomas. El material nuclear
es un filamento formado por una maneja sin principio ni fin. No hay cromosomas.
5.− ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS NO FOTOSINTETICAS: cuerpos laminares, lisosomas y vacuolas.
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6.− ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS FOTOSINTETICAS: son equivalentes a los cloroplastos y se
denominan tilacoides, pueden ser laminales, vesicales y tubulares.
7.− INCLUSIONES CON DISTINTAS SUSTANCIAS:
a) poli−−hidroxibutilico que son sustancias de reserva carbonada.
b) glucógeno: reserva de hidratos de carbono.
c) bolutina: reserva de fósforo y cobre.
1.− CÁPSULA
Algunas bacterias poseen hacia el exterior una envoltura constituida por sustancias mucosas ricas en agua
denominada cápsula. La cápsula es cuando esta sustancia tiene un espesor de 0.2 micrómetros y si está en
menor cantidad se habla de capa mucosa.
Este material lo sintetiza la propia bacteria y se pone de manifiesto mediante tinción negativa con Ac
específicos ya que la cápsula tiene poder antigénico.
Si observamos al microscopio óptico (m.o.) las cápsula es mucho más refringente, lo que se denomina
hinchazón de la cápsula o Reacción de Quellus.
La formación de la cápsula no e característica de especie (sp) pudiendo existir en cepas. La cápsula no es una
estructura básica, es facultativa, puede o no estar presente, y se puede eliminar por medios enzimáticos.
Composición química
En general, la cápsula esta compuesta por polisacáridos, aunque puede haber polipéptidos y complejos
polisacárido−proteína.
Ejemplo:
• Estreptococo neumoniae, tiene una naturaleza polisacárida a base de glucosa y ácido glucurónico
formando ácido celobiurónico.
• Estreptococo pyógenes, tiene en su capsula ac. glucurónico y N−acetilglucosamina que dan lugar al
ac. hialobiurónico.
Funciones
Bacterias patógenas
• protección frente a fagocitosis
• contribuye a aumentar su virulencia
• si el animal está inmunizado frente a la cápsula, posee Ac. anticapsulares y la bacteria puede ser
fagocitada
Bacterias no patógenas
• protección de la ingesta de protozoos
• protección frente a la infestación de bacteriofágos
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Otras funciones
• protección frente a la desecación
• captación de cationes mediante restos carboxílicos libres (COO−)
• adherencia al medio formando rosetas
La cápsula está unida a la pared, y esta unión puede ser por medio de enlaces iónicos, enlaces covalentes,
puentes de H y fuerzas de Vander−Walls.
2.− PARED
Está fuera de la membrana plasmática y aparece n todas las bacterias a excepción del micoplasma. Su
composición química es original y las bacterias con pared se dividen en dos grupos: gram + y gram −,
denominación que procede de la respuesta frente a la Tinción de Gram.
Desde el punto de vista de la composición química, las bacterias gram + retienen el colorante cristal violeta
mientras que en las gram − el colorante es eliminado.
Desde el punto de vista de la estructura física si damos un corte y observamos al microscopio electrónico:
• las bacterias gram + por fuera de la membrana plasmática aparece una capa gruesa y compacta de 150
a 800 amstrongs.
• las bacterias gram − fuera de la membrana plasmática aparece una capa estratificada de 100
amstrongs.
Composición química
Está formada por mureína, glicopéptidos y peptidoglucanos. Es importante tener en cuenta que la mureína
sólo aparece en la pared bacteriana ( podemos utilizar antibióticos inocuos para el hombre ( las células
humanas no tienen pared y por tanto el antibiótico no las daña)).
Ejemplo: en E.Coli existe en la mureína una serie de cadenas polisacáridas derivadas de N−acetilglucosamina
y N−acetilmuránico.
En la pared también pueden aparecer ac. teicoicos, estos se encuentran en la pared de las bacterias gram + y
no existen en las gram −. Estos ácidos son polímeros de polialcoholes fosfatos, los más importantes son:
• glicerol teicoico
• ribitol teicoico
Los OH libres de los ac. teicoicos se sustituyen por distintos radicales como N−acetilglucosamina, alanina,
etc.
Para la síntesis de los ac. teicoicos es necesario fósforo en el medio, si no lo hay estos ácidos son sustituidos
por los ácidos teutónicos formados por: ac. teurónico y N−acetilgalactosamina.
Son compuestos cargados negativamente con carácter ácido que sirven para captar cationes y proporcionando
un ambiente de carga necesaria para la actividad enzimática. Tienen función en el crecimiento de la pared,
tienen carácter antigénico y son receptores para fagos (virus)
En la pared también se encuentran lipopolisacáridos que se encuentran en las bacterias gram −. Son
moléculas complicadas desde el punto de vista químico y presentan una parte lípidica y una sacárida. Se
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denominan Ag 0 (somáticos)
Otro componente de la pared son las lipoproteínas apareciendo solo en las bacterias gram −.
Las proteínas se encuentran en gram + y gram − y tienen una función degradativa, como ribonucleasas o
desoxiribonucleasas, aunque algunas no son degradativas como las isomerasas.
Las proteínas degradan los compuestos grandes que no pueden atravesar la membrana. Las bacterias producen
las proteínas que degradan los polímetros en monómeros. No todos los monómeros pueden ser transportados,
actuando las isomerasas las cuales transforman los monómeros en isómeros.
3.− MEMBRANA
Es un elemento obligado. Está situada debajo de la pared, se cree que íntimamente adherida a la pared debido
a la existencia de una elevada P osmótica que la empuja hacia la pared.
Presenta lo que se conoce como unidad de membrana, que es la presencia de dos capas densas envolviendo
a una capa clara con un espesor de 75 amstrongs.
Composición química
Su composición química global es igual a la de la membrana de las células eucariotas, 40% lípidos y 60%
proteínas, aunque existen diferencias en el detalle del análisis químico, por ejemplo: en la membrana de las
bacterias hay ac. grasos ramificados, existe ciclopropano y es raro encontrar lecitina.
La función de los lípidos de membrana son:
• estructural
• intervenir en procesos de biosíntesis
La función de las proteínas de membrana son:
• estructural
• tienen enzimas con acción dirigida al citoplasma
• enzimas que participan en la síntesis de la pared
• permeasas
• actividad ATPasa
Funciones de la membrana
• Mantenimiento osmótico de la célula que regula el paso de sustancias de un lado a otro. Este paso de
sustancias puede ser a favor de gradiente o en contra de gradiente requiriendo un gasto de E.
• Interviene en el metabolismo oxidativo y en la producción de E.
• Participa en la división celular, en la duplicación del material genético y síntesis de la nueva pared.
4.− ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS
Se les denomina tilacoides porque son similares a los tilacoides de las plantas, y pueden ser tubulares,
vesicales y laminares.
Son invaginaciones de la membrana plasmática igual que le mesosoma.
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Pueden crecer en condiciones de anaerobiosis si las ponemos en condiciones anaerobias y si se aplica cierta
cantidad de luz aparecen vesículas en la periferia siendo muy numerosas.
5.− CITOPLASMA
No presenta gránulos membranosos independizados. La mayor parte de sus componentes están en estado
soluble. El citoplasma está lleno de ribosomas (síntesis de proteinas) estando libres y no unidos a la
membrana como en las cels. eucariotas.
Se puede encontrar distintos pigmentos como piocianina (azul), pioverdina (verde), prodigiosina (rojo) y
violacina (violeta).
6.− RIBOSOMAS
No se obtienen ribosomas aislados sino polirribosomas. Para obtener ribosomas aislados tratamos el
polirribosoma con ribonucleasa y también con actinomicina−D. Si se hace en presencia de Mg se obtienen las
dos subunidades del ribosoma, la 30s y la 50s. Su composición química es ARN y proteínas.
7.− INCLUSIONES CITOPLASMÁTICAS
Las bacterias pueden presentar en su citoplasma distintas inclusiones que son generalmente sustancias de
reserva y se suelen formar cuando hay un desequilibrio nutricional en el medio.
Las inclusiones son:
a.− Glucógeno: en el medio hay muchos carbonos en forma de azúcares capaces de dar glucosa, que por
medio de la glucogénesis da glucógeno. Estas inclusiones no tienen morfología diferenciada al observarlas al
microscopio electrónico como ocurre con los animales. Al microscopio ótico el glucógeno no se ve pero
puede ponerse de manifiesto cuando la bacteria tiene una alta concentración de glucógeno mediante tinción
con lugol ya que se tiñe de color pardo−rojizo.
b.− Bolutina: su principal constituyente es el fósforo. Desde el punto de vista químico son fosfatos
polimerizados, también pueden encontrarse otros constituyentes en menores proporciones. Pueden llegar a
constituir el 50% de los fosfatos de reserva en la célula.
c.− Poli−beta−hidroxilbutílico: es una reserva de carbono que se sintetiza cuando la fuente de carbono es
acetato o compuestos que se degradan en acetato.
d.− Azufre: la acumulan dos tipos de bacterias:
• sulfooxidantes: capaces de oxidar compuestos de azufre para obtener E.
• fototrofas: emplean compuestos de azufre como dadores y aceptores de electrones en la fotosíntesis.
e.− Cristales paraesporales: se forman en bacterias esporuladas. Desde el punto de vista químico son proteínas
de estructura cristalina muy compacta y brillante al microscopio óptico. Su significado funcional no se conoce
y tiene relación con la esporulación.
8.− MATERIAL NUCLEAR
Se habla de material nuclear y no de núcleo ya que no tiene envoltura nuclear, por lo que no hay separación
entre núcleo y citoplasma. No se puede ver al microscopio óptico( M/O), para ver el material nuclear se
recurre a técnicas especiales, como la técnica de Feulgen que consiste en hacer una hidrólisis ácida sobre los
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ácidos nucleicos.
La duplicación del cromosoma bacteriano se caracteriza por:
• ser semiconservativa, el material nuclear esta constituido por dos cadenas de ADN a partir de la doble
hélice. Cuando se produce la duplicación cada cadena sirve de molde para la síntesis de su complementaria.
• sólo tiene un origen de duplicación.
• Es discontinua, la cadena no se sintetiza continuamente sino en pequeños fragmentos denominados de
Okazoki que posteriormente son soldados.
• Es bidireccional, ya que crece en dos direcciones.
En la duplicación cromosómica es necesario la participación de enzimas, como:
♦ enzimas desenrollantes, cumplen la función de desenrollar la doble hélice para que cada
cadena sintetice su complementaria.
♦ ARN polimerasa, ya que el ADN no se puede biosintetizar sin obtener un pequeño fragmento
de ácido nucleico al que se añade.
♦ ADN polimerasa, que se va añadiendo al ARN cebador.
9.− ADN EXTRACROMOSÓMICO
Pequeños fragmentos de ADN pueden estar libres y duplicarse de forma autónoma , se les denomina
plásmidos o bien estos pequeños fragmentos de ADN que están libres pueden integrarse en el cromosoma
bacteriano y duplicarse al mismo tiempo que el cromosoma y se les denomina episoma.
Dentro de los plásmidos tenemos distintos ejemplos:
1º− Factor R o RTF (Factores de Transferencia a la Resistencia): son factores que transfieren resistencia
antimicrobiana, son frecuentes. Ej: bacterias que tengan plasmido penicilasa.
2º− Factor F o factor sexual: codifican para la síntesis de una estructura de la superficie de la bacteria
denominada Pili sexuales, permite que en unas bacterias se de la conjugación.
A las cepas que presentan el factor F se las denomina F+ o machos, ya que cede su material genético. Las
cepas que carecen del factor F se las denomina F− o hembras.
10.− ESPORAS
Se tratan de estructuras presentes en algunas bacterias bacilares que pueden estar en el interior de la bacteria
(endoespora) o permanecer libre. Son formas de resistencia y son capaces de soportar durante tiempos
elevados temperaturas de 60− 80 ºC, esta temperatura no la soporta una bacteria normal. Las más resistentes
pueden resistir 120ºC durante 10 minutos.
Son visibles al M/O, la forma y posición de la espora en el interior de la bacteria es característica taxonómica
a la hora de clasificar las bacterias esporuladas.
El tamaño es importante y se pueden clasificar en :
• esporas no deformantes, son aquellas que su diámetro es inferior a la célula vegetativa. En función de la
posición en que se encuentra la espora tenemos:
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♦ Espora en posición central.
♦ Espora en posición subterminal.
♦ Espora en posición terminal.
• esporas deformantes, son aquellas en las que su diámetro es mayor que la célula vegetativa.
Las bacterias esporuladas son un pequeño grupo de géneros, los más importantes son :
♦ Bacillus, son aerobios.
♦ Clostridium, son anaerobios.
Estructura de las esporas
De dentro hacia fuera encontramos:
1. Citoplasma con material nuclear.
2. Membrana plasmática.
3. Pared.
4. Por fuera aparece una capa gruesa propia de la espora llamada Cortex (corteza) que da resistencia.
5. Aparecen dos túnicas ( intima y exina) o más que son más resistentes a los agentes físicos y químicos.
6. Puede haber una última capa de contorno irregular llamada exosporio (sólo en algunas especies).
A la bacteria que produce la espora se la denomina célula vegetativa o esporangio.
Se denomina esporulación al fenómeno por el cual una bacteria vegetativa produce una espora al ser las
condiciones del medio adversas.
Se denomina gemación al proceso por el cual de una espora surge una bacteria al volver a ser favorables las
condiciones para el germen.
11.− FLAGELOS
La mayoría de las bacterias móviles deben ésta a apéndices filamentosos denominados flagelos, cuya longitud
es igual a 10 − 20m y su diámetro a 10 − 20nm.
No son visibles al M/O por su pequeño diámetro .
Según el número y posición de los flagelos en la bacteria se clasifican en :
• Monotriticas, un flagelo en el polo.
• Politriticas o L ofotriticas, varios flagelos en el polo.
• Anfitrícas, varios flagelos en ambos polos.
• Peritricas, varios flagelos alrededor de la bacteria.
Los flagelos tienen naturaleza proteica. Al observarlos al M/E se distinguen tres partes:
• Filamentos, constituidos por una cadena proteica denominada flagelina (diferente en cada especie). Tiene
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carácter antigénico y se denomina Ag h o Ag flagelar.
• Gancho, es un engrosamiento constituido por proteínas globulares.
• Cuello o cuerpo basal, con dos parejas de cilindros y proteínas diferentes.
12.− FIMBRIAS, PILIS O PELOS
Son apéndices filamentosos similares a flagelos, aparecen en la superficie de algunas bacterias , son móviles e
inmóviles y no tienen nada que ver con el movimiento y son más finos que los flagelos, longitud 0,5 − 2m y
diámetro 7 − 8nm. No son visibles al M/O.
Puede haber distintos tipos de pilis según el grosor: pili I, pili II, pili III, pili IV, pili V. Una bacteria puede
tener varios tipos dentro de una misma especie.
Los pelos mejor conocidos son los de E. Coli, tipo I, en los que se ha aislado una proteína denominada pilina
que son proteínas globulares con ordenación helicoidal o lineal. A las especies cuyas cepas no tienen pelos se
las denomina calvas.
Función de los pelos
1º.− Adherirse al medio donde vive, en superficies inertes o células de animales.
2º.− Las cepas con pelos poseen una actividad respiratoria mayor que las cepas sin pelos.
Existen unos pelos especiales (pilis sexuales) que determinan presencia de material genético
extracromosómico (Factor F) su función es actuar como conducto de material genético de una bacteria F+ a
una F− . La proteína es distinta de los pelos normales y se denomina pilina F.
13.− GLICOCÁLIX
Es una masa de fibras constituida por polisacáridos que rodean a una o varias bacterias (posición extracelular).
Gracias a él las bacterias pueden unirse a distintas superficies, como piezas dentarias, etc.
Sus funciones son :
♦ De adherencia.
♦ Concentra enzimas líticos.
♦ Almacena y canaliza alimentos.
♦ Protege a la bacteria de los fagocitos.
♦ Interfiere en la respuesta inmune.
3.− Tipo de reproducción bacteriana
La principal forma de reproducción bacteriana es binaria o asexual, esta división requiere la duplicación de
todos los constituyentes necesarios y el reparto de todos en las células hijas.
La 1ª etapa es la separación de las cadenas de ADN y replicación de cada una para dar dos cromosomas más
que se repartirán entre las dos células hijas, luego se forma un tabique transversal asociado al mesosoma que
separa las dos células que se origina. Los dos cromosomas hijos emigran a uno de los polos así como los
orgánulos más importantes. También puede haber una reproducción bacteriana pero menos importante a partir
de la gemación (más típica en hongos)
% Mecanismo de intercambio genético:
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Tiene lugar principalmente por división binaria. Tiene como principal inconveniente la falta de material
genético, por ello la única posibilidad de que la bacteria evolucione:
• Variación en el fenotipo: relacionado con las condiciones del medio ambiente. El genotipo no se altera, es
reversible y no hereditario.
• Mutación: se altera el genotipo, son irreversibles y hereditarias.
• Transferencia: se produce cuando un fragmento de ADN (plásmido) procedente de una bacteria pasa a otra.
Existen tres tipos de trasferencias:
• transformación: la bacteria receptora capta ADN que se encuentra presente en el ADN después de haber
sido liberado por la bacteria donante.
• congujacion: se transfiere el plasmido por medio de un contacto físico entre dos bacterias a través de pilis
sexuales.
• Traducción: transferencia de ADN por medio de bacteriófagos (virus).
% Crecimiento bacteriano:
La principal función de cualquier bacteria es el crecimiento considerando este un aumento de número o masa
de todos los componentes celulares.
La medición del crecimiento se realiza inoculando un medio líquido con la bacteria y estudiando la
concentración celular en cada momento. De esta forma comparando el número de células vivas/ml a lo largo
del tiempo se obtiene la curva de crecimiento, en la que se distinguen las siguientes fases:
1ª) fase de latencia: las bacterias inoculadas se adaptan al nuevo medio, no se observa crecimiento.
2ª) fase exponencial: la masa bacteriana aumenta como consecuencia de la multiplicación bacteriana.
3ª) fase estacionaria: a medida que se agotan los nutrientes y aparecen productos tóxicos de materia celular,
el crecimiento se endentece pero existe un equilibrio que mantiene constante el número de células.
4ª) fase de declive: la tasa de mortalidad aumenta y el crecimiento se endentece por disminuir nutrientes el
número de bacterias viables disminuye hasta casi cero.
El tiempo que un cultivo bacteriano necesita para completar este ciclo depende del tiempo de generación de
cada especie (tiempo para que cada célula de lugar a dos células hijas). Este tiempo de generación es de
20−30 minutos encontradas con frecuencia en patología humana por lo que la curva se completaría en
18−24h.
El crecimiento bacteriano también se puede simular en aparatos del laboratorio denominados quimiostatos y
túrbidostatos, ambos aparatos se basan en añadir medio fresco en un cultivo a medida que eliminamos igual
volumen que el cultivo viejo.
4.− Nutrición Bacteriana
Para que una bacteria se desarrolle adecuadamente es necesario que el medio disponga de:
% De una fuente carbonada a partir de glúcidos, lípidos y cetoacidos.
% Una fuente de nitrógeno que se consigue a partir de proteínas, péptido y aminoácidos.
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% Fuente de fósforo a partir de fosfatos inorgánicos.
% Metabolitos esenciales obtenidos de la degracion de alimentos y formados en el interior de las bacterias
gracias a reacciones metabólicas que dan lugar a g−6−p.
% Factores de crecimiento que las bacterias no pueden producir F.V y F.X.
% Factores estimulantes que no son imprescindibles pero aligeran el procedimiento.
Las bacterias pueden obtener la energía de dos formas:
• Energía radiaciones solares (fototrofas)
• Reacciones químicas (quimiotrofas).
En cuanto al poder sintetizante de cada bacteria, tiene una distinta capacidad para sintetizar glucidos, lípidos y
proteínas a partir de elementos sencillos como agua, CO2 dependiendo de esta capacidad podemos distinguir:
• Bacterias autótrofas: gran poder de síntesis (glucidos, lípidos y proteínas) obtienen energía a partir de
materia inorgánica. Dentro de estas las podemos clasificar en:
% Estrictas: no pueden utilizar la materia orgánica.
% Facultativas: si pueden utilizar la materia orgánica.
• Bacterias heterótrofas: poder de síntesis menor. Necesita obtener sus propios nutrientes (glucidos, lípidos,
proteínas) a partir de materia orgánica.
5.− Metabolismo bacteriano
Cuando los nutrientes has entrado en la bacteria sufren transformaciones químicas que dan lugar a la síntesis
de materia bacteriana. A estas reacciones se les denomina metabolismo, el cual se divide en tres etapas:
• Catabolismo: conjunto de transformaciones que sufre la materia asimilada por las bacterias hasta llegar a
degradarse en componentes más sencillos y producir energía necesaria para que la bacteria pueda sintetizar
sus propios nutrientes. La energía se almacena en forma de ATP.
• Anfibolismo: los metabolitos intermedios se transforman enzimaticamente en componentes básico como
aminoácidos, bases nitrogenadas. También se puede obtener energía y almacenar en forma de ATP.
• Anabolismo: síntesis de macromoléculas de las bacterias. Aprovechando la energía obtenida en las fases
anteriores. Las bacterias tienen un anabolismo sintetizado, hidratos, lípidos, proteínas, ADN, ARN, y 20
aminoácidos necesarios. (las células eucariotas no sintetizan los 20 aminoácidos).
Principales vías catabólicas: se pueden clasificar en función de las oxidaciones biológicas teniendo en cuenta
la naturaleza del aceptor final del hidrogeno:
1º) Respiración aerobia: el aceptor final es el oxigeno.
2º) Respiración anaerobia: el aceptor final es un componente inorgánico distinto del oxigeno, Ej.: sulfato y
nitrato
3º) Fermentación: el aceptor final es un componente orgánico.Existen distintos tipos de fermentación:
• Alcohólica: producto final es el CH3−CH2−OH y CO2.
15
• Láctica: producto final es el acido láctico y el CO2 por contaminación de bacterias acéticas que pueden dar
lugar a acido acético.
• Propionica: CH3−CH2−COOH, CO2 y acido acético.
La fuente de obtención y utilización del oxigeno en los distintos microorganismo permite clasificarlos en los
siguientes grupos:
• Aerobios estrictos u obligados: deben utilizar el oxigeno como ultimo aceptor de electrón. Utiliza la
respiración aerobia en su metabolismo.
• Anaerobios estrictos u obligados: mueren o se inhiben ante la presencia utilizando la fermentación en su
matebolismo.
• Facultativas: pueden utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones o alternativamente sales como
son, NO3, carbonatos. Utiliza la respiración anaerobia.
• Microaeroficos: son inhibidos por una partícula de oxigeno que es igual que atmosférica, crecen o lo hacen
mejor con una concentración baja de oxigeno.
• Anaerobios aerotolerantes: no requieren oxigeno ni son inhibidos o destruidos por el, utilizan matebolismo
fermentativo.
TEMA 3.− CLASIFICACIÓN, TAXONOMÍA Y NOMENCLATURA BACTERIANA. BACTERIAS
MÁS COMUNES, BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO Y BACTERIAS ESPECIALES
1.− CLASIFICACIÓN, TAXONOMÍA Y NOMENCLATURA
Para clasificar las bacterias se hace colocándolas en distintos según sus características. Una bacteria pertenece
a:
a.− Cepa. En ellas se encuentran organismos dentro de la misma especie con una cualidad determinada. Son
organismos con la mayoría de sus características iguales.
b.− Serotipo o Serogrupo: Son organismos que difieren por la posesión de los mismos Ag siendo todos de la
misma especie.
c.− Especie: Son organismos que tienen características biológicas iguales para todos.
d.− Género: Son un grupo de especies estrechamente relacionadas.
e.− Familia: Grupos de géneros estrechamente relacionados.
En la clasificación podemos distinguir:
♦ Reino
♦ Filo
♦ Orden
♦ Clase
♦ Familia
♦ Tribu
♦ Género
♦ Especie
♦ Cepa
♦ Serotipo
Ejemplo: Neisseria gonorreae IV
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• Reino: Procariotas
• Filo: Bacteria
• Orden: Eubacteria
• Clase: Escotobacteria
• Familia: Neisseriaceae
• Género: Neisseria
• Especie: Gonorreae
• Cepa: IV
2.− BACTERIAS MÁS COMUNES
Cuadro de las fotocopias
3.− BACTERIAS DE LENTO CRECIMIENTO
Como vimos en la curva de crecimiento bacteriano, la mayoría de las bacterias crecen entre 18−24 horas,
aunque hay algunas bacterias que su periodo de crecimiento es superior. (> 7 días). Ejemplo: Brucella y
Micoplasma.
4.− BACTERIAS ESPECIALES
a.− Rickettsias
Son parásitos. Son cocobacilos pleomórficos, gram + que se presentan en cadenas o parejas y poseen pared
celular rígidas. Son parásitos intracelulares. La infección es transmitida por vectores.
Generalmente el parásito vive en las células intestinales y la saliva de donde se trasmiten al hombre por
picadura o agresiones en la piel.
b.− Clamidias
Son cocobacilos gram − con pared celular que se caracterizan por ser parásitos intracelulares. Es uno de los
microorganismos patógenos de mayor difusión dentro del reino animal, ya que utiliza como huésped desde el
hombre hasta artrópodos pasando por todos los animales peridomésticos.
En el género Clamidia hay muchas especies entre las que se destacan:
♦ Clamidia trachomatis (ETS)
♦ Clamidia neumoniae ( relacionado con enfermedades respiratorias)
♦ Clamidia psittachi (relacionada con enfermedades respiratorias)
c.− Micoplasma
Organismos procariotas gram − que carecen de pared celular, por lo que son muy pleimóficos y varían desde
coco a filamentoso.
Su hábitat es muy amplio y puede multiplicarse en plantas, insectos o mamíferos. Entre los aislados en el
hombre y productores de patología:
♦ Micoplasma neumoniae (infecciones respiratorias)
♦ Micoplasma hominis (ETS)
♦ Ureaplasma (ETS)
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TEMA 4.− RELACIÓN HUÉSPED−PARÁSITO
• Parásito: Organismo que vive en otro organismo llamado huésped y le causa un daño
• Infección: La infección es la situación en la cual un microorganismo se introduce en el huésped y se
desarrolla perjudicándolo o no. No es sinónimo de enfermedad puesto que una infección no siempre
se traduce en daño para el huésped, incluso si el patógeno es potencialmente virulento.
• Enfermedad: Resultado de la interacción entre agente patógeno y huésped causando como
consecuencia un daño en el huésped (modificación en el metabolismo celular, malestar, lesiones, etc.
Las enfermedades infecciosas se clasifican según la facilidad de transmisión de un individuo a otro
en:
a.− Enfermedades infecciosas contagiosas o transmisibles: se transmiten fácilmente por contacto directo o
indirecto (besos, tos, toallas, cepillos de dientes). Ej. SIDA, gonorrea, sarampión, lepra, etc.
b.− Enfermedades infecciosas no contagiosas: No se transmiten fácilmente por contacto sino por inoculación
directa. Ej. Tétanos.
• Virulencia: Capacidad de una cepa para producir enfermedad.
• Patogenicidad: Capacidad de un grupo de organismos para producir enfermedades; pueden existir
especies patógenas que tengan cepas virulentas.
La Epidemiología se encarga de estudiar las enfermedades infecciosas y los factores que determinan su
frecuencia y distribución en una población dada.
Desde el punto de vista etimológico:
• epi significa por encima o sobre
• demos significa pueblo
• logía significa tratado o ciencia.
En la Epidemiología es importante:
1º. Identificar el agente causal.
2º. Descubrir la fuente de infección.
3º. Buscar el mecanismo de infección.
4º. Buscar las características del huésped.
5º. Investigar la influencia del medio ambiente.
Para que se produzca las enfermedad infecciosa es indispensable que se cierre la cadena epidemiológica, la
cual está constituida por tres eslabones:
• Fuente de Infección: Pueden ser:
• Personas: pueden ser:
Persona enferma, es aquella que elimina los gérmenes durante un periodo característico de la enfermedad.
Persona portadora, es aquella que transmite la enfermedad pero no la padece. La persona está infectada pero
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no presenta manifestaciones clínicas. Hay dos tipos de portadores: temporales (1−2 meses) y crónicos (toda la
vida).
A veces lo gérmenes no se eliminan se quedan en sangre o tejidos del enfermo portador, serán, por tanto,
reservorios siempre que haya un vector que transmita el microorganismo (artrópodos picadores como
plasmodium, tripanosoma, leismonia,etc).
Cuando la fuente de infección es el hombre hablamos de infección homóloga, si es un animal infección
heteróloga.
• Animal: Tiene un doble papel ya que el animal puede actuar como fuente de infección y como vector.
• Mecanismo de Transmisión
Son los procedimientos que los agentes patógenos utilizan para su transmisión desde la fuente de infección
hasta la persona susceptible. Pueden ser:
• Directos:
♦ Por contacto físico o estrecha relación entre la persona sana y la fuente. Ej. contacto sexual,
piel.
♦ Por gotitas salivares: gotículas de Wells y de Pfluge. La diferencia entre unas y otras es el
tamaño. Ambas están en la boca u se transmiten por besos, estornudos, tos, el habla, etc.
♦ Manos sucias.
♦ Objetos recientemente contaminados, principalmente por contaminación salivar u
orofaríngea. (fomites)*
♦ Inoculación directa por transfusiones sanguíneas u jeringuillas (SIDA, hepatitis).
• Indirectos:
• Aire
• Agua contaminada
• Artrópodos (vectores)
• Fomites (objeto contaminado capaz de transmitir enfermedad como toallas, ropa, bolígrafos, etc.)
• Persona sana o susceptible de padecer enfermedad
La principal a destacar son las vías de entrad y de salida de los microorganismos como son:
• Aerea
• Digestiva
• Parenteral
• Cutánea
• Ocular
• Ótica
• Urogenital
• Anal
• Placentaria
2.− CLASIFICACIÓN DE LAS ENFERMAEDADES TRANSMISIBLES
DIGESTIVAS: El contagio se denomina DAME (dedos, alimentos, moscas y excretas)
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RESPIRATORIAS: Su via de transmisión más frecuente son las gotículas de Wells y las de Pluge (ej.
Paperas, sarampión, gripe)
ETS (sífilis)
ANIMALES (zoonosis) ej. Brucelosis, triquinosis.
3.− MEDICINA PREVENTIVA
La prevención se realiza a tres niveles:
• Fuente de infección.
• En el hombre, realizar un diagnostico precoz, tratamiento y aislamiento.
• En el portador, realizar control y aislamiento.
• En animales, realizar un diagnóstico, tratamiento y sacrificio.
• Mecanismo de Transmisión.
• Saneamiento ambiental.
• Desinfección.
• Lucha contra el vector.
• Persona sana.
• Vacunación.
• Prevención con quimoprofilaxis.
4.− EPIDEMIOGÉNESIS
Es el estudio de las epidemias y su desarrollo. Hay que saber:
• Endemia: Presencia habitual de una enfermedad en un área geográfica. El reservorio es generalmente
humano y el número de casos que casos que aparecen es aproximado al número teórico.
• Epidemia: Se produce cuando en un país o comunidad el número de casos de una enfermedad es el
esperado.
• Pandemia: Se produce cuando la epidemia afecta a varios países o continentes.
Comienzo y Desarrollo de la Epidemiología
La epidemiología se inicia al romperse el equilibrio entre el huésped y el germen debido a:
• Falta o disminución de inmunidad o resistencia de un grupo de población con respecto al germen.
• La llegada de un nuevo germen. (ej. Gérmenes que llevaron los conquistadores a América)
• Mutación del agente infeccioso; ocurre con frecuencia en virus de la gripe.
El desarrollo depende de:
• Número de población susceptible
• Conservación y virulencia del germen
• Factores sociales, ambientales y económicos
• Factores de agregación (colegios, internados)
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• Factores de dispersión (turismo, inmigración)
• Factores de saneamiento ambiental y hábitos higiénicos.
• Clima y meteorología que influyen en la supervivencia del germen.
Hay distintos tipos de epidemia:
Brote Holomiántico: Se produce a través de una fuente común transmitiendo la infección a un número de
personas en poco tiempo. Suele transmitirse por vía digestiva a través de agua y/o alimentos contaminados. Se
caracteriza por una fuerte subida y un descenso brusco afectando a mucha población. La epidemia se extingue
al suprimir la fuente de infección. Ej. Salmonelosis.
Brote Prosodémico: La propagaciópn es de persona a persona estableciéndose una cadena de casos que
aumenta gradualmente hasta alcanzar un máximo que perdura en el tiempo y luego empieza a declinar. Ej.
Gripe.
Brote Mixto: Se caracteriza porque presenta un comienzo holomiántico y continuación prosodémica o
viceversa.
5.− PODER PATÓGENO DE LOS MICROORGANISMOS
En la relación huésped− microorganismo existen diversos grados:
1º) Colonización: llegada, establecimiento y multiplicación del microorganismo sin que haya respuesta
inmune por parte del huésped.
2º) Infección inaparente: los microorganismos que han colonizado origina una respuesta en el organismo
inmunitario.
3º) Enfermedades infecciosas: cuando el microorganismo provoca daños en el huésped, la enfermedad
depende del nº de microorganismo, virulencia y resistencia que oponga el huésped.
E= N x V / R
Para saber la virulencia de un germen se recurre a:
1º) dosis mínima letal (DmL) que es la menor cantidad de microorganismo capaz de producir la muerte en la
dosis mínima letal, debemos señalar:
% El animal de experimentación.
% Vía entrada.
% proporción respecto al animal.
Ej.: conejo, por vía parenteral con 50 mg/Kg. de conejo.
2º) dosis letal 50 ( Dl 50): dosis mínima letal que mata el 50% de los animales de experimentación.
3º) dosis infectiva 50 (Di50) provoca la infección del 50% de los animales.
6.− FACTORES QUE DETERMINAN LA VIRULENCIA
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1º) Colonización
2º) Penetración
3º) Multiplicación
4º) Invasión por continuidad a través de vía linfática, nerviosa o sanguínea. Cuando el germen invade la vía
sanguínea hay que definir:
• bacteremia: paso ocasional de bacterias o virus de la sangre.
• septicemia: paso constante y masivo de la bacteria a la sangre.
• viremia: paso ocasional de virus a sangre.
5º) Toxinas: sustancia que proceden de las bacterias y causan lesión en el huésped.
Se denomina toxigenicidad: a la capacidad de producir enfermedad por la liberación de toxinas.
Las toxinas se clasifican:
• Exotoxinas: toxinas liberadas extracelularmente por las bacterias a medida que van creciendo. Las toxinas
se trasladan por el cuerpo y causan daños en regiones retiradas del lugar donde están creciendo las bacterias
que las produce.
Cada toxina tiene un tejido u órgano específico donde actúa o causa daño denominado tejido u órgano diana.
Se dirá que la toxina tiene tropismo (tendencia) Ej.: toxina del botulismo es neurotropa.
Son de naturaleza proteica, la producen las bacterias gram positivas y negativas. Son sensibles al calor y a los
rayos UV. Se deterioran a Tª ambiente y pierden su capacidad toxica a mas de 60º. Tiene un gran poder toxico
(el veneno biológico mas potente es la toxina de botulismo). Ej.: 1mg de la toxina mata 100 toneladas de
materia viva.
Las exotoxinas tienen un gran poder antigenico por lo que estimulan la formación de Ac.
Si se le aplica formol se convierten en Anatosoides: pierden su capacidad toxica pero no la antigénica, esto es
a base de las vacunas hechas a partir de exotosinas. Son altamente específicas frente a su actuación de su
órgano diana.
• Endotoxinas: de naturaleza liposacárida y provienen de la pared bacteriana gram negativa. Se liberan con
la lisis de la bacteria. la bacteria tiene poder toxico bajo, no forman anatoxoides por lo que no sirven para
vacunas. Provocan leucopenia, hipertermia, hipotensión, plaquetopenia, etc.
Origen
Composición
Toxicidad
Acción
Labilidad
Poder antigénico
EXOTOXINAS
Bacterias positivas y algunas
negativas. Se recogen del
sobrenadante del cultivo.
Proteica
Elevada
Especifica sobre tejidos diana
Termolábil es
Son muy antigénicos estimulando
formación de Ac
ENDOTOXINAS
Bacterias negativas. Salen de la
bacteria cuando se destruye
Liposacáridos
Baja
Inespecífica
Termoestables
Pocos antigénicos no inducen la
formación de Ac
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Se transforman en toxoides por lo
que sirven como vacunas
Acción de los sueros
Son efectivos
Estudio de las exotoxinas más importantes
Acción del formol
No se transforman en toxoides
No son efectivos
• Toxina Diftérica: producida por Corinebacterium difteriae. Es pantotropa (tendencia por todo el
organismo). Se unen a las células del huésped y a las pocas horas pierde su capacidad de síntesis
proteica y mueren.
• Toxina tetánica: producida por Clostridium tetanus. Es cardiotoxica y hemolítica. Lo más importante
es su acción espasmolizante al ser neurotropa y fijarse de forma irreversible a la sinapsis (conexiones
entre neuronas) neuronal.
• Toxina botulínica: producida por Clostridium botulium. Es neurotropa y provoca una parálisis dando
lugar a la muerte por asfixia debida a parada cardio respiratoria.
• Toxina de Clostridium perfinges: provoca gangrena gaseosa.
• Toxina del Estreptococos pyogenes: lo más importante es la estreptolisina que provoca hemólisis y
la toxina eritrogénica que es la responsable del eritema de la escarlatina.
• Toxina del Estafilococos aureus: actúa como enterotoxina.
• Toxina del Vibrio cholerae: produce el cólera.
• Toxinas enterotóxicas: toxinas de E.coli y Salmonella, producen deshidratación que puede llegar a la
muerte.
7.− TIPOS DE MICROORGANISMOS
1.− Patógenos: son exógenos al huésped colonizan, infectan y producen enfermedad. Su acción patogénica es
debida al número y virulencia.
2.− Oportunistas: suelen ser endógenos al huésped formando parte de la flora microbiana normal,
colonizando y en determinadas circunstancias provocando enfermedad, la cual es provocada por la
disminución de las defensas del huésped.
3.− Flora habitual (saprofita): Son microorganismos que colonizan al huésped y le producen incluso
beneficio comportándose como simbiótico y preservando la salud del huésped al :
• facilitar la absorción de vitaminas.
• Degradación de ácidos biliares.
• Realizar la interferencia microbiana que consiste en evitar la infección de verdaderos patógenos por
medio de bactericidas, alterar el pH o competir por el espacio con los verdaderos patógenos. Por tanto
ante un tratamiento antibiótico se debe elegir el que menos daña la flora habitual.
Flora normal, oportunista y patógena en el hombre
Las áreas del cuerpo se subdividen en dos categorías generales:
• Las que poseen normalmente microorganismos.
23
• Las que normalmente son estériles o que ocasionalmente albergan algunos microorganismos pero que
pueden ser altamente colonizados en caso de enfermedad.
La flora según aparatos es:
1º− Aparato Respiratorio
• áreas que normalmente albergan microorganismos:
• boca
• nariz
• garganta
• región nasofaríngea
• amígdalas
• senos paranasales
La localización del organismo es muy importante para saber si es patógeno o no. Pueden aparecer en algunas
personas sin ser patógenos.
• áreas normalmente estériles:
• bronquios
• bronquíolos
• alvéolos
• laringe
• traquea
Es posible su contaminación por distintos microorganismos ocasionales. Los distintos mecanismos de defensa
tenderán a eliminarlos rápidamente.
Tanto el exputo como algunos aspirados pueden estar contaminados por la flora de garganta, nariz y boca.
2º− Tracto gastrointestinal
• áreas que normalmente albergan microorganismos:
• intestino grueso
• ileon inferior
• áreas normalmente estériles aunque ocasionalmente pueden presentar microorganismos:
• esófago
• estómago
Aunque hay que tener en cuenta que debida al paso de alimentos pueden estar contaminados por bacterias
pero no sobreviven por los jugos del estómago.
El hígado y la vesícula biliar están normalmente exentas de contaminación microbiana. En estas zonas los
microorganismos son síntomas de enfermedades.
3º− Tracto genitourinario
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• áreas que normalmente albergan microorganismos:
• genitales externos
• uretra
• vagina
La microflora normal de la vagina dura hasta la menopausia siendo frecuente la presencia de bacilos de
Doderlein o más correctamente Lactobacilus acidofilus. En ocasiones las complicaciones de los abortos
prolongados pueden ser ocasionados por la microflora vaginal, de modo similar los recién nacidos pueden
tener enfermedades por la flora vaginal.
• áreas normalmente estériles:
• el riñón
4º− Tracto de la piel, oído y ojo
L a superficie externa del cuerpo esta poblada constantemente por microorganismos que reflejan las
costumbres del individuo, su dieta, clima, trabajo, etc.
5º− Sangre y LCR (líquido cefalorraquídeo)
Son generalmente estériles pero en muchas enfermedades infecciosas y durante las complicaciones infecciosa
de las enfermedades es frecuente encontrar microorganismos en sangre.
8.− CLASIFICACIÓN DE LOS AGENTES PRODUCTORES DE INFECCIÓN
De acuerdo con la clasificación etiológica se dividen en agentes productores de infección en:
1.− enfermedades por hongos.
2.− enfermedades por bacterias.
3.− enfermedades por virus.
4.− enfermedades por protozoos.
5.− enfermedades por helmintos.
6.− enfermedades por artrópodos.
7.− enfermedades por algas.
8.− enfermedades por priones.
Priones: son partículas infecciosas de pequeño tamaño y naturaleza no bien conocida. Se presentan como
partículas de naturaleza proteica en las que no se ha determinado ni ADN ni ARN aunque no se excluye que
tenga alguno. Se les considera los agentes productores de la enfermedad de Crentzfeld − Jacobs (C−J).
TEMA 5.− OBSERVACIÓN DE LOS GÉRMENES VIVOS: MOVILIDAD DE LOS ORGANISMOS.
TINCIONES
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1.− OBSERVACIÓN DE LOS GERMENES VIVOS
Para la investigación de algunas características biológicas de los microorganismos como son su morfología y
movilidad es necesario observar los gérmenes in vivo.
Para ello se debe partir de cultivos jóvenes ya que los microorganismos de los cultivos viejos pierden su
movilidad y gran parte de ellos están en regresión.
Estas técnicas son las siguientes:
a.− EXAMEN EN FRESCO
• Fundamento: Suspendiendo el microorganismo en un medio líquido transparente es posible observar
al M/O sus características morfológicas y su movilidad. Se utiliza para clasificar a los organismos en
los procesos de identificación en :
• móviles o inmóviles
• observación de estructuras espiriladas
• fase de reproducción
• Material: m.o., cubreobjetos, portaobjetos excavado, mechero, asa de siembra.
• Reactivos: vaselina sólida y microorganismos (Proteus vulgaris).
• Técnica: Para el examen en fresco existen dos métodos, son los siguientes:
1º− Método de la gota pendiente
• Técnica:
1º En el centro de un cubre limpio y desengrasado se coloca una gota de la suspensión de microorganismos
con un asa esterilizada.
2º Invertir sobre el cubre el porta excavado untando con vaselina alrededor del pocillo, colocándolo de forma
que la gota quede centrada en la depresión, la vaselina adhiere el cubre al porta de modo que se forma una
cámara que evita la evaporación de la gota.
3º Después dar rápidamente la vuelta a la preparación.
4º Observar al M/O con el objetivo de 40x.
2º− Método de la cámara húmeda
• Técnica:
1º Depositar en el centro de un porta limpio y desengrasado una gota de agua estéril.
2º Tomar con el asa una muestra del microorganismo y realizar una suspensión con la gota de agua.
3º Colocar sobre la suspensión un cubre evitando que queden burbujas de aire.
4º Observar al M/O con el objetivo de 40x.
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• Resultados e interpretación: La movilidad se manifiesta en un desplazamiento del microorganismo en
todas las direcciones del campo del M/O a diferencia del movimiento browniano de los gérmenes
presentes en la suspensión que no presentan movilidad, los cuales se desplazan en la misma dirección.
Este extremo se puede comprobar añadiendo un antiséptico a la preparación en caso de tratarse de
organismos móviles desaparecerá el movimiento observado.
• Observaciones al método: Es importante que el tamaño de la gota sea adecuado. Si es muy grande
provocaría en ambas técnicas el desplazamiento del cubre impidiendo la visión correcta de la
preparación, si es muy pequeña puede evaporarse en el interior de la cámara. En el método de la gota
pendiente si no se dispone de vaselina se puede humedecer los bordes de la excavación con solución
salina estéril o agua destilada.
b.− COLORACIÓN VITAL
• Fundamento: Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las técnicas de coloración después
de fijación.
Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales de los microorganismos que no es posible observar en
fresco sin causar modificaciones físicas o químicas incompatibles con el elemento examinado.
En general no se tiñen sino que se acumulan en ciertas partes del microorganismo. Se deben emplear
colorantes atóxicos a diluciones muy altas.
• Material: Portaobjetos, cubreobjetos, asa de siembra, mechero, papel de filtro y aceite de inmersión.
• Reactivos: Se emplean colorantes en disoluciones: 1/1000, 1/5000, 1/10000. Son: nigrosina, azul de
metileno, verde janus, verde malaquita.
• Técnica:
1º Colocar en el centro del porta una gota de la suspensión del microorganismo y otra del colorante.
2º Mezclar con el asa de siembra y colocar el cubreobjetos sobre la gota resultante (sin burbujas).
3º Observar al M/O con el objetivo de inmersión (100x).
2.− TIPOS DE COLORANTES
Los colorantes son sustancias capaces de dar color a otros cuerpos, pero para que sean efectivos deben tener
predilección por determinados organismos, es decir, deben ser selectivos.
Los colorantes se pueden dividir en:
a.− En función de su naturaleza estructural, pueden ser:
• Naturales (carmín y hematoxilina).
• Artificiales (anilinas), que proceden de la destilación de la hulla.
b.− Desde el punto de vista químico, pueden ser:
• Ácidos (citoplasma)
• Básicos (núcleo)
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• Neutros (cuando se asocian el colorante ácido y el básico. Los más conocidos son los eosicionatos de
tiacina que suelen designarse con el nombre del autor que inventa la mezcla)
• Indiferentes (son insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej. Sudán III)
En bacteriología, se usan principalmente los colorantes artificiales básicos. Algunos colorantes se depositan
sobre determinadas estructuras cuando han sido sometidas a la acción de un mordiente (fijador) que puede
actuar en solitario o junto con el colorante formando lo que se denomina como laca
(LACA=FIJADOR+COLORANTE).
3.− TÉCNICAS DE TINCIÓN
En la mayoría de las ocasiones para la observación de los microorganismos, éstos son teñidos ya que de esta
forma son más fáciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto características diferenciales. Las
tinciones se pueden clasificar es función de 2 características:
a.− Procedimiento de coloración: Se pueden dar:
• Técnicas de Inmersión: Permite teñir varias preparaciones a la vez. Se realizan introduciendo la
extensión en el/los recipientes que contienen colorante.
• Técnicas de Vertido: Son las más usadas. Se efectúan por decantación libre de colorantes y reactivos
distinguiéndose 2 tipos:
• Técnica en condiciones normales.
• Técnica en condiciones drásticas. Llamada Tinción de Emisión de Vapores. Se suele emplear para los
BAAR (Bacilos ácido alcohol resistentes).
♦ Materiales: El mismo utilizado en condiciones normales.
♦ Técnica: La extensión debe quedar cubierta por un trozo de papel de filtro del mismo tamaño
que el porta que se irá impregnando de forma intermitente con el colorante usado en la
tinción. La emisión de vapores se consigue calentando la parte inferior del porta con algodón
impregnado en alcohol etílico sostenido del extremo de una varilla de vidrio. No se debe
mantener la llama fija, pues se puede romper el porta. La extensión se somete a calentamiento
hasta que se emitan vapores. En ese momento se retira la llama hasta que deje de emitirlos y
se repite nuevamente el ciclo, así sucesivamente durante todo el tiempo que dure al titulación
(práctica).
♦ Observaciones: No se debe dejar secar el papel de filtro ya que si no se deterioraría la
extensión. Hay que ir añadiendo periódicamente el colorante. Algunos autores no usan papel
de filtro realizando la técnica por contacto directo del colorante sobre la extensión y posterior
calentamiento hasta la emisión de vapores. Se debe tener la precaución de añadir el colorante
repetidamente. Estas tinciones requieren calentamiento para que el colorante atraviese la
pared bacteriana como en las micobacterias.
b.− Según su aplicación
Técnica General de Tinción
1º.− Extensión.
Para obtener una película lo más homogénea posible de muestra.
Si la muestra el líquida, depositar una pequeña cantidad en el extremo del porta, extenderlo con el asa de
siembra hasta conseguir una capa fina y homogénea.
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Si la muestra es sólida, depositar una gota de suero fisiológico o agua destilada y suspender en ella una
pequeña cantidad de cultivo, hasta obtener una capa fina y homogénea.
2º.− Desecación.
Tiene como objeto eliminar el agua de la extensión para fijarla. Se deja secar a Tª ambiente o calentando
ligeramente alrededor de la llama, jamás directamente sobre ella.
3º.− Fijación.
Se consigue la muerte de los microorganismos por coagulación de las proteínas quedando la extensión
adherida al porta, para que resista las operaciones siguientes. Tiene por objeto mantener la composición
fco−qca. del microorganismos de forma que conserve definitivamente una estructura lo más parecida posible a
la inicial.
La fijación puede realizarse por:
• Solución fijadora (etanol, metanol), que se deja actuar durante varios minutos; se escurre y se deja
secar.
• Calor, poniendo la parte inferior del porta contra la llama del mechero repitiendo la operación.
4º.− Tinción.
Mediante la cual el microorganismo capta el colorante.
5º.− Lavado.
Mediante el cual eliminamos el exceso de colorante.
6º.− Secado.
Se mejora la visualización del microorganismo.
Hay distintos tipos:
• Tinción Simple
Son aquellas que solo utilizan un colorante y tienen como objetivo permitir la observación de la morfología
bacteriana. La tinción resultante puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior, lo que
significa una mayor afinidad de determinados componentes de la célula por el colorante. Los mas usados son:
verde malaquita, violeta de genciana
• Tinción diferencial o compuesta
Requieren más de un colorante y sirven para poner de manifiesto algún carácter propio de microorganismos.
Las principales tinciones son: tinción de Gram y tinción Ziehl−Nielsen.
TINCION DE GRAM
• Fundamento: divide a los microorganismos en gram positivas y gram negativas. Las gram positivas
son aquellas que resisten la acción de colorante del disolvente alcohol−acetona, tras el tratamiento con
un colorante básico y lugol, mientras que las gram negativas son decoloradas siendo posteriormente
29
teñidas con un colorante de contraste como puede ser la fusina diluida o safranina, este hecho se debe
a la diferente composición de la pared celular. Es conveniente realizar la tinción de gram sobre células
de cultivos jóvenes ya que algunos microorganismos son gram positivos solo en la fase de
crecimiento.
• Material: portaobjetos, mechero, asa de platino, pipeta, pinzas de madera, M.O. y equipos de tinción
(cristalizador, barras paralelas y frascos lavaderos).
• Reactivos: lugol, violeta de genciana, fusina diluida o safranina, alcohol−acetona, aceite de
inmersión.
• Técnica (ver fotocopia)
RESULTADOS
PASOS
Colorante básico
Mordiente
Decolorante
Colorante contraste
METODOS
Violeta genciana
Lugol
Alcohol / acetona
Suframina o fusina
Positivos Negativos
Violeta Violeta
Violeta Violeta
Violeta Se decolora
Violeta Rosa
• Resultados e Interpretación: Las bacterias gram positivas son de color violeta y las gram negativas de
coloración rosa.
TINCION DE ZIEHL−NIELSEN
• Fundamento: se utiliza para diferenciar BAAR es decir, aquellos microorganismos que resisten la
decoloración con una mezcla de ácido y alcohol.
Algunas bacterias poseen en su pared celular ciertos lípidos que le confieren la propiedad de resistir la
decoloración con ácido − alcohol.
Esta tinción requiere un calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana. Los
microorganismos que resisten la coloración son: micobacterias, actinomicetos y nocardia.
• Material: portaobjetos, asa de siembra, pipetas, pinzas de madera, mechero, M.O. y equipo de tinción.
• Reactivos: fusina, alcohol clorhídrico (97:3), azul de metileno, microorganismo uno BAAR y uno no
BAAR y aceite de inmersión.
• Técnica: (ver fotocopia).
• Resultados e interpretación: Los microorganismos BAAR adquieren color rojo y los no BAAR azul.
Tinción Auramina−Rodamina
• Fundamento: Tanto la Auramina como la Rodamina son dos fluorocromos que tiñen
microorganismos. En las micobacterias se fijan sobre los ácidos micolicos de la pared
diferenciándolas, por lo que en la investigación de estas bacterias es una técnica principal. Además se
aplica un colorante de contraste no fluorescente con el fin de ejercer un papel de campo oscuro.
• Materiales: portaobjetos, mechero, equipo de tinción, m/f.
• Reactivos: Auramina−rodamina.
• Técnica:
1º Extender, secar y fijar.
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2º Teñir con Auramina−Rodamina a temperatura ambiente (37ºC) durante 15 minutos.
3º Lavar con agua destilada.
4º Decolorar con alcohol clorhídrico durante 2−3 minutos y después lavar con agua destilada.
5º Contrastar durante 2−4 minutos con colorante de contraste, ya que tiempos mayores originan perdidas de
brillo. El contraste reduce la posibilidad de artefactos.
6º Lavar, secar y observar al m/f con objetivo de 40x.
• Resultado e interpretación: En los microorganismos se verán puntos amarillos−verdosos brillantes.
• Observaciones al método: Es una tinción equivalente a la de los B.A.A.R.
No obstante debe utilizarse una tinción B.A.A.R de Ziehl−Nielsen para confirmar su prueba.
Este método tiene la ventaja sobre el anterior de que no es necesario el calentamiento de la preparación.
Tinción ácido resistente de Kinyoun
• Fundamento: la observación de presencia o ausencia de B.A.A.R.
• Técnica:
1º Extensión.
2º Fijación en llama(preferiblemente).
3º Cubrir la muestra con solución de Kinyoun durante 3 minutos.
4º Lavar con aguas corriente durante 30 segundos.
5º Cubrir con solución de Gabett durante 1 minuto.
6º Lavar con agua corriente y secar.
7º Observar al m/o con objetivo de inmersión.
• Tinciones estructurales
Nos permiten ver distintas estructuras: flagelos, esporas, cápsula, corpúsculos metacromáticos, etc.
• Flagelos:
♦ Método de Rodees.
♦ Método de Triboadeau.
♦ Método de Leifson.
• Esporas:
♦ Método de Moeller.
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♦ Método de Wirlz−Conklin.
• Cápsula:
♦ Método de Hiss.
♦ Método de la tinta china.
• Corpúsculos metacromáticos:
♦ Método de Albert.
♦ Método de Loeffer.
Tinción de Wirlz−Conklin
• Técnica:
1º Extensión.
2º Desecación.
3º Fijación.
4º Teñir con verde malaquita a emisión de vapores durante 10 minutos.
5º Lavar con agua destilada arrastrando el papel de filtro (opcional).
6º Teñir con fusina diluida durante 3 minutos.
7º Lavar, secar y observar al m/o con el objetivo de inmersión.
• Resultados e interpretación: las esporas se observan de color verde, mientras que la forma vegetativa
se observa de color rojo.
TEMA 6.− MEDIOS DE CULTIVO I
1.− INTRODUCCIÓN
Para estudiar las reacciones metabólicas y fisiológicas de las bacterias es necesario cultivarlas en un medio de
cultivo que es una mezcla de sustancias que proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios
para su crecimiento y multiplicación.
El desarrollo de las bacterias en un medio de cultivo depende de una serie de factores:
1º.− Composición: los medios de cultivo deben incluir los elementos imprescindibles para la vida bacteriana:
• Fuente de N y C.
• Elementos minerales como: S, P, Mg, Ca, Fe, etc.
• Factores de crecimiento que por si solas no son capaces de sintetizar(aa, vitaminas, etc.).
• Factores estimulantes o de arranque. Ej: sangre.
2º.− pH: suele estar alrededor de la neutralidad, aunque hay algunos microorganismos que tienen un pH
específico diferente. Ej: bacterias acidofilas.
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3º.− Presión osmótica: los medios se preparan en condiciones de isotonia.
4º.− Potencial Redox: esta en relación con el tipo respiratorio de cada bacteria, que puede ser:
• aerobios estrictos u obligados.
• anaerobios estrictos u obligados.
• facultativos.
• microaerófilos.
• anaerobios aerotolerantes.
5º.− Hidratación: el agua es imprescindible para el crecimiento bacteriano por lo que estará en cantidad
suficiente en los medios de cultivo.
6º.− Temperatura: se incuba a la temperatura de interés médico (35−37ºC).
7º.− Atmósfera: algunas bacterias, especialmente algunas aerobias y facultativas necesitan la presencia de
ciertos ambientes gaseosos. El más usado es el CO2 en proporciones entre 3−10%.
2.− CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo se pueden clasificar:
1.− Según el fin al que están destinados:
• Medios generales: en los cuales se desarrollan una amplia variedad de microorganismos sin
condiciones nutritivas especiales. Ej: agar nutritivo o caldo nutritivo.
• Medios selectivos o inhibidores: inhiben por completo el crecimiento de bacterias distintas de las que
se quieren aislar y que existen en la muestra. La selectividad del medio se consigue con la adicción de
sustancias como sales biliares( inhiben las formas cocaceas gram +) o la ázida sódica( sólo permite el
crecimiento de las gram+). Los antibióticos son otras sustancias que transforman los medios de
cultivo en selectivos.
• Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de algún tipo de bacteria que se encuentra
minoritariamente en una mezcla de varias bacterias. Ej: caldo de selenito y tetrationato que se usan
para en aumento de Salmonellas que existen en el contenido intestinal.
• Medios de diferenciación: se usan para poner de manifiesto a las bacterias que dan positiva alguna
prueba bioquímica y que están presentes en la mezcla. Ej: bacterias glucosa + o glucosa−
• Medios de identificación: son aquellos que se utilizan para estudiar la acción de un solo tipo de
bacterias frente a un determinado sustrato. Se diferencian del anterior en que se siembran con
bacterias pertenecientes a un sólo clon. Se utiliza para la identificación de bacterias.
• Medios de multiplicación: son aquellos que poseen una composición determinada y óptima que
permiten el máximo aumento celular bacteriano en el mínimo tiempo. Son muy usados en la
preparación de vacunas y Acs.
• Medios de conservación: son aquellos cuya composición favorece el mantenimiento de los
microorganismos que en él se siembran y que posteriormente se incuban entre 2−4 ºC. Algunos
medios de conservación incluyen glicerol y se guardan en el congelador(−20ºC), estos medios han
sido desplazados por la liofilización.
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Existe una variación de los medios de conservación que son los medios de transporte cuya finalidad es
mantener el estado viable aunque sin reproducción(mínimamente) de los microorganismos presentes en la
muestra, permitiendo con posterioridad recuperar incluso a los que están minoritariamente presentes. Los más
utilizados son: de Stuart, Amies, Cary−Blair.
2.− Según su consistencia.
• Medios Líquidos: También llamados caldos. No llevan ninguna sustancia gelificante, se usa
principalmente para enriquecimiento o identificación. Su recipiente puede ser un frasco, una botella o
un tubo.
• Medios semisólidos: Contienen una proporción menor del 5% de agente gelificante.
• Medios sólidos: Se denominan agares. Contienen agentes gelificantes en proporciones considerables.
Los medios sólidos se pueden dividir en:
• Inicialmente líquidos: según su reversibilidad de estado hay 2 tipos:
♦ Reversibles: después de solidificar pueden volver a licuar. Tienen fácil conservación. Los
agentes gelificantes incorporados son agar, suero, etc.
♦ Irreversibles: no se pueden volver a licuar. Como sustancias solidificantes contienen huevo,
suero, etc.
• Inicialmente sólidos: en función de la naturaleza química del agente solidificante se distinguen 2
tipos:
• Orgánicos: como tubérculos.
• Inorgánicos: como silicatos.
Los medios sólidos pueden estar contenidos en frascos, botellas o tubos, pudiendo aparecer éstos:
• en horizontal: usado en siembra de picadura
• inclinado: se emplean en identificación, obtención de masa de microorganismos y almacenamiento
(colonias). Una variante es el pico de flauta.
También los medios sólidos suelen estar contenidos en placas, siendo las más utilizadas las placas de Petri.
3.− Según su consistencia.
• Medios naturales o empíricos: Están constituidos por componentes de origen animal o vegetal como
huevos, leche, patatas, etc. Actualmente está en desuso.
• Medios sintéticos: Son una solución de medios puros químicamente disueltos en agua destilada.
Poseen composición constante. Se utilizan para el crecimiento y metabolismo bacteriano.
• Medios semisintéticos: Contienen sustancias químicas de naturaleza y proporciones conocidas junto a
productos de origen natural. Son los medios más utilizados actualmente.
3.− PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
• FUNDAMENTO: La manipulación adecuada de determinados agentes nutritivos permite obtener una
fuente de alimentación y ambiente adecuado para que puedan crecer y desarrollarse los
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microorganismos en las condiciones idóneas.
• REACTIVOS: Ingredientes del medio de cultivo, NaOH (1%) y HCl (1%).
• MATERIALES: Vaso de precipitados de 250/500 cc., erlenmeyer de 250/500 cc., placa petri, pipetas
de 10 y 25 ml, papel indicador de pH, tubos de cultivo, autoclave, algodón graso, papel de aluminio y
balanza.
• TÉCNICA:
• Elección de los ingredientes: Sólo cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los elementos que los
componen. Este paso es poco frecuente debido a la comercialización de los medios.
• Pesada de cada uno de los ingredientes.
• Hidratación: El agua usada en la reconstitución debe ser destilada o desionizada y calentada a 50−60ºC. Se
coloca en un vaso de precipitado la mitad del agua a la que se le añaden los ingredientes o el medio de
cultivo homogenizando con una varilla agitadora y manteniendo la exposición al calor. Los medios líquidos
no necesitan llevar a ebullición en su preparación, mientras que los medios sólidos deben llevarse a
ebullición pues necesitan una Tª de 98−100ºC para disolverse. En la preparación del medio sólido se
recomienda que antes de iniciar el calentamiento se deje reposar el agua precalentada durante 5−10 minutos
para provocar un esponjamiento del agente gelificante que facilitará la disolución.
• Ajuste de pH: Se hace imprescindible cuando se parte de ingredientes por separado. Se mide el pH y si este
no es el adecuado se ajusta con las disoluciones de NaOH y HCl.
• Distribución: Para la esterilización se distribuirá el medio de cultivo en recipientes que permitan un buen
proceso de esterilización y procurar que los recipientes sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se
plantean dos posibilidades:
• Medios en tubo: con una pipeta de boca ancha o un dosificador se depositan en cada tubo la cantidad
de medio de cultivo correspondiente a 10−20 cc., según la capacidad del tubo. Se tapa con una
torunda de algodón graso que se cubre a su vez con papel de aluminio y se lleva a esterilizar. También
se puede utilizar tubos con tapón de rosca. Con ello se consigue esterilizar recipiente y medio de
cultivo por lo que éste estará dispuesto para ser sembrado y almacenado hasta su uso, ya que los tubos
constituyen el recipiente definitivo.
• Medios en placa: Se vierte el medio en un erlenmeyer no debe ocupar más de 2/3 de la capacidad total
pues la ebullición en el autoclave haría que el medio rebasase. Antes de esterilizar se tapa con algodón
graso y aluminio.
• Esterilización: Se realiza a 121ºC durante 15 minutos. Para volúmenes mayores de 250cc. se aumenta
el tiempo.
• Vertido en placa: Tras la esterilización se homogeniza moviendo en sentido rotatorio. El vertido en
placa se debe realizar cuando la Tª sea próxima a la gelificación 45−55ºC (puede mantener la mano
sobre el recipiente).Con ello se evita la excesiva formación de agua de condensación en la tapa de las
placas. Para el llenado se usan pipetas estériles de boca ancha o un dosificador estéril, siendo este más
adecuado para evitar la obstrucción del agar. Las placas estériles por lo que la técnica de vertido debe
realizarse en condiciones de esterilidad. El volumen de muestra que debe depositarse en la placa será
según el espesor de la capa deseada y las dimensiones de la misma ( de 2.5−3 mm, un poco más de la
mitad de la placa).
• Enfriamiento:
♦ Medios líquidos: Tal como se extraen del autoclave se dejan enfriar.
♦ Medios sólidos: Dependerá de donde se encuentre el medio, así
−Tubos: enfriar a Tª ambiente en posición vertical (para conseguir agar horizontal) u oblicuo (para
conseguir agar inclinado).
− Placas: tras el vertido debe asegurarse que no existen burbujas ejerciendo movimientos rotatorios
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(las burbujas se quitan con el asa esterilizada).
♦ OBSERVACIONES AL MÉTODO: Si no se dispone de autoclave se pueden esterilizar los
medios en baño maría hirviente o en olla a presión durante 30 min. repitiendo la operación
durante 3 días consecutivos.
Los ingredientes o medios deshidratados se protegerán de la humedad, la luz y el calor. Los
recipientes deben ser de plástico o vidrio opaco y cierre hermético. No deben abrirse en ambientes
húmedos y deben desecharse cuando se apelmacen. Se controlará periódicamente su fecha de
caducidad. Los medios hidratados y esterilizados tienen un tiempo limitado de conservación, en
general pueden conservarse 4−6 semanas en condiciones adecuadas. El problema más frecuente es la
deshidratación, se tendrá en cuenta las siguientes recomendaciones:
♦ almacenar en nevera a 4ºC, también a Tamb. aunque su duración es más limitada.
♦ no deben guardarse a T menor de 0ºC (T de congelación) pues altera la estructura del gel.
♦ protegerlos de la luz, para ello envolver el recipiente en papel de aluminio
♦ los tubos con cierre hermético son más recomendables que las torundas de algodón
♦ los medios para verter en placa se conservan mejor en el frasco original aunque pueden
quedarse en ellos teniendo en cuenta:
se deben refrigerar inmediatamente después de su solidificación
se protegerán frente a desecación precintando con cinta adhesiva su borde lateral o envolviendo varias
en bolsa de plástico
se recomienda mantener en posición invertida para evitar que se caiga sobre el medio el agua de
condensación
Los medios conservados en refrigerador deben ser atemperados antes de su empleo con estufas de
cultivo o a T ambiente. No utilizar nunca medios con excesiva deshidratación, la cual se manifiesta:
♦ en medios líquidos, por aumento de concentración o disminución de volumen
♦ en medios sólidos, por disminución de espesor, agrietamiento, retracción, cambio de color,
etc.
Algunos medios son conservados en estado sólido en el recipiente original y luego son refundidos
para su distribución.
Las precauciones a tener en cuenta son:
♦ no deben realizarse con medios ácidos, ya que se alteran sus características (el agar se
hidroliza al calentarse en medios ácidos)
♦ si se mantienen fundidos periodos de tiempo mayores de 60 minutos, la calidad del medio
disminuye considerablemente
♦ es aconsejable refundir al baño maría o autoclave durante 30 minutos, nunca aplicar calor
directamente
4.− ELIMINACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Cualquier medio de cultivo sobre todo si ha sido sembrado, es un posible foco de contaminación
debiendo eliminarlo tras su utilización.
Los medios de cultivo se pueden descontaminar:
1.− Inundación en solución desinfectante: Se cubre la superficie con esta solución y se deja unas 12
horas. Se utiliza cuando no hay autoclave.
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2.− Esterilización en autoclave
3.− Incineración: se utiliza para microorganismos muy patógenos.
Solo después de la descontaminación del medio de cultivo se procederá a la limpieza de sus
recipientes (cuando éstos son recuperables).
5.− CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
El 4% de los medios de cultivo de los lotes se controlan en estufas durante 5−7 días a una temperatura
de 37ºC, durante este tiempo debe verificarse el color del medio preparado así como la gelificación,
los precipitados atípicos, etc. en el caso de advertir variaciones atípicas se desechan los lotes.
Con los medios de cultivo se deben establecer tres tipos de controles antes de considerarlos aptos:
1º.− Control de esterilidad (explicado anteriormente).
2º.− Control de calidad, se realiza para comprobar que el medio contiene aquellos componentes que
le caracterizan. Para su comprobación se utilizan por lo menos dos gérmenes distintos:
♦ uno que crece en ese medio o da + una determinada prueba.
♦ Otro que no crece en ese medio o da − la prueba.
3º.− Control de caducidad, para ponerlo en práctica es necesario que en el momento de emplaque se
rotule en un lugar de la placa además del medio, la fecha de preparación.
TEMA 7.− CULTIVO DE BACTERIAS II (SIEMBRA)
1.− Introducción
Dado que la manipulación de muestras en microbiología entraña riesgos, recordamos las siguientes
instrucciones:
♦ Todo material debe ser estéril.
♦ La manipulación en radio de 10−15 cm. (zona aséptica) alrededor de campana o zona de
flujo.
♦ Se procurará disponer de todo el material al alcance de la mano para evitar desplazamientos.
♦ Es necesario adquirir rapidez y automatismo indispensable para una buena ejecución de las
técnicas.
2.− Manipulación del material
♦ Asa de hilo, platino o micro:
1º Esterilizar antes y después de su uso, para lo cual se coloca perpendicular a la llama hasta que
alcance el rojo vivo en toda su longitud. Para evitar salpicaduras el instrumento se introduce
gradualmente en la llama.
2º Cuando se quiere meter en recipiente de boca estrecha se debe flamear la parte del mango que
quede dentro del recipiente durante su manipulación.
3º Tras la esterilización se enfriará unos segundos en la fuente aséptica, pues si contacta con la zona
del microorganismo (colonia, medio líquido, etc.)esterilizaremos la muestra recogida.
♦ Pipetas: Con pipetas de seguridad (tienen filtro de algodón en su boquilla) o con prepipetas se
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flameará previamente la punta y en toda su longitud que contacte con el recipiente de la
muestra. La pipeta se manejara con la punta dirigida hacia abajo, manteniéndola vertical u
oblicua pero nunca horizontal.
♦ Recipientes de vidrio: Siempre que contenga algún producto en su interior (m.c.) deben estar
tapados con torundas de algodón así:
♦ No se abrirán en posición vertical.
♦ Su apertura se realizara oblicuamente dirigiendo su apertura sobre la llama.
♦ El algodón se coge con el dedo meñique de la mano opuesta, evitando el contacto mientras se
manipula el contenido del medio.
♦ La boca se flameara al abrir y al cerrar, la cual se expone en la llama unos segundos con
movimientos rotativos.
♦ Placas de Petri: Se manipularan semiabiertas con la abertura orientada a la llama del mechero.
3.− MANUPILACION DE MUESTRAS
1º) Medio líquido:
♦ Con asa de platino o Nicron:
♦ destapar el tubo
♦ flamear la boca del tubo
♦ introducir el asa estéril y sumerguirlo
♦ extraer el asa
La muestra queda formando una película circular en la luz del asa, solo se puede conocer el volumen
de la muestra utilizando asas calibradas.
♦ Con pipeta estéril: se debe tener la precaución de mantener limpia la parte exterior de la
pipeta por lo que se dejara gotear él liquido adherido a las paredes sobre el recipiente antes de
taparlo.
2º) Medios sólidos:
♦ destapar el tubo o flamear el tubo
♦ contactar suavemente el asa o el hilo estéril con alguna colonia visible
♦ flamear la boca del tubo o cerrar la placa
4.− PREPARACION DEL INOCULO ESTANDARIZADO (práctica)
Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas y para técnicas en las que se pretende el
aislamiento del germen o la realización de un análisis cuantitativo, es necesario preparar él inoculo de
siembra para obtener resultados fiables.
Técnica general de preparación de inoculos:
Se obtiene a partir de un cultivo joven (fase exponencial de crecimiento) y puro o de un producto
patológico.
Se toma con un asa estéril colonias de un cultivo o una porción de una muestra biológica y se diluye
en 5 cm cúbicos de una solución diluyente, la cual se homogeneiza. Como diluyente podemos utilizar
caldo nutritivo, solución salina o agua destilada estéril.
Técnica de KYRBY − BAUER:
Utiliza escalas con gradiente de turbidez, cada tubo de la escala va numerada y sirve de referencia
según el nº de microorganismos que se quieran. Él inoculo se puede ajustar al patrón de referencia
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mediante:
♦ comparación visual aproximada (turbidez)
♦ espectrofotometría
Una escala universalmente aceptada es la escala de Mc FARLAN, constituida por una serie de tubos
en los que se origina un precipitado blanco de BaSO4 por acción de H2SO4 con BaCl2.
Cada tubo se lee en el espectrofotómetro y se obtiene una absorbancia de cada uno. Se representa
Absorbancia frente a concentración y se obtiene una recta en la que se interpolan las absorbancias de
las muestras problema pudiendo conocer la concentración de éstas, así se estandariza la muestra
problema.
5.− SIEMBRAS
Existen diferentes técnicas y éstas se clasifican según el modo de efectuarse:
1.− Por inoculación.
Se puede llevar a cabo en medio liquido o medio sólido.
• Medio liquido:
♦ Con asa: sumergir el asa cargada y agitar.
♦ Con pipeta: verter el contenido de la pipeta sobre el m.c. y se homogeneiza.
♦ Con escobillon: se realiza de igual modo que con el asa de siembra.
• Medio sólido:
♦ En placa : Hay dos técnicas: técnica de Barry y la técnica de Kirby Bauer.
Técnica de Barry: Es una inoculación previa al vertido en placa, se siguen los siguientes pasos:
1º) se toma 0,1 cm cubico de inoculo y se añaden a 25 cm cúbicos de m.c. fundido (40−50º).
2º) homogeneizar.
3º) verter en la placa de petri.
Una modificación de esta técnica consiste en verter él inoculo directamente en la placa y
seguidamente se agrega en m.c. y dando movimientos de rotación para así mezclar. Esta técnica se
utiliza para el recuento de viables y antibiogramas.
Técnica de Kyrby Bauer: Es la inoculación sobre la superficie del medio solidificado, se siguen los
siguientes pasos:
1º) preparado él inoculo en tubo estéril se introduce un escobillon también estéril hasta quedar
impregnado.
2º) se elimina el exceso de inoculo presionando el escobillon con movimientos de rotación contra las
paredes del tubo.
3º) se siembra la placa empleando la técnica de los tres giros, pasando el escobillon por toda la placa 2
o 3 veces antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente él inoculo.
4º) se deja secar la placa 3−4 min. En posición semi abierta e invertida quedando lista para utilizar.
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Esta técnica se emplea para el estudio de sensibilidad o inoculación directa de productos patológicos.
♦ En tubo: Existen dos técnicas: siembra en estrías y siembra en picadura.
Siembra en estrías: En superficie inclinada, se siguen los siguientes pasos:
1º) se toma la muestra con el asa.
2º) se introduce en el tubo que contiene el medio.
3º) desde el fondo de la superficie y en progresión ascendente, deslizar el asa con movimientos de
zig−zag.
Esta técnica se utiliza para obtener colonias, renovar cepas (resembrar) y pruebas biológicas.
Siembra en picadura: Se siguen los siguientes pasos:
1º) se toma la muestra con la punta del hilo.
2º) se punciona en el centro del m.c. introduciendo la punta del hilo hasta 2−3 mm del fondo del tubo.
3º) se extrae el hilo por la misma línea que se introdujo.
4º) si se trata del medio inclinado (pico de flauta) se puede realizar una siembra en estrías con el
mismo hilo por la superficie del medio.
Esta técnica se emplea para pruebas de identificación, movilidad, pruebas bioquímicas, hidrólisis de
principios inmediatos etc.
2.− Por aislamiento
Se realizan en placa y hay dos tipos:
♦ Por dilución:
1º Disponer de tres tubos fundidos a 30−50 ºC previamente marcados con los números 1, 2 y 3.
2º Tomar con el asa estéril la muestra y sembrar en el tubo 1.
3º Homogeneizar el tubo 1 por dilación (entre las palmas de las manos) y tomar un asa del mismo
tubo, resembrando al tubo 2 dejando el tubo 1 al baño maría a 45ºC.
4º Homogeneizar el tubo 2, tomar una muestra y pasarla el número 3 dejando el tubo 2 en el baño
maría a 45ºC.
5º verter el contenido de cada uno de los tubos homogeneizados de nuevo en tres placas marcadas con
los números 1, 2 y 3, esperar que solidifique el medio.
6º En la placa número 3 se obtendrán colonias aisladas.
♦ Por agotamiento: Hay cuatro modos:
♦ Siembra en estrías o zig−zag
1º Se deposita el inoculo en el extremo superior de la polaca.
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2º Se siembra con el asa a partir del inoculo con un movimiento de zig−zag cada vez más amplio (en
la línea media de la placa alcanza su máxima amplitud), para ello el asa debe contactar suavemente
con la superficie del medio (no se debe presionar demasiado pues se agrietaría).
3º La siembra se efectuará hasta la zona distal del comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.
♦ Siembra en estrías múltiples
1º Se deposita el inoculo en el extremo de la placa.
2º Con el asa se reparten en varios tramos siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo se debe
flamear el asa.
3º Los segmentos seguidos definen un poliedro regular. El último tramo se efectuará hacia el interior,
donde se obtendrán las colonias aisladas.
♦ Siembra en los cuatro cuadrantes
1º Se divide la placa en cuatro cuadrantes (se puede rotular con rotulador de vidrio en la parte
superior).
2º Se deposita el inoculo en la parte superior de uno de los cuadrantes y se siembra por estrías.
3º Sin flamear el asa se repite la operación en los tres cuadrantes, en cada uno de ellos se siembra el
inoculo adherido al cuadrante anterior. Tenemos colonias aisladas en el cuarto cuadrante.
♦ Siembra en tres giros
1º Se siembra en estría la mitad de la placa.
2º Flamear el asa.
3º Se gira la placa 90º, sembrando en estría la mitad superior de la misma.
4º Se repiten los pasos 2º y 3º.
5º Las colonias aisladas aparecen en la zona sembrada en último lugar.
6.− ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS COLONIAS
El estudio morfológico se hace tanto macro como microscópicamente.
1.− Estudio macroscópico
Cuando una bacteria se cultiva en medio sólido se desarrolla una colonia. La morfología de dicha
colonia y su entorno en relación con el medio donde se desarrolla es un dato orientativo y puede servir
para identificar al microorganismo.
El aspecto de la colonia puede recordar algún objeto denominándose de la misma forma.
Hay que tener en cuenta que una bacteria puede dar colonias distintas en función del medio (ejemplo:
salmonella en agar makonki da colonias distintas que en agar SS). El estudio de la morfología de
colonias es solo orientativo, puesto que en determinados medios especies distintas pueden dar
colonias similares.
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Las colonias aisladas en placa se pueden clasificar atendiendo a:
♦ Forma: puntiforme, circular, filamentosa, ameboide, rizoide y fusiforme.
♦ Elevación: plana, convexa y umbonada.
♦ Borde: entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso y enrollado.
♦ Superficie: lisa, rugosa, brillante y mete.
♦ Color: relacionado con el medio de cultivo y el metabolismo del microorganismo.
♦ Consistencia: para determinarla es necesario tocar la colonia con el asa (mantecosa, grumosa)
Las colonias aisladas en agar inclinado pueden ser: filiformes, equinuladas, perladas, difusas,
arborescentes y rizoides.
♦ Entorno colonial: Las modificaciones del entorno colonial más significativas son las
hemólisis producidas en agar sangre (presencia de una zona de eritrocitos lisados alrededor de
una colonia). Es un dato que resulta útil en la identificación inicial de ciertas bacterias, sobre
todo Estreptococos. Pueden existir tres tipos de hemólisis:
◊ Hemólisis : La colonia está rodeada de una zona de eritrocitos parcialmente lisados
frecuentemente acompañada de color marrón−verdoso o pardusco.
◊ Hemólisis : Las colonias están rodeadas de una zona clara del color del medio base
lo que indica lisis completa de eritrocitos.
◊ Hemólisis : no se observa hemólisis aparente.
♦ Olor: Es otra característica que facilita la identificación del entorno colonial (aunque son muy
subjetivos)
BACTERIAS
MEDIOS DE CULTIVO
OLOR
Pseudomonas
MK
Jabón
E.Coli
MK
Levadura de cerveza o pan
Proteus
MK
Fétido
Salmonella
Agar SS
Semen
2.− Estudio Microscópico
Está relacionado con el tamaño, forma y agrupación de las bacterias (visto en tema 2)
TEMA 8.− RECUENTO DE MICROORGANISMOS
1.− Introducción
El recuento de microorganismos es la determinación del número de microorganismos presentes en
una muestra. Frecuentemente es conveniente su determinación pero además de la dificultad que
presentan los resultados no permiten excesiva fiabilidad.
2.− Clasificación de las técnicas
1.− METODOS INDIRECTOS: Son aquellos en los que no se encuentran el número de
microorganismo sino que se calcula a partir de otros parámetros. Los dividiremos en 3 grupos:
a.− Determinación analítica de moléculas: pertenecientes al microorganismo. Por ejemplo: proteínas,
ADN
b.− Métodos Gravimétricos: basados en la determinación del peso seco.
c.− Métodos Turbidimétricos: son los más utilizados.
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2.− METODOS DIRECTOS: En ellos a cada uno se considera una unidad. Hay 3 tipos:
a.− Métodos directos totales: determinación del número de microorganismos vivos y muertos. Son
métodos microscópicos y entre ellos destacamos:
♦ método de Breed o recuento de extensiones teñidas,
♦ método de Wright
♦ método de recuento en cámara.
b.− Directos culturales: contabilizan únicamente los microorganismos vivos, el mas utilizado:
recuento de viables en placa.
c.− Semidirectos totales: por medio de contadores electrónicos de partículas.
Los más rápidos son los turbidimétricos y semidirectos. Su inconveniente es que requiere un aparataje
sofisticado y no distingue entre microorganismos vivos y muertos.
3.− RECUENTO EN CAMARA
(apuntes Isabel López, 1º lab.)
4.− MÉTODO DE EXTENSIONES TEÑIDAS
♦ Fundamento: Se basa en contar los microorganismos de un volumen determinado de
suspensión de los mismos tras la extensión y tinción de ésta. El método a desarrollar es el de
Breed.
♦ Material: Portas, mechero, pipeta de 10 l, equipo de tinción, estufa y microscopio.
♦ Reactivos: Azul de metileno y suspensión de microorganismos.
♦ Técnica:
♦ Marcar un porta un cuadrado de 1cm de lado con ayuda de papel milimetrado.
♦ Invertir el porta y depositar en el cuadrado 10 l de la suspensión.
♦ Dejar secar al aire o en estufa.
♦ Fijar a la llama.
♦ Teñir con azul de metileno 3 minutos.
♦ Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
♦ Contar los microorganismos existentes en 25 campos distintos situados en la diagonal.
◊ Resultados e Interpretación: Para el cálculo del microorganismo se tiene en cuenta:
A= Área del cuadrado marcado (100mm2)
C= Volumen de suspensión utilizada (10 l)
R= Radio del campo del microscopio (mm)
S= Superficie del campo del microscopio (r2)
V= Volumen de suspensión del microorganismo contada en 25 campos (l)
N= Número total de microorganismos contados en 25 campos
A __________ C
S.25 ________ V ! V = CS25/A = 10 r2 25 / 100 = 2.5 r2
43
V ___________ N
S.25 ________ X ! X= N / V = nº microorganismos / l
◊ Observaciones al método: La suspensión de microorganismos debe ser homogénea
por todo el cuadrado, si no se desecha la preparación. En lugar de azul de metileno se
puede utilizar cualquier colorante de la tinción simple (nigrosina, sudan IV, etc.)
5.− Recuento de viables en placa
◊ Fundamento: basado en que un microorganismo da lugar en un medio de cultivo a
una colonia visible, por tanto el número de colonias contadas será igual al número de
microorganismos existentes inicialmente.
◊ Material: pipeta de 1 ml, tubo de ensayo y placa de petri.
◊ Reactivos: solución salina estéril, medio de cultivo para el microorganismo y
suspensión del microorganismo.
◊ Técnica:
1.− Tomar 1ml de la solución problema, homogeneizarla y añadirlo a 9 ml de solución salina
estéril (suspensión 1/10).
2.− Homogeneizar.
3.−Tomar 1ml y pasarlo a otro tubo con 9ml de solución salina estéril (suspensión 1/100).
4.− Repetir la operación.
5.− De cada dilución se siembran un mínimo de tres placas estériles. Depositar en cada una
1ml del inóculo correspondiente y agregar 10ml de medio de cultivo, imprimiendo un
movimiento de rotación con el fin de homogeneizar la muestra.
6.− Dejar solidificar e incubar a una temperatura adecuada según el tipo de microorganismo.
7.− Contar las placas cuyo número de colonias este entre 30−300.
◊ Resultado e interpretación: En primer lugar se calcula la media aritmética de las
colonias contadas en las placas seleccionadas, esta se multiplica por la inversa de la
dilución a la que se ha efectuado el recuento, con lo que se obtendrá el número de
microorganismos viables por ml de muestra.
◊ Observaciones al método: El error más habitual radica en que una colonia se forma a
partir de más de un microorganismo. No obstante tiene ventajas frente a los
anteriores, no cuentan los microorganismos muertos o partículas contaminantes
indistinguibles de los microorganismos en los recuentos microscópicos.
Si se dispone de material suficiente se preparan 10 placas, de este modo los resultados
estadísticos son más representativos.
Hay que homogeneizar la muestra perfectamente.
El medio y las condiciones de cultivo deben ser las idóneas para el microorganismo
estudiado.
Una alternativa empleada para el recuento de viables consiste en utilizar un asa calibrada con
la que se siembra en placa.
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TEMA 9.− DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN
1.− Conceptos básicos
◊ Asepsia: ausencia de microorganismos conseguida por métodos físicos.
◊ Antisepsia: ausencia de microorganismos conseguida por métodos químicos.
◊ Desinfección: técnica de saneamiento encaminada a eliminar elementos patógenos.
◊ Esterilización: técnica de saneamiento encaminada a eliminar cualquier forma de
vida patógena, no patógena o formas de resistencia como esporas.
◊ Desinfectante: sustancia antimicrobiana que no puede aplicarse sobre superficies
vivas.
◊ Bactericida: sustancia que destruye a las bacterias.
◊ Bacteriostático: sustancia que impide el crecimiento y multiplicación de las
bacterias.
Desinfectante
Se utiliza para destruir las formas de vida patógenas, el ideal es el que más se aproxime al
concepto de esterilización, pero están muy lejos de conseguirlo. Según el microorganismo
sobre el que actúe se denomina:
◊ Bactericida, si destruye bacterias.
◊ Viricida, si destruye virus.
◊ Funguicida, si destruye hongos.
Normalmente los desinfectantes son bactericidas y los antisépticos son bacteriostáticos.
Hay que tener en cuenta que muchos desinfectantes cuando se utilizan de forma errónea
pueden estimular el desarrollo de los organismos al seleccionarse las cepas más resistentes
que son las más virulentas.
Esterilización
Un objeto puede estar desinfectado pero no esterilizado, mientras que el objeto esterilizado
esta desinfectado también.
Experimentalmente se comprueba que la esterilización no destruye el 100% de los
microorganismos. Sólo se conseguirá la asepsia con temperaturas y tiempos muy elevados
(que son inoperantes).
Para que el método de esterilización sea útil debe destruir el 99,99% de los microorganismos.
Antes de desinfectar o esterilizar hay que limpiar bien el material de restos de materia
orgánica ya que estos dificultan dicho proceso.
Vamos a aclarar dos conceptos:
♦ Material estéril: Es aquel objeto que tras ser esterilizado sigue manteniendo esta propiedad en
el tiempo a la hora de ser utilizado, pues se le han aplicado medidas para ser estéril.
♦ Material esterilizado: Ha sido esterilizado y en el momento de usarlo ya no se conserva la
esterilidad, ya que no se le han aplicado las medidas para conservarlo.
2.− MÉTODOS DE DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN
45
1.− MÉTODOS FÍSICOS
a.− Métodos Térmicos
Factores que influyen en la muerte de microorganismos por calor
1.− Número de microorganismos: Al aumentar en número de microorganismos aumentará la
intensidad del tratamiento aumentando la temperatura o el tiempo.
2.− Naturaleza del microorganismo: Las formas vegetativas son más sensibles que las
esporas.
3.− Temperatura: Al aumentar la temperatura hasta cierto límite aumenta la efectividad y
rapidez.
4.− Tiempo de actuación: Generalmente el tiempo de actuación se relaciona con la
temperatura, jugando con ambos. Si se aumenta la temperatura disminuye el tiempo y si
disminuye el tiempo se aumenta la temperatura, es decir, con frecuencia estas dos variables se
comportan de forma inversa.
5.− Tiempo de duración: Hay que tener en cuenta la suma de:
◊ Tiempo de penetración: Tiempo necesario para que el material adquiera la
temperatura de esterilización.
◊ Tiempo de calefacción: Tiempo requerido para que dicha temperatura destruya la
población microbiana.
◊ Tiempo de seguridad: Se asigna de forma arbritaria.
Los sistemas enzimáticos de las bacterias tienen una temperatura óptima para actuar, pero por
encima y por debajo de dicha temperatura también siguen viviendo, son las temperaturas
máximas y mínimas. Por ejemplo en E.Coli el intervalo de temperatura oscila entre 8º−47ºC y
en N.Gonorreae 30º−40ºC. Según esto, los intervalos de temperatura pueden ser grandes o
pequeños en función de los microorganismos.
Se pueden distinguir:
◊ Bacterias psicrófilas: Intervalo de temperatura oscila entre 0º−30ºC. Ejemplo:
Pseudomonas.
◊ Bacterias mesófilas: Intervalo de temperatura oscila entre 20º−45ºC. Son las más
numerosas y patógenas. Incluyen:
• 20º−24ºC: gérmenes saprofitos y parásitos de plantas superiores.
• 35º−45ºC: gérmenes saprofitos y parásitos del hombre y animales
superiores.
◊ Bacterias termófilas: Temperatura óptima está por encima de los 45ºC. Habitan en
suelo y aguas termales.
El frío no mata a los microorganismos sino q impide su reproducción.
Se dan 2 tipos de métodos térmicos:
◊ CALOR HUMEDO: Puede ser a través de H20 o vapor.
H2O
◊ Ebullición: en el lab. Se utiliza poco no es muy fiable en el sentido estricto, no es un
46
método de esterilidad ya que no destruye a las esporas. Consiste en introducir el
material en H2O húmeda durante unos 10 minutos.
◊ Pasteurización: no mata las formas de resistencia, es muy útil en tecnología de
alimentos. Ej: leche. Podemos distinguir 2 tipos de pasteurización:
◊ pasteurización alta: se consigue con Tª de 72−75 º durante 15 minutos.
◊ Pasteurización baja: se consigue con Tª de 63º durante 30 minutos.
◊ Tindalizacion: es un método de esterilizaciones sucesivas, se utiliza en microbiología
cuando existen problemas de contaminación en el autoclave. Consiste en
esterilizaciones repetidas a lo largo de 3 o 4 días. Teóricamente no se deben alcanzar
Tª superiores a 100º y durante este intervalo no se debe abrir el aparato que se somete
a la tindalizacion. El objetivo es destruir esporas cuando germinan, así como evitar
contaminación con microorganismos resistentes. La tindalizacion se lleva a cabo a
65º durante 30 minutos cada día, durante 4 días. El resto del tiempo se mantiene a
30−35º.
◊ Uperizacion: es muy útil en industrias alimentarias, se realiza a una Tº aproximada de
150º durante 1−5 segundos. No se alteran las propiedades organolecticas (son
atributos, aquellas que podemos apreciar a través de los sentidos, ej: color, olor,
sabor) y se produce esterilización.
VAPOR
◊ A chorro: se alcanzan Tª de hasta 100º, es un método poco utilizado en
microbiologia.
◊ Autoclave: es un recipiente cilíndrico que se cierra herméticamente. Externamente
lleva un manómetro, un reloj de Tª y otro para el tiempo. En el interior tiene un
cestillo donde se introduce el material a esterilizar. La esterilización se puede
conseguir a 1 atm. 20 minutos a 120 º. No abrir hasta que la presión no este en
cero.
◊ CALOR SECO:
◊ Flameado: poner algo a la llama.
◊ Incinerado: se lleva a cabo en crematorios.
◊ Horno pasteur o poupinel: la esterilización se consigue a 180º 2 h. o 160º en 3h y
media.
La esterilización se lleva a cabo: se preparan los instrumentos a esterilizar que deberán estar
debidamente protegido. Se introduce en la estufa, se conecta y se selecciona la Tª en el
termostato y el tiempo en el reloj (si lo hubiera). Comenzara a contabilizar cuando alcance la
Tª deseada, transcurrido el tiempo se desconecta el interruptor y dejamos que baje la Tª, los
materiales que se pueden esterilizar por este método son: porcelana, vidrios y no para m.c. ,
plástico.
b.− Radiaciones
◊ Ionizantes: son fundamentalmente R. alfa y R. gamma. Destruyen las bacterias al
actuar los ac. Nucleicos y enzimas. Presentan un poder de penetración alto.
◊ No ionizantes: son R. UV no son muy útiles porque son poco penetrantes, solo
aseptizan la superficie.
2.− METODOS MECANICOS
◊ Filtros: con poro de menor tamaño que las bacterias por lo que las retienen, se hacen
con barro y otras sustancias, generalmente los virus pueden atravesarlos.
◊ Ultrasonido: consiste en introducir en tanques de distintos tamaños que contienen
líquido desinfectante. Una vez puesto en marcha el dispositivo comienza a vibrar a
gran velocidad ocasionando pequeñas burbujas que entran en todos los recodos
47
consiguiendo eliminar todos los microorganismos. Es un método poco utilizado ya
que es aro y poco practico.
◊ Agitación: se lleva a cabo por perlas de vidrios.
3.− SALES MINERALES
◊ Medios hipotónicos: colocar una bacteria en este medio tiende a coger H2O hasta
estallar. Esto es solo teoría ya que en la práctica la pared bacteriana la protege.
◊ Medios hipertónicos: colocar una bacteria en este medio pierde H2O hasta
deshidratarse, con lo que se frena la multiplicaron pero no se destruye.
4.− COMPUESTOS QUIMICOS: van a producir la destrucción de todos los
microorganismos patógenos.
Todo buen material de desinfección debe cumplir:
1º) matar al mayor nº de gérmenes o al menos a todos los patógenos.
2º) ser económico y de fácil adquisición.
3º) no ser corrosivo (material), toxico (para personas, animales o plantas) ni irritantes para los
tejidos.
4º) que posea un alto poder de penetración.
5º) olor agradable.
6º) estabilidad y homogeneidad de composición y difusión.
Las técnicas mas empleadas para su uso son:
◊ inmersión
◊ loción
◊ nebulizacion
◊ pulverización
Los desinfectantes y antisépticos más utilizados son:
◊ Compuestos inorgánicos
◊ Detergentes catiónicos: se utilizan derivados del R−NH4 , los más empleados son:
◊ Cloruro de Benzalconio
◊ Cetrimida
Se suelen emplear para la limpieza y desinfección de paredes, ropa, etc.
◊ Detergentes aniónicos: como por ejemplo el uridilsulfato sódico.
◊ Metales pesados: son derivados del mercurio, la más conocida es la mercromina que
generalmente se emplea como antiséptico.
◊ Halógenos: existen dos tipos:
◊ Derivados del cloro: se utilizan en forma de gases o hipoclorito (lejía). Se utilizan
principalmente para el saneamiento de aguas.
◊ Derivados del yodo: se utilizan en solución alcohólica como la tintura de yodo
(Betadine).
◊ Agentes oxidantes: como el agua oxigenada.
◊ Compuestos orgánicos
◊ Alcoholes: se utilizan como antiséptico y desinfectante sobre el filo de algunas
48
superficies. Se emplea el etanol o alcohol etílico para tejidos y metanol para
superficies que no vayan a estar en contacto con la piel.
◊ Fenoles: se utilizan para la desnaturalización de proteínas. Los más utilizados son el
resorfinol, hexaclorofeno, zotal, etc. muy utilizada es la clorohexidina que se puede
considerar lo más parecido a un antiséptico ideal, junto con el Betadine, ya que actúa
sobre gram + y −, hongos, virus, etc.
◊ Aldehídos: se utilizan principalmente vapores de formol y glutaraldehído.
◊ Oxido de etileno: es un gas tóxico que con el aire forma una molécula explosiva, por
lo que se utiliza en cámaras de oxido de etileno a 4−6 atm. y mezclado con un gas
inerte como dióxido de carbono queda adsorbido en el material por lo que una vez
estabilizado hay que airear dicho material.
Presenta un gran poder de penetración y se aplica a cualquier material resistente al calor y que
no puede desinfectarse por otros métodos. Ej: instrumentos para endoscopia, plásticos
termolábiles, cauchos, etc.
El material esta disponible para ser utilizado a las 48 horas después de su esterilización y
deberá conservarse estéril en bolsas cerradas por procedimientos termoeléctricos. La duración
de la esterilización es de aproximadamente 6 semanas.
◊ −propiolactona: es un líquido muy tóxico que se utiliza para esterilizar material
sensible al calor.
Podemos generalizar y decir:
♦ que para esterilizar se utiliza:
◊ Calor.
◊ Radiaciones.
◊ Formol
◊ Glutaraldehído.
◊ Oxido de etileno.
◊ .propiolactona.
♦ que para desinfectar se utilizan:
◊ ácidos y álcalis.
◊ Algunos halógenos.
◊ Glutaraldehído.
♦ que como antisépticos se utilizan:
◊ Detergentes.
◊ Metales pesados.
◊ Derivados halogenados.
◊ Agentes oxidantes.
◊ Alcoholes.
◊ Fenoles.
Actualmente son ampliamente empleadas mezclas de desinfectantes para aumentar la
potencia o espectro de acción. Las asociaciones más utilizadas son:
◊ Clorhexidina con cetrimida
◊ Mercuriales orgánicos con detergentes aniónicos y fenoles.
3.− CONTROLES DE ESTERILIDAD
Sirven para comprobar la eficacia del proceso de esterilización. Podemos distinguir:
a.− De tipo Físico: Son sistemas de control incluidos en sistemas de esterilización. Ejemplo:
manómetros, termómetros, vacuómetros (miden el vacío) y registros gráficos de distintos
49
parámetros.
b.− De tipo Químico: Son cintas adhesivas en las que se produce un cambio de color si se ha
estilizado bien.
c.− De tipo Biológico: Sistemas comerciales en forma de cápsula cerrada en cuyo interior hay
esporas. Dichas cápsulas tras haber sido sometidas a esterilización se incuban a 40º−45ºC
durante 48−64 horas y se procede a la lectura donde la germinación y cambio de color
indicará en cada caso que no se ha producido condiciones de esterilización.
4.− EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE. DETERMINACIÓN
DEL COEFICIENTE FENOL (práctica)
◊ Fundamento: Se puede determinar la potencia de un desinfectante problema
utilizando como patrón el fenol. Para ello se compara el poder germicida a distintas
concentraciones.
◊ Material: Tubos de ensayo, pipetas de 2 y 5 ml, gradilla, asa de siembra, estufa de
cultivo, cronómetros o relojes.
◊ Reactivos: Fenol, desinfectante problema, caldo nutritivo y microorganismo
problema.
◊ Técnica:
◊ Se preparan 4 tubos con 5 ml de cada una de las diluciones crecientes del
desinfectante a titular. Las diluciones son: 1/100, 1/200, 1/400 y 1/800.
◊ De la misma forma se preparan 4 tubos con 5ml de cada una de las diluciones
crecientes de fenol (patrón) cuya concentración es el doble del antiséptico problema.
Las diluciones son: 1/50, 1/100, 1/200 y 1/400.
◊ Se llevan los todos los tubos al baño maría a 37ºC durante 5 minutos.
◊ Se añade a cada tubo 1.5ml de la suspensión de microorganismos problema.
◊ Pasados 5 minutos se toman de cada tubo un asa y se siembra en caldo nutritivo. Se
efectúa la misma operación a los 10 y 15 minutos.
◊ Se incuba durante 48 horas a 37ºC en estufa. El crecimiento puede verse por turbidez,
cambio de color, precipitado blanco lechoso, etc.
⋅ Resultados e Interpretación: El coeficiente final es la relación existente entre
el inverso de la mayor dilución del desinfectante problema que no inhibe los
microorganismos en 5 minutos de contacto pero sí en 10 minutos y la mayor
dilución del fenol que se comporta igualmente.
TEMA 10.− TIPACIÓN BIOQUÍMICA
1.− Introducción.
2.− Clasificación.
3.− Requerimientos nutritivos. Factores V y X.
4.− Pruebas del metabolismo hidrocarbonado (oxidativo y fermentativo).
⋅ O−F de Hung y Lesión.
⋅ Producción de ácido− gas.
⋅ −D−Galactosidasa.
1.− INTRODUCCIÓN
50
Los microorganismos como seres vivo tienen su propio metabolismo:
◊ Anabolismo: relacionado con síntesis para lo que se requiere energía.
◊ Catabolismo: relacionado con degradación con ganancia de energía.
Estas reacciones vienen regidas por unos biocatalizadores de naturaleza proteica
denominados enzimas, los cuales son característicos para cada germen, por lo que la
detección in vitro del conjunto de estos enzimas es de gran utilidad en el proceso de
identificación microbiológica.
La presencia de enzimas se investiga de dos formas:
◊ Sembrando el microorganismo en un medio que contenga el sustrato a investigar con
posterior incubación en condiciones adecuadas. Ej: prueba de Hung y Leifson o la
reducción de nitratos.
◊ Cultivando previamente en un medio que o contenga el sustrato y posteriormente se
pone en contacto con él. Ej: prueba de la oxidasa, de la catalasa.
La tipación bioquímica puede realizarse sobre un cultivo puro. El número y tipo de
pruebas bioquímicas a realizar sobre el germen depende de los primeros datos del
examen microbiológico:
⋅ morfología del germen y sus colonias.
⋅ características tintoriales.
⋅ medios donde crecen, etc.
2.− CLASIFICACIÓN
(fotocopias)
3.− REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS. FACTORES V y X.
Algunos microorganismos son muy exigentes nutricionalmente y requieren para su
desarrollo la presencia de sustancias específicas llamadas factores de crecimiento,
vitaminas, aminoácidos, factores de la coagulación, etc. El ejemplo más conocido en
bacteriología es el de Haemophylus que precisa del factor X, V o ambos para
desarrollarse de forma óptima.
Las bacterias Haemophylas crecen bien en sangre entera, la cual aporta ambos
principios:
⋅ Factor X o hemina: es una sustancia termoestable derivada de la Hb.
⋅ Factor V o coenzima I (NAD): es una sustancia termolábil.
⋅ Fundamento: FV y FX por ser hidrosolubles difunden rápidamente en medio
sólidos como el agar, si se depositan tiras de papel de filtro impregnadas en
estos factores en un medio dificultorio de los mismos se puede conocer la
necesidad de F V y X del microorganismo estudiado, observando el
desarrollo de las colonias alrededor de las tiras.
⋅ Material: placa de petri, asa, pipeta Pastear, pipeta calibrada y tubos estériles.
⋅ Reactivos: medio deficiente de F V y X, como agar Mueller−Hilton, caldo
infusión de cerebro corazón, tiras de papel de filtro impregnadas en F V y X
respectivamente y microorganismos.
⋅ Técnica:
51
1.− A partir de un cultivo puro del microorganismo problema preparar una
suspensión de 2−3 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHI).
2.− Realizar con esta suspensión una siembra de inoculación en una placa con agar
Mueller−Hilton, preferiblemente por la técnica de Kirby Bauer.
3.− Colocar una tira con el FV y otra con el FX en la superficie del agar presionando
suavemente, deben estar separadas por 1 cm.
4.− Incubar a 37ºC 18−24 horas.
⋅ Resultados e interpretación
Se observa si existe crecimiento alrededor de las tiras:
⋅ 1º Caso: microorganismo requiere FX.
⋅ 2º Caso: microorganismo requiere FX.
⋅ 3º Caso: microorganismo requiere ambos factores.
Si el microorganismo estudiado es Haemophylus se cultivará en una atmósfera del
5−10% de CO2.
4.− PRUEBAS DEL METABOLISMO HIDROCARBONADO
La utilización por un microorganismo de los hidratos de carbono tiene lugar por
alguno de estos procesos:
◊ metabolismo oxidativo
◊ metabolismo fermentativo
La oxidación de hidratos de carbono es un proceso aeróbico y lo realizan los
microorganismos aerobios obligados o estrictos.
La fermentación es un proceso anaeróbico efectuado por microorganismos aeróbicos
y anaeróbicos facultativos.
Las diferencias entre el metabolismo oxidativo y fermentativo están presentes en el
esquema siguiente:
Producción de ácido
Producción de gas
Grado de acidez
Fosforilación de glucosa
Último aceptor de e− en
la cadena respiratoria
Metabolismo
fermentativo
Aeróbica y
anaeróbicamente
Pueden producirlo
Alto
Sí
Sustrato orgánico
Metabolismo oxidativo
Aeróbicamente
No
Bajo
No
Oxígeno
Las pruebas del metabolismo hidrocarbonato son:
1.− PRUEBA O.F. DE HUNG Y LEYSON
52
⋅ Fundamento: Se basa en que el metabolismo oxidativo sólo produce ácido en
la superficie del medio mientras que en el fermentativo el ácido es producido
en todo el medio, incluso en las zonas de anaerobiosis; además en caso de
aparición de gas éste sólo se forma en el metabolismo fermentativo.
La formación de ácido se detecta por el viraje de un indicador de pH mientras que la
de gas por la aparición de burbujas dispersas, grietas o porque el medio se despega
del fondo.
La prueba se puede realizar sobre distintos HC, los más utilizados son glucosa,
lactosa, sacarosa y maltosa.
Entre las principales aplicaciones de esta prueba están:
◊ Diferenciar géneros intestinales:
⋅ Enterobacterias: fermentan la glucosa
⋅ Pseudomonas: oxidan la glucosa
⋅ Moxarella, Alcalígenas, Acinetobacter: ni fermentan ni oxidan la glucosa
⋅ Diferenciar géneros de la familia Micrococaceae:
• Staphylococo: fermentan la glucosa
• Micrococus y Planococus: oxidan la glucosa
• Material: Tubos de cultivo, hilo de siembra, pipeta de 10 ml,
algodón, mechero y estufa de cultivo.
• Reactivos: Medio básico de Hung y Leyson, parafina o vaselina
estéril, solución de HC al 10% y microorganismo.
• Técnica:
1.− Agregar al medio básico de Hung y Leyson un 10% de la solución de HC
con lo que se obtiene una dilución final del 1%.
2.− A partir de un cultivo puro y joven de microorganismo problema se toma
una muestra con el hilo. Se siembra en picadura 2 tubos con el medio H−L.
Un tercer tubo no inoculado actuará como control negativo.
3.− Calentar uno de los dos tubos cultivados para que el CO2 del medio se
desprenda y se sella con 1−2 ml de vaselina o parafina fundida para mantener
la anaerobiosis.
4.− Se incuba a 37ºC durante 48−72 horas y en algunas ocasiones se
requieren hasta 14 días de incubación.
• Resultados e Interpretación: Si se forma ácido el medio virará de
verde a amarillo. La producción de gas se verá en burbujas, grietas,
elevación del medio, etc.
La interpretación de resultados posibles se detalla en el siguiente esquema:
Fermentación
anaerogénica
Oxidación
No oxidación ni
fermentación
Oxidación y
Tubo abieto
Tubo cerrado
Amarillo
Amarillo
Amarillo
Verde
Verde
Verde
Amarillo
Amarillo
53
fermentación
El tubo de control siempre será de color verde quede cerrado o abierto.
• Observaciones al método: Para microorganismos con requerimientos
nutritivos se agrega al medio básico de H−L un 2% de suero o 0.1%
de extracto de levadura. En esta prueba se puede observar la
movilidad del microorganismo ya que hará un zig−zag en el medio.
2.− PRODUCCIÓN ÁCIDO−GAS
• Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de pH al producirse
ácido. La producción de gas se detecta por la retención de éste en una
campana de Durham. Al igual que en la prueba O.F. se puede realizar
sobre distintos HC. Su aplicación fundamental es la investigación de
la capacidad degradativa de un HC por el microorganismo.
• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, campana de Durham,
pipeta de 10 ml, algodón, mechero y estufa de cultivo.
• Reactivo: Agua de peptona, solución al 10% de HC, solución al 1%
de rojo fenol y microorganismo.
• Técnica:
1.− Mezclar 900 ml de agua de petona, 100 ml de solución de HC al 10% y
1ml de la solución de rojo de fenol al 1%.
2.− Llenar 2 tubos de ensayo con la campana de Durham con 5ml del medio
preparado.
3.− Esterilizar en autoclave.
4.− A partir de un cultivo joven y puro de un microorganismo tomar una
muestra con el asa. Se inocula en uno de los tubo mientras que el otro actúa
de control negativo.
5.− Incubar a 37ºC durante 24−48 horas.
• Resultados e Interpretación: Si se produce ácido el medio virará de
color rojo a color amarillo. La producción de gas se detecta en la
acumulación de éste en la campana de Durham.
• Observaciones al método: La campana de Durham de estar llena de
caldo nutritivo en el momento de incubar ya que la sola presencia de
un burbuja de gas indica la formación del mismo si queremos ver la
presencia de ácido y gas a partir de lactosa por medio de
Enterobacterias. El medio descrito se sustituye por el caldo
McKonkey que lleva lactosa. En la preparación del medio de cultivo
se puede sustituir el rojo de fenol por otros indicadores a la misma
concentración, como: azul de bromotimol o púrpura de bromocresol.
3.− PRUEBA DE LA −D−GALACTOSIDASA
Determina la capacidad de fermentar la lactosa. Los microorganismos que
fermentan la lactosa de forma activa poseen dos enzimas:
• Lactosa permeasa: localizada en la membrana celular y relacionada
con el transporte de la lactosa.
54
• −D−galactosidasa: enzima intracelular capaz de desdoblar la lactosa
en glucosa y galactosa.
Según actúen sobre la lactosa los microorganismos se clasifican en:
⋅ Fermentadores activos de lactosa: poseen ambos enzimas y la catabolizan
rápidamente (antes de 24 horas)
⋅ No fermentadores de lactosa: carecen de ambos enzimas y no penetran en la
célula ni es degradada la lactosa.
⋅ Fermentadores tardíos de lactosa: carecen de lactosa permeasa pero pueden
fermentar la lactosa porque tienen −D−galactosidasa. Estos
microorganismos en presencia de altas concentraciones de lactosa son
capaces de permeabilizarse ligeramente a la lactosa y fermentarla entre 2−15
días.
La principal aplicación de esta prueba es la diferenciación de Enterobacterias:
da positiva esta prueba E.coli, Yersinia, Klebsiella y Shigella y la da negativa
Salmonella y Proteus.
• Funadamento: Se puede detectar el enzima −D−galactosidasa
empleando ortonitrofenil−−D−galactopiranósido (ONPG),
compuesto de estructra similar a la lactosa en el que la glucosa ha
sido sustituida por el ortonitrofenol, el cual liberado en medio
alcalino, por acción de la −D−galactosidasa, produce un color
amarillo. Esta reacción se produce en un intervalo máximo de 24
horas.
( La lactosa se pone en contacto con el microorganismo; si el
microorganismo posee la −D−galactosidasa desdoblará la lactosa, si no la
posee no la desdoblará).
• Material: Tubo de ensayo, asa de siembra y baño o estufa a 37ºC.
• Reactivos: Solución tamponada a pH 7 de ONPG y microorganismo.
• Técnica:
1.− A partir de un cultivo puro preparar una suspensión densa de
microorganismo en 0,5ml de suero fisiológico estéril.
2.− Añadir una gota de tolueno a la suspensión y mezclar. (Así se consigue la
liberación de la −D−galactosidasa de la bacteria).
3.− Agregar 0,5ml de solución tamponada de ONPG.
4.− Incubar a 37ºC y leer antes de 24 horas.
• Resultados e Interpretación:
♦ ONPG positivo: color amarillo. Algunos microorganismos
lo producen en 5−10 minutos, la mayoría antes de 1 hora.
♦ ONPG negativo: incoloro. No se debe interpretar como
negativo antes de 24 horas de incubación.
• Observaciones al método: La solución de ONPG se puede sustituir
por tabletas o discos comerciales.
Los microorganismos ensayados en esta prueba deben provenir de un medio
con lactosa (ej: kliger).
55
La solución de ONPG recién preparada debe ser incolora y se puede emplear
un control positivo (E.coli) y otro negativo (Proteus).
La solución debe conservarse en frascos de olor topacio a 4ºC y antes de
emplearse se debe atemperar a 37ºC para redisolver el fosfato que cristaliza
durante la conservación.
Es importante utilizar un inóculo concentrado para obtener una elevada
concentración de enzima y así acelerar la velocidad de reacción.
TEMA 11.− TIPACIÓN BIOQUÍMICA II
1.− Metabolismo proteico
• Hidrólisis de la gelatina.
• Producción de sulfhídrico.
• Prueba de las descarboxilasas.
2.− Pruebas enzimáticas.
• Prueba de la oxidasa.
• Prueba de la catalasa.
• Prueba de la coagulasa.
• Pruebas de la ureasa.
• Prueba de reducción de nitratos.
1.− METABOLISMO PROTEICO
1.− Hidrólisis de la gelatina
Las proteínas exógenas son muy grandes para entrar en la célula bacteriana
por tanto para poder ser utilizadas deben hidrolizarse con enzimas
extracelulares de tipo proteolítico.
Estas enzimas son secretadas por ciertas bacterias y esta capacidad es
utilizada para su tipación.
El catabolismo de las proteínas por enzimas proteolíticas es un proceso en
dos etapas:
1º proteínas + H2O proteinasa polipéptidos.
2º polipéptidos H2O + proteinasa aminoácidos.
Con esta técnica se permite diferenciar distintas especies, como por ejemplo
Psudemonas aurogenosa(da +), Serratia (da +) y Listeria monocitogenes (da
−).
Debemos tener en cuenta que la gelatina entre 20−25ºC es sólida y a
temperaturas superiores a 28ºC se licua.
• Fundamento: Se siembra en picadura un tubo con gelatina nutritiva,
observándose la licuefacción por la acción de las gelatinas.
• Material: Hilo, tubos, algodón, mechero, pipeta 10ml, estufa de
56
cultivo.
• Reactivos: Medio gelatina nutritivo y microorganismo.
• Técnica:
1.− Se preparan dos tubos con gelatina nutritiva estéril. Para su llenado se
licua el medio tras lo cual se solidifica con inmersión en hielo.
2.− A partir de un cultivo joven y puro de microorganismo problema se toma
una muestra con el hilo.
3.− Se siembra en picadura 1 tubo, el otro se punciona con el hilo estéril
(actuará como control −).
4.− Incubar a 22−25ºC de 1−14 días.
• Resultados e interpretación:
♦ Hidrólisis de gelatina +: se produce una zona de
licuefacción con ensanchamiento en la línea de punción.
♦ Hidrólisis de gelatina − : no se produce ensanchamiento en
la línea de punción.
2.− producción de sulfhídrico (H2S)
• Fundamento: Algunos microorganismos son capaces de liberar
azufre en forma de H2S (gas) como producto final de la acción
metabólica sobre proteínas con aminoácidos azufrados.
Dan reacción + : Proteus vulgaris y Proteus mirabilis.
Dan reacción −: Proteus morganii y Proteus rettegeri (permite distinguir
distintos especies de Proteus)
También permite distinguir distintas Pseudomonas.
• Técnica:
1.− A partir de un cultivo joven y puro del microorganismo problema se toma
una muestra con el hilo.
2.− Se siembra en el medio AHP (Agar con Hierro y Peptona).
3.− Incubar a 37ºC durante 18−24 horas.
• Resultados e interpretación:
• Sulfhídrico + : ennegrecimiento del medio.
• Sulfhídrico − : no ennegrecimiento del medio.
3.−PRUEBAS DE LAS DESCARBOXIDASAS
Son un grupo de enzimas capaces de atacar el grupo carboxilo de los
aminoácidos para formar aminas con desprendimiento de CO2.
Este proceso se realiza en anaerobiosis.
Cada descarboxilacion es específica de un aminoácido: lisina, arginina y
ornitina son los 3 aminoácidos más utilizados en la tipacion bioquímica:
57
LISINA −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− CADAVERINA + CO2
(LDC= Lisina descarboxidasa)
ORNITINA −−−−−−−−−−−−−−−−− PUTRESCINA + CO2
(ODC= Ornitina descarboxidasa)
ARGININA −−−−−−−−−−−−−− CITRULINA + NH3 −−−−−−−−−
PUTRESCINA + CO2
(ADC= Arginina descarboxidasa)
Son pruebas importantes para el estudio de las Enterobacterias. En los 3
procesos se produce una alcalinización del medio con desprendimiento de
CO2.
• Fundamento: Si a un medio base (medio general) con un indicador de
pH se le añade los aminoácidos correspondientes al enzima estudiado
y posteriormente se le añade el microorganismo, el viraje del
indicador del pH indicará la alcalinización del medio y por tanto la
presencia del enzima estudiado
DC
R − CH − COOH !!!!! R − CH2 −NH2
% CO2 básico (ANAEROBIOSIS)
NH2
Amarillo Rojo púrpura
• Material: Tubo de ensayo y asa.
• Reactivos: Caldo de Moeller para descarboxilasa, aminoácidos
ensayados, parafina o vaselina estéril y microorganismo.
• Técnica:
1.− Se preparan 4 tubos:
♦ T1 (C) 5 ml Caldo Moeller ! Control
♦ T2 (L) 5 ml Caldo Moeller + L. Lisina (1% con respecto al
caldo)
♦ T3 (O) 5 ml Caldo Moeller + L. Ornitina (1% con respecto al
caldo)
♦ T4 (A) 5 ml Caldo Moeller + L. Arginina (1% con respecto
al caldo)
2.− A partir de 1 cultivo joven y puro del microorganismo problema se
inoculan los 4 tubos.
3.− Sellarlos con 2−3 ml de parafina estéril (aprox. 1 cm de altura).
4.− Incubar 35º C 18−24 horas.
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• Resultados e interpretación: Si el aminoácido es descarboxilado se
forman aminas que alcalinizan el medio dando un color rojo púrpura
(la prueba es +). Si la prueba es − el primer tubo es de color
amarillo.
NOTA: el pH del caldo de Moeller es igual a 6.
2 .− PRUEBAS ENZIMATICAS
1.− PRUEBA DE LA OXIDASA
La oxidasa es el enzima que cataliza la transferencia de electrones del
sustrato al oxigeno, en general se detecta en los microorganismo aerobios o
anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella.
Se denomina también citocromo oxidasa y sirve para diferenciar
Pseudomonaceae de los miembros oxidasa negativa de Enterobacteriaceae.
Ayuda a diferenciar entre los géneros Moraxella + y Neiseria + de
Acinetobacter −.
• Fundamento: consiste en la utilización de indicadores susceptibles de
ser oxidados en presencia de oxidasa.
Estos tienen la propiedad de ser incoloros en estado reducido y colorearse al
ser oxidados (cesión de electrones a la oxidasa).
Entre los indicadores más utilizados se encuentran los derivados de la
parafenilendiamina que por acción de la oxidasa dan indofenol.
• Material: Placa de petri, mechero, estufa de cultivo, papel, placa de
cultivo, asa, pipeta de 10 ml y pipeta Pasteur.
• Reactivos: Agar sangre, microorganismo y reactivo oxidasa de
Kovacs.
• Técnica:
1.− Cultivar el microorganismo problema en una placa de petri con agar
sangre.
2.− Colocar un papel de filtro de 6 cm2 en la placa de petri vacía y estéril.
3.− Depositar 2−3 gotas del reactivo oxidasa de Kovacs en el centro del
papel.
4.− Recoger con el asa una colonia de la placa con agar sangre y extenderla
en el papel.
5.− Leer el resultado a los 5−10 sg.
• Resultados e interpretación:
♦ Oxidasa + : aparición de color negro púrpura (violeta).
♦ Oxidasa − : no se produce color.
2.− PRUEBA DE LA CATALASA
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La catalasa es una enzima que actúa sobre el peroxido de hidrogeno (H2O2)
según la reacción:
catalasa
2 H2O2 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 2H2O2 + O2 (gas)
BURBUJAS
El H2O2 se forma como producto terminal oxidativo de la degradación
aeróbica de los hidratos de carbono. Si se acumula es toxica para los
microorganismos y produce la muerte por lo que la catalasa es imprescindible
para su desarrollo.
Entre sus aplicaciones se encuentra la diferenciación de:
• Staphylococo, Bacillus, Listeria monocitogenes ! positivo
• Estreptococo, Micrococo, Clostridium ! negativo
• Fundamento: Se basa en poner en contacto el microorganismo
posible productor de catalasa con un sustrato natural (H2O2) y
observar la presencia del enzima por la aparición de gas.
• Material: Porta, pipeta pasteur, asa y mechero.
• Reactivos: Agua oxigenada al 30% y microorganismo.
• Técnica:
1.− Recoger con un asa una colonia de 18−24 horas.
2.− Colocar en un porta.
3.− Agregar sobre el microorganismo una gota de agua oxigenada al 30%.
• Resultados e interpretación:
♦ Catalasa + ! formación inmediata de burbujas de O2.
♦ Catalasa − ! no aparecen burbujas.
• Observaciones al método: No utilizar m.c. que tengan hematíes. Ej.:
agar sangre, agar chocolate, puesto que estos contienen catalasa por
lo que podrían producir falsos negativos.
El agua oxigenada es inestable y se descompone con la luz, por ello hay que
mantenerlo en refrigerador y en frascos opacos.
3.− PRUEBA DE LA COAGULASA
Enzima producida por ciertos microorganismos que es capaz de coagular en
plasma. Se utilizan para diferenciar Staphyloocos Aereus de otras especies.
• Fundamento: Consiste en poner en contacto el microorganismo
problema con el plasma para observar la coagulación de este por la
acción de la coagulasa.
• Material: Tubo de hemólisis, pipeta de 0,5 ml., asa, mechero, baño,
estufa de cultivo.
• Reactivos: Plasma humano o plasma de conejo y microorganismo.
• Técnica:
1.− Colocar en un tubo de hemólisis estéril 0,5 ml. de plasma
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2.− Agregar 0,5 ml de un cultivo de 18−24 h en medio liquido del
microorganismo problema. En caso de partir de un medio sólido, tomar con
el asa 2 o 3 colonias y emulsionarlas en el plasma.
3.−Homogeneizar con rotación suave en los tubos.
4.− Incubar al baño Mª a 37º. Observar cada 30 min. si hay coagulación,
durante 4 h. Si a las 4 h no hay coagulo visible se deja en estufa de cultivo a
37º durante 24 h.
• Resultados e interpretación:
♦ Coagulasa + ! formación de coagulo.
♦ Coagulasa − ! no formación de coagulo.
• Observación al método: la prueba se puede realizar mezclando una
gota de plasma más una gota de microorganismo en un porta. Si la
reacción es + se detecta un precipitado en forma de aglutinado
blanco.
4.− PRUEBA DE LA UREASA
La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica denominada
ureasa dando carbonato amonico como producto final con la consiguiente
alcalinización del medio:
ureasa
NH2−CO−NH2 + H2O −−−−−−−−−−−−−−−−− CO2 +2NH3 ! CO3 (NH4)2
ROJO
• Fundamento: Se basa en el viraje del indicador de ph debido a la
alcalinización del medio por el carbonato amonico producido por la
acción de la ureasa sobre la urea del cultivo.
• Material: Tubos de cultivo, asa, pipeta de 10 ml, estufa de cultivo,
mechero, algodón.
• Reactivos: Microorganismo agar uera de Christensen.
• Técnica:
1.− A partir de un cultivo puro y joven se toma una muestra con el asa.
2.− Inocular en la superficie del tubo con agar urea de Christensen.
3.− Incubar a 37º hasta detectarse el viraje del indicador. Si no se produce el
viraje en 6 días la prueba será negativa.
• Resultados e interpretación:
♦ Urea + ! color rojo rosado.
♦ Urea − ! no se produce viraje del indicador.
5.− PRUEBA DE REDUCCIÓN DE NITRATOS
Algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos utilizan
nitrato como último aceptor de electrones en su metabolismo. Este proceso de
reducción de nitratos es producido por una enzima, nitratasa o nitrato
61
reductasa, pudiendo originar diversos productos finales: nitritos, nitrogeno
molecular, oxido nítrico, oxido nitroso, amoniaco,etc. La formación de uno u
otro depende de la especie bacteriana, lo más común son nitritos y nitrogeno
molecular.
La reducción de nitratos consiste en la detección de los productos de
reducción al ser excretados al medio por el microorganismo.
Se utilizan para la identificación de especies de Haemophylus y Neisserias.
• Fundamento: Puesto que los productos finales de la reducción más
común son los nitratos y nitrógeno molecular, la prueba constará de
dos fases:
♦ Detección de nitritos por una reactivo colorimétrico.
♦ La no aparición de color en la primera fase puede significar:
♦ No se ha reducido el nitrato, se comprueba añadiendo un
agente reductor, con lo que se desarrolla la reacción
colorímetrica de la primera fase.
♦ El nitrito se ha reducido a nitrógeno molecular, el cual se
detecta por la campana de Durham (si el medio es líquido) o
por la formación de grietas (si el medio es sólido).
♦ El nitrito se ha reducido a otros productos nitrogenados. Ej:
oxido nitrico.
⋅ Materiales: Tubo, asa, pipeta 10ml., campana de Durham, algodón, mechero,
estufa de cultivo.
• Reactivos: Caldo con nitrato, reactivo A (alfanaftilamina al 0.5%),
reactivo B (ácido sulfanilico al 0.8%), Zn en polvo y
microorganismo.
• Técnica:
1.− A partir de un cultivo joven y puro se toma un amuestra con el asa.
2.− Inocular un tubo con caldo con nitrato, otro sin sembrar actuará como
control − , en ambos se pone campana de Durham.
3.− Incubar a 37ºC durante 12−24 horas.
4.− Agregar 1ml. de reactivo A y 1 ml. De reactivo B. Si se desarrollará color
antes de 30 segundos se da por finalizada la prueba, en caso contrario añadir
al tubo un pellizco de polvo de Zn.
• Resultados e interpretación:
Si la prueba es positiva:
⋅ Reducción a nitritos, aparición de color rojo o rosado al añadir el reactivo A
y B.
⋅ Reducción a nitrógeno molecular, acumulación de gas en la campana de
Durham.
⋅ Reducción a otros productos nitrogenados, si al añadir el polvo de Zn no se
desarrolla color.
TEMA 12.− TIPACIÓN BIOQUÍMICA III
62
El IMVIC son 4 pruebas de identificación bioquímica que hacen referencia a:
• I ! Indol: Se utiliza en el metabolismo proteico.
• M ! Rojo de Metilo: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.
• V ! Voges−Proskauer: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.
• C ! Citrato: Se utiliza en el metabolismo hidrocarbonado.
Estas pruebas son muy útiles en el estudio de Enterobacterias ( E.Coli,
Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia).
1.− PRUEBA DEL INDOL
• Fundamento: Estudia la utilización de prótidos por parte de un
microorganismo, en concreto determina la capacidad de desdoblar
indol de la molécula de triptófano. El triptófano es un aminoácido
que puede ser degradado por ciertas bacterias para originar distintos
metabolitos indólicos . El triptófano por acción de una enzima, la
triptofanasa, da lugar a determinados metabolitos indólicos como:
indol, escatol o indol acético).
El indol es detectado por un reactivo que produce coloración al reaccionar
con él.
Las diversas enzimas intracelulares que intervienen en el proceso reciben el
nombre de triptofanasa.
• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón,
mechero y estufa de cultivo.
• Reactivos: Agua de peptona, ractivo indol de Kovacs o reactivo indol
de Ehrlich, éter etílico (dietiléter) y microorganismo.
• Técnica:
a.− Método de Kovacs
1.− Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona.
2.− Incubar a 37ºC 24−48 horas.
3.− Agregar 5 gotas del reactivo indol de Kovacs.
4.− Agitar muy suavemente y dejar reposar unos minutos.
b.− Método de Ehrlich
1.− Sembrar el microorganismo en un tubo con agua de peptona.
2.− Incubar a 37ºC 24−48 horas.
3.− Añadir 1ml del éter etílico y esperar a que éste suba a la superficie.
4.− Añadir 5 gotas del reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo.
• Resultados e Interpretación:
♦ Indol +: Anillo rojo en superficie.
♦ Indol −: Color amarillento.
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• Observaciones al método: El reactivo indol de Kovacs debe ser
fresco (refrigerar a 4ºC varios días), si se deja a T ambiente variará el
color de amarillo a castaño siendo menos sensible.
2.− PRUEBA DEL ROJO DE METILO
• Fundamento: Investiga la capacidad de un microorganismo de
producir ácidos como metabolitos finales del proceso de
fermentación de azúcares. Emplea como indicador el rojo de metilo.
Los microorganismo rojo de metilo positivo producen ácidos estables con
elevada concentración de H+ cesando toda la actividad metabólica.
Los microorganismos rojo de metilo negativo también producen ácidos pero
en menor concentración porque existe una recesión hacia la neutralidad
debido a la degradación de ácidos orgánicos y posible formación de
compuestos de NH4.
• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón,
mechero y estufa de cultivo.
• Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solución de rojo de metilo y
microorganismo.
• Técnica:
1.− Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y
Lubs.
2.− Incubar a 37ºC 48−72 horas.
3.− Añadir 5 gotas de rojo de metilo.
4.− La lectura se efectúa inmediatamente después de añadir el indicador.
• Resultados e Interpretación:
♦ Rojo de metilo +: Color rojo intenso en superficie.
♦ Rojo de metilo −: Color amarillo en superficie.
• Observaciones al método: No interpretar nunca una prueba si el
medio no se ha incubado como mínimo 48 horas. Si la lectura se
efectúa antes los resultados serán falsos positivos, dado que los rojo
de metilo − no habrán tenido tiempo suficiente para metabolizar los
productos ácidos iniciales acumulados por la fermentación de la
glucosa.
El viraje de rojo de metilo a pH 4.5 da color rojo y a pH 6.3 da color
amarillo.
Si no hay rojo de metilo empleamos:
♦ Rojo Fenol, a pH 6.8 da color amarillo y a pH 8.4 da color
rojo.
♦ Azul de Bromotimol, a pH 6 da color amarillo y a pH 7.6 da
color azul.
♦ Púrpura de Bromocresol, a pH 5.2 da color amarillo y a pH
6.8 da color púrpura.
3.− PRUEBA DE VOGES PROSKAUER
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• Fundamento: Consiste en determinar la capacidad de un
microorganismo de producir un metabolito neutro llamado acetil
metil carbinol o acetoína como producto intermediario derivado del
metabolismo de la glucosa. En presencia de oxígeno atmosférico y
álcalis, la acetoína es oxidada a diacetilo que es un sustrato que
genera un compuesto coloreado al añadirle los reactivos adecuados.
• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón,
mechero y estufa de cultivo.
• Reactivos: Medio de Clark y Lubs, solución naftol, solución KOH
al 40% y microorganismo.
• Técnica:
1.− Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de Clark y
Lubs.
2.− Incubar a 37ºC 48−72 horas.
3.− Agregar al cultivo en orden: 0.5 ml de naftol y 0.5 ml de KOH.
4.− Agitar el tubo suavemente y mantenerlo inclinado casi horizontal con el
fin de favorecer la oxidación de la acetoína por el oxígeno atmosférico.
5.− Dejar reposar el tubo 10−15 minutos antes de interpretar la prueba.
• Resultados e Interpretación:
♦ Voges Proskauer +: color rojo−rosado en la superficie antes
de 1hora.
♦ Voges Proskauer −: color amarillo, a veces aparece color
cobrizo al mezclar los reactivos.
4.− PRUEBA DEL CITRATO
• Fundamento: Determina si un microorganismo es capaz de utilizar
citrato como única fuente de carbono. El medio contiene citrato
(como fuente de carbono) y sales de amonio inorgánico (como fuente
de nitrógeno).
Los microorganismos citrato + crecen en este medio alcalinizándolo debido
a:
♦ formación de amoniaco por desdoblamiento de las sales de
amonio
♦ producción de carbonatos y bicarbonatos por degradación de
citrato
• Material: Tubo de cultivo, asa de siembra, pipeta de 10ml, algodón,
mechero y estufa de cultivo.
• Reactivos: Medio de Kosser (medio líquido en tubo), medio citrato
de Simons (agar inclinado), medio citrato de Christensen (agar
inclinado) y microorganismo.
• Técnica:
1.− Se preparan 2 tubos con el medio elegido. Se inocula uno de ellos,
mientras que el otro servirá de control −.
2.− Incubar 48−72 horas a 37ºC. Los tubos estarán destapados para que el
CO2 se evapore libremente. Leer después de 48 horas de incubación.
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• Resultados e Interpretación:
♦ Medio Kosser:
◊ Positivo: turbidez en el tubo
◊ Negativo: no turbidez en el tubo
• Medio Citrato de Simons
◊ Positivo: color azul intenso en superficie
◊ Negativo: no hay cambio de color
• Medio Citrato Christensen
◊ Positivo: color rojo o rosa con crecimiento de
microorg en superficie
◊ Negativo: no cambio de color ni crecimiento de
microorganismo.
TEMA 13.− COCOS POSITIVOS. ESTAFILOCOCOS Y
ESTREPTOCOCOS.
STAPHYLOCOCO
1.− Introducción (Morfología y características).
2.− Aislamiento
3.− Pruebas de Identificación
⋅ Esquema.
⋅ Prueba de la catalasa.
⋅ Prueba de la coagulasa.
⋅ Prueba de hemólisis.
⋅ Prueba de sensibilidad a la Novobiocina.
⋅ O−F de Hung y Lesión.
⋅ Prueba de la ureasa.
⋅ Actividad de la fosfatasa.
⋅ Prueba de la desoxirribonucleasa.
⋅ Prueba de la pirrolidonilamidasa.
⋅ Sistemas comerciales (API).
4.− Estructura antigénica
• Péptidoglucanos.
• Ácidos teicoicos.
• Proteína A.
• Factor de aglutinación.
• Polisacáridos.
5.− Enzimas y Toxinas:
• Toxinas
• Hemolisinas.
• Leucocinas o leucotoxinas.
• Enterotoxinas.
• Toxina exfoliativa.
• Toxina responsable del shock toxico.
• Enzimas:
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• Coagulasa.
• Fibrinolisina.
• Hialurodinasa.
• −lactamasa o penincilasa.
• Lipasas, esterasas, proteinazas, catalasas y nucleasas.
6.− PATOLOGÍA:
• Infecciones superficiales.
• Infecciones intestinales (enterotoxina).
• Infecciones hematológicas.
• Infecciones respiratorias.
• Localizaciones varias.
7.− Infecciones Hospitalarias (Nosocomiales).
8.− Diagnóstico
• Directo.
• Indirecto.
9.− Sensibilidad antibiótica
1.− INTRODUCCIÓN
Son cocos gram + que se pueden encontrar aislados, en parejas, tetradas,
cadenas cortas y racimos de uva.
La mayor parte de las especies son aerobias o anaerobias facultativas. Son
inmóviles, no esporuladas y no capsulados.
Desde el punto de vista bioquímico son catalasa + , oxidasa − y
fermentadores de azucares.
Crecen bien en los medios habituales, Ej: agar sangre o chocolate (para ver
hemólisis) o en caldo de trioglicolato o infusión cerebro− corazón.
Son bastante resistentes a la acción del calor (50ºC 30 min.) y a la acción de
las sales biliares y NaCl, sin embargo se lisan por la acción de ciertos
antibióticos y se inhiben con productos químicos como hexaclorofeno.
Se engloban junto con los géneros no patógenos: Micrococus, Planococus,
Estomacocus dentro de la familia Micrococaceae.
El género Estafilococo se compone actualmente de 27 especies. El hábitat
normal de éstas es variado, principalmente a nivel de piel y mucosas, Ej:
Estafilococos capitis, E. Hominis, E. Haemoliticus (se encuentra en axilas y
pubis) E. Auricularis.
Las especies que se asocian a infecciones humanas o animales son
Estafilococos aureus, epidermis y saprofiticus.
2.− AISLAMIENTO.
Los medios utilizados son:
67
• Champman.
• Agar Cham−Manitol.
• Baid−parker.
Éstos son muy selectivos por tener altas concentraciones de NaCl.
También se puede realizar su aislamiento en medios con sangre para el
estudio de su hemólisis. En el agar sangre aparecen colonias lisas de color
amarillento o blanco.
El material de estudio puede ser pus, sangre, esputo y LCR.
3.− PRUEBAS DE IDENTIFICACION
1.− Esquema ( fotocopias )
2.− PRUEBA DE LA Catalasa (ya explicada)
Nos permite diferenciar:
• Streptocoo (−)
• Staphylococo (+).
3.− prueba de la Coagulasa (ya explicada)
Permite diferenciar:
• Staphylococo Aureus (+)
• Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis (−).
4.− Prueba de hemólisis (ya explicada)
Distingue:
• Staphylococo Aureus (+)
• Staphylococo Saprofitico y Staphylococo Epidermis, no producen
hemólisis.
5.− Sensibilidad a la Novobiocina
Sirve para diferenciar
• Staphylococo Epidermis (sensibilidad +, resistencia − = si muere)
• Staphylococo Saprofitico (sensibilidad −, resistencia +, = no muere).
• Medio de cultivo utilizado es Mueller − Hinton.
• Reactivos: discos de Novobiocina.
• Método:
1.− Inocular superficialmente un microorganismo en una placa de cultivo
2.− Dejar reposar 15 min. A Tª ambiente
3.− Depositar en el centro de la placa un disco de Novobiocina.
4.− Incubar 24 h 35º.
• Lectura: aquellos Staphylococos que son inhibidos por discos de
68
Novobiocina son de la especie de Staphylococo Epidermis, los no
inhibidos son Staphylococos Saprofitico.
6.− Prueba O − F (ya explicada)
Staphylococo Aureus son fermentadores de azucares.
7.− prueba Ureasa ( fotocopias )
• Staphylococo aureus ! Variable: en función de la cepa puede dar (+)
o (−) a la ureasa.
• Staphylococo epidermis ! (+)
• Staphylococo saprofitico ! (+)
8.− prueba Desoxirribonucleasa.
• staphylococo aureus ! (+)
• Staphylococo epidermis y Staphylococo saprofitico ! (−)
9.− prueba de la Actividad fosfatasa.
10.− prueba de la Pirrolidonilamidasa.
11.− Sistemas comerciales (API)
Son sistemas múltiples de pruebas de identificación basadas en pruebas
bioquímicas, enzimáticos y de sensibilidad (pruebas de antibiogramas).
Consisten en tiras con microcúpulas que contienen los sustratos
deshidratados.
Se inocula la suspensión del microorganismo en cada una de ellas y tras la
incubación se leen los resultados directamente o por revelado con reactivos.
Las reacciones + se traducen en un perfil numérico con el que se acude a un
manual que identifica la especie.
4.− ESTRUCTURA ANTIGENICA
Los Staphylococos presentan en su estructura un importante contenido
antigénico que está implicado en el mecanismo de patogeneicidad de estos
microorganismos. Las principales estructuras antigénicas están en la pared y
las más importantes son:
• Peptidoglucanos: Es un polímero polisacárido formado por un
compuesto N − acetilmuranico y N−acetilglucosamida que
desempeña un papel importante en la patología de la infección ya
que:
♦ Induce la producción de IL (interleucinas).
♦ Induce la producción de Ac opsonizantes por los monolitos
humanos.
♦ Atrae leucocitos.
♦ Activa el C'.
♦ Posee actividad endotoxica.
• Ac. Teicoicos: (visto en pared bacteriana).
69
• Proteína A: Es una proteína de 42.000 Dalton que aparece en muchos
Staphylococos aureus. Se encuentra unida de forma covalente al
peptidoglucano. Estas proteínas son capaces de anclarse en la región
FC de las Ig G humanas y de activar el C'.
• Factor de aglutinación: También conocido como coagulasa. Se
encuentra pegado a la superficie externa de Staphylococo aureus y
fija fibrinógeno mediante una reacción no enzimática.
• Polisacáridos: Algunos Staphylococos aureus poseen una cápsula
polisacárido situada en la parte externa de la pared celular capaz de
inhibir la fagocitosis por los leucocitos polimorfonucleares.
5.− ENZIMAS Y TOXINAS
El efecto más o menos patogénico e Staphylococo aureus para hombre
dependerá de:
• Ag presentes principalmente en la pared.
• Toxinas.
• Enzimas.
A.− TOXINAS
• Hemolisina: de composición proteica y en general lisa con facilidad
los eritrocitos, además de tener efectos tóxicos sobre células como
macrófagos y GB. Debido a esta propiedad estas exotoxinas son
conocidas como citotóxicas. Son en general muy sensibles al calor y
se conocen un total de cuatro que son:
♦ Alfa− hemolisina o alfa−toxina: ataca los hematíes
produciendo una hemólisis total alrededor de las colonias en
medio agar sangre o agar chocolate. Por vía subcutánea es
dermonecrótica, con ella se pueden hacer vacunas.
♦ ß−toxina o ß−hemolisina: responsable de la hemólisis
parcial de hematíes.
♦ Gamma hemolisina: interviene en lesiones y heridas pero
tienen poca importancia patógena, no producen hemólisis.
♦ Delta toxina: tiene una acción detergente sobre membranas
biológicas y se le ha asociado un papel en la diarrea aguda en
algunas infecciones staphylocócicas.
• Leucotoxinas o Leucocidinas: son responsables de matar leucocitos
polimorfo nucleares y macrófagos proporcionando una gran
resistencia a las bacterias.
• Enterotoxina: son responsables de intoxicaciones alimentarías de las
que se conocen 6 serotipos distintos (A ! F). Se trata de toxinas
termoestables y resistentes a la acción de jugo gástrico, uniéndose
posteriormente a los receptores nerviosos del tubo digestivo y
actuando sobre el centro del vomito, lo que origina numerosos
vómitos, nauseas y diarreas. La intoxicación alimentaría no cursa con
fiebre.
• Exfoliativa: engloba 2 toxinas responsables de los daños
dermatológicos que tienen lugar en el síndrome de la piel escaldada
provocando una lesión caracterizada por una aparición de ampollas.
• Toxina responsable del Shock Tóxico: se ha observado que es más
común en mujeres que utilizan tampones.
B.− ENZIMAS
70
• Coagulasa: coagula en el plasma sanguíneo al activar el fibrinógeno,
así pues la coagulasa interviene en la formación del coagulo.
• Fibrinolisinas o Staphyloquinasas: destruyen los coágulos sanguíneos
formando microémbolos que facilita la diseminación del trombo, es
decir, ejercen un efecto opuesto a la coagulasa.
• Hialurodinasa: disocia la sustancia fundamental del tejido conjuntivo
facilitando la penetración del Staphylococo.
• ß−Lactomasa o penicilasa: rompe el anillo ß−lactamico de las
penicilinas apareciendo resistencia a las penicilinas.
• Lipasas, esterasas y proteinasas: que hidrolizan lípidos, esteres y
proteínas.
• Catalasa y Nucleasa: la nucleasa produce la ruptura de ácidos
nucleicos. Catalasa (ya explicada).
6.− PATOLOGIA
Estudio de las enfermedades producidas por Staphylococos.
a.− Infecciones superficiales: Principalmente producen:
• forúnculos
• Ántrax.
• problemas en la piel que producen muerte del tejido.
• heridas
• quemaduras.
• infección en el acné.
b.− Infecciones intestinales: relacionadas con:
• vómitos
• nauseas
• diarrea
• mal esta
• a veces fiebre
La producen las enterotoxinas.
c.− Infecciones hematológicas: dando lugar a:
• bacteriemia
• se le ha atribuido a Staphylococo aureus el Síndrome de Shock
Tóxico caracterizado por fiebre, erupción descamativa, hipotensión y
afectación multisistémica (daños en distintos órganos).
d.− Infecciones respiratorias:
• sinusitis
• laryngitis
• faringitis
• bronquitis
• neumonía.
e.− Localizaciones varias: Puede dar:
• artritis
• endocarditis
• pericarditis
71
• meningitis
• neumonía
• osteomielitis
7.− INFECCIONES HOSPITALARIAS O NOSOCOMIALES
Staphylococo aureus constituye el principal patógeno dentro de
Staphylococos. Se le denomina el microorganismo dorado ya que produce un
pigmento de color amarillo. Aproximadamente entre un 2 − 40 % de adultos
son portadores nasales y un 10 % de las mujeres lo llevan en la vagina.
Hay un grupo de población que son más propensos a ser colonizados por
Staphylococo aureus: personal sanitario, adictos por intravenosa, diabéticos y
pacientes tratados por hemodiálisis.
Es importante señalar el Staphylococo epidermis que es causante de
bacteriemia y endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infección del
tracto urinario.
El Staphylococo saprofitico es un agente ideológico de infecciones
importantes del tracto urinario en mujeres jóvenes sexualmente activas.
8.− DIAGNOSTICO
• Directo: vamos a hacer dos subgrupos:
♦ Infecciones no intestinales: se recoge la muestra en
condiciones de asepsia de pus, exudados superficiales, LCR,
sangre.
Se realiza un Gram, se cultiva en agar sangre y se realizan pruebas
bioquímicas como catalasa y coagulasa.
♦ Infecciones intestinales: la toma de muestra se hace de los
alimentos sospechosos y no de heces (ya que en condiciones
normales puede aparecer Staphylococo aureus en heces
(flora habitual)).
Se busca la enterotoxina y no se cultivan gérmenes ya que no es el productor
de la enfermedad. También se investigan los portadores.
• Indirectos: no se suele hacer, si se quisiera buscar Ac frente a
antihemolisinas, antileucocinas o anticoagulantes (lo que se busca
son Ac frente Ag específicos)
9.− SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA
La sensibilidad de Staphylococo aureus a los antibióticos ha disminuido de
forma importante en los últimos años. Poco después de la introducción de la
penicilina G apareciendo cepas de Staphylococos que destruyeron el
antibiótico por las penicilasas.
En pacientes con cepas de Staphylococo productoras de penicilasa la
penicilina no es eficaz.
La introducción de las tetraciclinas y eritomicinas que se mostraron efectivas
en el tratamiento poco después de ser comercializadas se aislaron numerosas
72
cepas hospitalarias, resistentes a estos antibióticos.
La introducción de las penicilinas semisinteticas no ha resuelto el problema.
Así la resistencia a ampicilina es del orden del 85% igual que la amoxicilina.
El desarrollo de las penicilinas semisintéticas resistentes a la penicilasa como
la meticilina, oxacilina, doxacilina han resuelto en parte el problema.
Hoy en día los antibióticos mas utilizados son Vancomicina, Rifampicina y
Ciprofloxacina siendo muy útil las Cefalosporinas y Aminoglucósidos.
STREPTOCOCO
1.− Introducción (Morfología y Características)
2.− Aislamiento
3.− Pruebas de Identificación
• Prueba S.F. o glucosa azida
• Prueba de la Bacitracina
• Prueba de sensibilidad a Optoquicina
• Solubilidad en bilis
• Prueba Voges Proskauer
• APIs
• Otras pruebas:
Catalasa
Oxidasa
Fermentación de HC, etc.
4.− Estructura Antigénica
• Ag de pared específico de grupo (LANCEFIED)
• Proteína M
• Otros Ag
5.− Clasificación
• hemolíticos
• Grupo D:
Enterococos
No Enterococos
• hemolíticos:
Streptococo viridans
Streptococo pneumoniae
6.− Enzimas y Toxinas
73
• Enzimas:
Fibrinolisina o streptoquinasa
Hialuridinasa
Desoxirribonucleasa
Proteinazas
• Toxinas:
Toxina eritrógenica
Hemolisina : O y F
7.− Patología
• Streptococo pyogenes:
♦ Tejidos (eripsipela)
♦ Infecciones locales
♦ Enfermedades poststreptocócicas no supurativas
• Streptococo agalactiae
• Streptococo grupo C
• Streptococo viridans
• Streptococo pneumoniae
• Streptococo grupo D
8.− Diagnóstico
9.− Sensibilidad a los antibióticos
1.− INTRODUCCIÓN
Son cocos gram + agrupados en cadenas o parejas, inmóviles, no
pigmentados, no esporulados, con o sin cápsula.
Pueden ser saprofitos o patógenos en función de su ubicación.
En los cultivos viejos la bacteria puede perder su carácter gram + y aparecer
como gram −.
Bioquímicamente son : catalasa −, oxidadsa −, fermentan lo HC, no producen
gas, indol ni SH2.
2.− AISLAMIENTO
Son aerobios y anaerobios facultativos pero crecen mejor en medios que
presenten un 10% de CO2. Su temperatura es de 15−45ºC siendo la óptima
37ºC.
Los medios de cultivo son:
⋅ M. Generales: agar sangre y agar chocolate.
⋅ M. Enriquecimiento: caldo tripticasa de soja e infusión cerebro corazón.
74
⋅ M. Selectivos: contienen antibióticos (Ab) que inhiben el desarrollo de la
flora acompañante. Ej: agar columbia−colistina−nalidixílico.
⋅ M. Selectivos de enriquecimiento: favorecen el desarrollo de Streptococos
inhibiendo el desarrollo del resto de microorganismos. Ej: glucosa azida
(inhibe bacilos gram −) y violeta de cristal (inhibe Staphylococos).
En agar sangre se comprueba la hemólisis (ver hemólisis).
3.− PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN
1.− Prueba de S.F. o de la glucosa azida
• Fundamento: Consiste en comprobar el crecimiento de
microorganismo en presencia de azida sódica y en su caso la
capacidad de fermentar la glucosa.
• Reactivos: El medio de cultivo (m.c.) es el caldo S.F. el cual es
selectivo para Streptococo fecalis y Enterococo.
• Técnica:
1.− Se inocula el microorganismo cogiendo con un asa una colonia de
24horas y se pone en el caldo S.F.
2.− Se incuba a 38ºC y se realiza la lectura a las 24 horas.
• Resultados: Si hay turbidez en el medio la prueba el positiva con
crecimiento bacteriano. La modificación del color indica
fermentación de la glucosa.
2.− PRUEBA DE LA BACITRACINA
• Fundamento: Los Streptococos hemolíticos del grupo A se
distinguen de los demás porque son sensibles a la bacitracina.
• Reactivos: Se utiliza como m.c. agar sangra al 5% y como reactivos
discos de bacitracina.
• Técnica:
1.− Inocular por diseminación de superficie un placa de agar sangre con la
suspensión de microorganismo problema.
2.− Dejar reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
3.− Colocar con unas pinzas estériles un disco de bacitracina. Incubar a 37ºC
24 horas.
• Resultados: Los Streptococos hemolíticos del grupo A inhiben el
crecimiento alrededor del disco con un diámetro de 10−18 mm. Los
demás Streptococos no inhiben si crecimiento.
3.− PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
• Fundamento: El crecimiento de Streptococos pneumoniae se inhibe
por la optoquina, mientras que no afecta a otros Streptococos.
• Reactivos: El m.c. utilizado es agar sangre de cordero o humano y
discos de optoquina.
• Técnica:
1.− Empapar un hisopo con una suspensión de Streptococo, inocular la palca
75
y dejar reposar a temperatura ambiente.
2.− Depositar presionando un disco de optoquina para favorecer el contacto
con el medio (algunos autores consideran importante añadir al disco una gota
de agua destilada para favorecer el crecimiento del halo de inhibición).
3.− Incubar a 35ºC durante 18−24 horas.
• Resultados: El crecimiento de Streptococo pneumoniae queda
inhibido con más de 15 mm de halo de inhibición alrededor del
disco.
NOTA: Si la zona de inhición es menor de 15mm es indispensable confirmar
que es un neumococo con una prueba de solubilidad en bilis.
4.− PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS
• Fundamento: Se basa en la capacidad de determinadas especies (spp)
bacterianas de lisarse en medios con sales biliares. Los más
utilizados son desoxicolato sódico y taurocolato sódico al 2%.
Ambos provocan un descenso en la tensión superficial que unido a la
acción de enzimas autolíticas destruyen las células. El efecto de esta
enzima autolítica se pone de manifiesto sobre colonias viejas de
Streptococo pneumoniae crecidas en medio sólido.
• Técnica:
1.− A 5ml de un cultivo de 24 horas se añade 0.5ml de solución de sales
biliares al 10%.
2.− Agitar la mezcla con cuidado e incubar a 35ºC.
• Resultados: Si antes de 3 horas de incubación se produce
aclaramiento del contenido del tubo se interpreta como soluble en
bilis, tendremos Streptococo pneumoniae. Si permanece turbia se
interpreta como insoluble en bilis por lo que tendremos otros
Streptococos.
NOTA: Es esencial el control del pH, ya que si las condiciones son ácidas se
puede producir un precipitado del desoxicolato.
5.− PRUEBA DEL VOGES PROSKAUER
6.− OTRAS PRUEBAS
7.− APIs
4.− ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
1.− ANTÍGENO DE PARED ESPECÍFICA DE GRUPO
Se trata de un carbohidrato localizado en la pared de muchos Streptococos
que ha permitido una clasificación serológica en los llamados grupos de
LANCEFIED. Esta especificidad serológica de HC específico de grupo viene
determinada por un amino−azúcar, así los Streptococos del:
76
• Grupo A: tienen como amino−azúcar la ramosa N−acetilglucosamina
• Grupo B: tienen como amino−azúcar la ramosa glucosamina
• Grupo C: tienen como amino−azúcar la ramosa
N−acetilgalactosamina
• Grupo D: tienen como amino−azúcar la ramosa ácido glicerolteicoico
• Grupo F: tienen como amino−azúcar el
glucopiranosil−Nacetilgalactosamina
2.− PROTEÍNA M
Se trata de un antígeno proteico que pertenece a la pared celular y constituye
el principal factor de virulencia de Streptococo pyogenes.
Aparece como proyecciones similares a pelos que emergen de la pared y su
presencia io ausencia condiciona la virulencia de las cepas.
En el caso de que no exista en el huésped Ac contra esta proteína, las cepas
de Streptococo pyogenes con proeteína M son capaces de resistir la acción de
los fagocitos polimorfonucleares.
Esta proteína también está implicada en la adherencia a células epiteliales.
Existen más de 80 tipos distintos de estos Ag, por lo que una persona se
puede infectar repetidamente con cepas de Streptococo pyogenes con
distintas proteína M en su pared.
3.− OTROS ANTÍGENOS
Son las sustancias T y R localizadas en la pared celular y nucleoproteínas. En
el Streptococo pneumoniae su presencia en la cápsula polisacárida impide
que sean ingeridos por fagocitos. Además es antigénica de modo que los Ac
frente a la cápsula del pneumococo confieren inmunidad.
Existen más de 80 tipos distintos de Ag capsulares.
5.− CLASIFICACIÓN DE LOS STREPTOCOCOS
(Ver fotocopias tabla 6.3)
En general, los Streptococos se pueden clasificar en función de:
• Comportamiento antigénico frente a distintas pruebas biológicas
• Por el tipo de hemólisis
• Por pruebas bioquímicas.
El resultado es la clasificación en tres grupos importantes:
• hemolíticos: corresponden a distintos grupos denominados con
letras del alfabeto griego
• Grupo D: pueden ser Enterococos y no Enterococos
• Hemolíticos: Se encuentran el Streptococo viridans y Streptococo
pneumoniae.
6.− ENZIMAS Y TOXINAS
77
A.− Toxinas: tienen capacidad antigénica:
• T. Eritrogénica: provoca el exantema de la escarlatina y erisipela. Es
antigénica y da lugar a la formación de una antitoxina específica.
• Hemolisinas o estreptolisina: destruyen los hamatíes y podemos
distinguir dos tipos:
♦ Estreptolisina O: proteína que se inactiva en presencia de
oxigeno. Los anticuerpos dirigidos contra ella se denominan
ASO, ASLO o AEO (serian antiestreptolisina o ). Cuando un
individuo tiene un titulo superior a 250u, sugiere una
infección reciente por Estreptococos.
♦ Estreptolisina S: resistente a la acción del oxigeno. No tiene
acción antigénica.
B.− Enzimas:
• Fibrinolisina o estreptoquinasa: transforma el plasminógeno en
plasmina (sustancia responsable de la lisis de lisina) ha sido utilizada
por vía intravenosa para el tratamiento de embolias y trombosis.
• Hialudinasa: desdobla el ácido hialurónico del tejido conjuntivo,
favoreciendo la diseminación del coco. También induce anticuerpos
específicos. Se ha facilitado para la absorción de medicamentos.
7.− PATOLOGÍA
1.− streptococos pyogenes : del grupo A, produce enfermedad por:
• Invasión de tejidos: es el agente etiológico de la erisipela
(inflamación aguda de la piel con afectación de vasos linfáticos
cutáneos, cursa con fiebre elevada y escalofríos), el área afectada
suele ser la cara y en ocasiones tronco y extremidades.
También puede producir sepsis; la infección puede afectar al recién nacido.
También puede ocasionar celulitis, linfagitis y miositis (mio−músculo).
• Infecciones locales: la fundamental es faringitis, es más benigna en
niños que en adultos. La toxina puede provocar inflamación de
tejidos que bloquean el paso de aire y producir asfixia. También
puede dar lugar a pioderma y procesos de endocarditis, otitis,
meningitis y neumonía.
• Enfermedades postestreptococicas no supurativas: fiebres reumáticas
y glomerulonefritis. Se trata de procesos autoinmunes por reacciones
cruzadas por Acs. dirigidos contra Streptococos que se unen a las
células del riñón y en ocasiones a las del miocardio formando
inmunocomplejos en estos órganos. Estos complejos atraen las
células defensivas del huésped que son las que originan daño. Se
conocen como no supurativas porque en los órganos afectados no se
encuentran presentes los microorganismos ni existen reacciones
inflamatorias.
2.− streptococos agalactiae:
Pertenecen al grupo B de Lancefied. Produce − hemólisis y forma parte de
la flora normal del tracto genitourinario, encontrándose en la vagina de las
mujeres sanas, desde donde pasa al recién nacido en el momento del parto. Es
el agente etiológico más frecuente de sepsis y meningitis neonatal.
78
También se ha visto implicado en osteomielitis, infección del tracto urinario,
heridas, endocarditis y neumonías. Se asocia a infecciones oportunistas.
3.− streptococos del grupo C:
Aparecen como saprofitos en la rinofaringe, tracto gastrointestinal y vagina.
En raras ocasiones puede actuar como patógeno dando lugar a faringitis,
endocarditis, glomerulonefritis, bacteriemia, etc. Pueden provocar sepsis en
el parto.
4.− streptococos viridans
Son saprofitos del tracto respiratorio y gastrointestinal (placa dental,
orofaringe, etc.), sin embargo se les ha considerado como patógenos
oportunistas, siendo la principal causa de endocarditis bacteriana aguda.
Las especies implicadas con mayor frecuencia son:
• S.mutans (principal agente etiológico de la caries dental)
• S.sanguis I, II.
Las especies del grupo viridans también pueden producir abscesos, neumonía
y otras infecciones supurativas.
5.− streptococos neumoniae
Se agrupan en parejas (diplococos) rodeadas de una cápsula, siendo por tanto
inmóviles, capsulada y no esporuladas. Para evidenciar la virulencia del
neumococo se buscan las cápsulas con tinta china o con Acs−anticapsulares
específicos, provocando un precipitado de la cápsula que se denomina
hinchazón de la cápsula o reacción de Quelluns.
Es el agente productor de neumonía neumococica, proceso en el que hay una
reacción de tipo inflamatorio en las áreas pulmonares donde se desarrolla el
germen lo que conlleva una vasodilatación de los capilares de la zona con
salida del plasma, hematíes y leucocitos, lo que supone una solidificación por
coagulación. Clínicamente se presenta con diseña, fiebre, dolor pleural, tos
productiva, edemas y mal estar general.
Su poder patogénico se debe a la capacidad que tiene para multiplicarse en
los tejidos e inducir la reacción produciendo fibrosis, siendo ésta una
reacción de tipo cocatricial producida por el tejido conjuntivo en la zona
afectada en respuesta a un agresión.
También produce sinusitis, otitis, meningitis, etc.
La principal fuente de infección son las gotículas.
6.− streptococos del grupo D
Pueden ser , o hemolíticos, resisten bien los agentes externos, incluso
los antibióticos. Se dividen en :
79
⋅ Enterococos, corresponden a S.fecalis y S.faecium entre otros. Son saprofitos
del intestino del hombre (apareen normalmente en heces, vagina y cavidad
oral). Son agentes etiológicos de endocarditis, bacteriemia, infección del
tracto urinario, SNC, heridas, abscesos intrabdominales. En ocasiones el
origen de infecciones nosocomiales.
⋅ No enterococos, corresponden a S.bovilis, S.equinus que afectan a vacas y
caballos.
7.− DIAGNÓSTICO
• Directo: se emplea agar sangre para ver las hemólisis y
posteriormente se hacen las pruebas bioquímicas.
• Indirecto: a través de estudios serológicos buscando el ASLO
(antiestreptolisina O).
8.− SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA
• Streptococo pyogenes: sensible a penicilina y eritromicina.
• Streptococo agalactiae : sensible a penicilina, ampicilina,
cefalosporina y vancomicina. Los aminoglucoxidos se usan
combinados con la penicilina para el tratamiento de la endocarditis
ya que actúan de forma sinérgica.
• Enterococos: son los Estreptococos más resistentes, presentan
resistencia a cefalosporinas y penicilina, la mayor parte son también
resistentes a las tetraciclinas, aminoglucoxidos, clidamicina,
cloranfenicol y sulfamidas.
Son sensibles a : imipenem, ciprofloxacina y vancomicina.
• Neumococos: el fármaco de elección es la penicilina, aunque existen
cepas resistentes a este antibiótico.
La mayor parte de Streptococos son sensibles a la cefotaxima.
9.− OTROS COCOS GRAM +
• Pediococos y leuconstoc, son catalasa − . Su principal característica
es la resistencia a la vancomicina.
• Lactococus, se usa en la industria lactea y es una especie no
patógena.
• Gemella, produce procesos de endocarditis.
TEMA 14.− COCOS GRAM NEGATIVOS. NEISSERIA Y
BRAHNAMELLA (MORAXELLA).
NEISSERIA
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− CULTIVOS.
3.− CLASIFICACIÓN DE LAS NEISSERIAS
• Neisseria meningitidis.
• Neisseria gonorreae.
• Otras
80
4.− NEISSERIA MENINGITIDIS
• Poder antigénico.
• Patología.
• Epidemiología.
• Toma de muestras.
• Pruebas químicas y serológicas.
• Vacunas y tratamiento.
5.− NEISSERIA GONORREAE:
• Poder antigénico.
• Patología.
• Epidemiología.
• Toma de muestras.
• Pruebas químicas y serológicas.
• Vacunas y tratamiento.
6.− MORAXELLA CATARRHALIS
1.− INTRODUCCIÓN.
Son anaerobios estrictos, se presentan en parejas (diplococos), dentro de los
leucocitos polimorfonucleares con aspecto de riñón o grano de café.
Son inmóviles y pueden presentar cápsula (+ virulentos).
Algunos pueden producir pigmentos de naturaleza carotenoide y color
amarillo.
Bioquímicamente son catalas (+), oxidasa (+) y fermentadores de hidratos de
carbono con producción de ácido sin gas.
Muy importante a tener en cuenta son los métodos serológicos
(inmunofluorescencia, aglutinación, fijación del complemento, precipitación,
ELISA, etc.).
2.− CULTIVOS.
Son aerobios y crecen a temperaturas aproximadas de 37ºC, cesando el
crecimiento por debajo de 30ºC. La adicción al medio de un 5−10% de CO2
favorece el crecimiento.
Es importante tener en cuenta que se inhibe con la presencia de ácidos grasos
y sales presentes en el agar.
Son microorganismos sensibles que no resisten a la desecación ni a la
exposición prolongada a la luz, en estas condiciones elaboran enzimas
autolíticos que conducen a su destrucción.
Existen distintos medios:
• Medios normales de aislamiento: agar sangre y chocolate.
• Medios selectivos: Thayer−Martin, que llevan antibióticos (para
81
destruir otras bacterias gram + y − ) y antifúngicos (para destruir
hongos). También es selectivo el medio New York City (NYC).
Los antibióticos que pueden llevar son: colistina (inhibe bacilos gram −),
vancomicina (inhibe los bacilos gram +), etc.
Hay una modificación de Thayer−Martin que lleva trimetroprim que inhibe
Proteus.
Estas bacterias se localizan en las mucosas de los tractos respiratorio,
digestivo y genitourinario del hombre y los animales.
Únicamente las especies de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorreae se
consideran patógenos para el hombre.
3.− CLASIFICACIÓN DE NEISSERIAS
Se pueden distinguir tres grupos:
Neisseria meningitidis: Producen meningitis y son muy difíciles de cultivar
siendo necesario un medio específico y una temperatura de 35−37ºC. Se
denomina meningococo.
Neisseria gonorreae: Se le denomina gonococo. Son muy exigentes,
requieren cultivos muy específicos y una temperatura de 35−37ºC. En
muchos casos su crecimiento se ve favorecido por un aporte de CO2 del
5−10%.
Neisserias saprofitas: Se encuentran en el aparato genital y en la rinofaringe.
Son microorganismos poco exigentes. Crecen a temperatura de 22−35ºC.
Resisten bien a los agentes externos. Crecen en medios generales. (Ej: N.
subflava, N. lacatamica y N.sicca).
4.− NEISSERIA MENINGITIDIS
A.− PODER ANTIGÉNICO.
El polisacárido capsular producido por N.meningitidis ha conducido a la
clasificación de este microorganismo en 13 serogrupos.
El diagnóstico de N.meningitidis puede realizarse por la detección de los Ag
capsulares en muestras orgánicas (LCR, suero, etc)mediante técnicas de
aglutinación e inmunofluorescencia que transmiten un diagnostico precoz.
El meningococo posee además otros determinantes antigénicos como las
proteínas de membrana, los pilis y liposacáridos (responsables de la mayor
parte del proceso de infección meningocócica).
B.− Patología
El hombre es el único huésped natural para el meningococo.Se encuentra
frecuentemente en la nasofaringe de individuos sanos portadores, los
microorganismos se adhieren a las células faringeas con los pilis.
82
El cuadro clínico comienza con rinofaringitis leve que afecta sobre todo a los
niños, ya que en adultos aparece Ac protectores frente al meningococo. De
esta faringitis leve se evoluciona a una forma más severa pudiendo
complicarse a bronquitis. Si el meningococo pasa a sangre puede dar lugar a
una sepsis meningococica que va acompañada de petequias, cefaleas, fiebres
altas y fracaso suprarrenal dando lugar a un síndrome denominado
Waterhose−Friederichen.
Puede pasar a LCR alcanzando las meninges y provocando meningitis con un
cuadro caracterizado por la rigidez de nuca, cefaleas y vómitos en
escopetazo, fiebre, etc.
El microorganismo meningococo puede producir artritis y con menor
frecuencia neumonía, faringitis y uretritis.
C.− Epidemiología
La meningitis por Neisseria meningitidis suele ocurrir en brotes epidémicos.
Los niños entre 6 − 12 meses y adolescentes son los que se afectan con
mayor frecuencia.
Un individuo puede tener colonizada su nasofaringe por el meningococo y no
desarrollar síntomas ni infecciones (portador).
En periodos interepidemicos de 5 a 30 % de la población puede ser portadora.
En épocas de epidemia los portadores aumentan hasta un 70 − 80 %.
El contagio será por vía aérea, siendo muy importante los factores de
agregación.
D.− Toma de muestra
Podemos hacer:
• Hemocultivo se existe sepsis.
• Frotis faringeo para buscar portadores.
• LCR mediante punción lumbar: Se toman 2 tubos y se transportan
inmediatamente al laboratorio. Se centrifugan los tubos:
⋅ Con el sedimento se realiza un gram o azul de metileno, puede haber cocos
que si son gram (−) será meningitis meningococica y si son gram (+) habrá
que cultivar y hacer la prueba de la catalasa que si es (+) será Staphylococo y
si es (−) meningitis pneumococica (producida por Estreptococo pneumoniae).
Si aparecen bacilos en el gram, si son BAAR indica meningitis tuberculosis
(producida por Micobacterium tuberculosis).
⋅ Con el sobrenadante se estudiara albúminas, Ig así como polisacáridos
capsulares o reacciones inmunológicas. También se pueden observar
polimorfonucleares, glucosa disminuida y cloruros normales o disminuidos.
En personas afectadas por Neisserias meningitis el LCR es turbio, purulento
83
y con abundantes meningococos.
E.− Pruebas bioquímicas y serológicas
• Bioquímicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentación de hidratos de
carbono.
• Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA.
F.− Vacunas y tratamientos
Existen vacunas en caso de epidemias produciendo una inmunidad de grupo.
Las hay frente a los serogrupos A y C pero no contra B que es la que con más
frecuencia origina epidemias.
El antibiótico de elección es la penicilina, en individuos alérgicos a estos se
administra cefalosporina.
El estado de portador no se puede erradicar con penicilina porque ha creado
resistencia, es necesario administrar rifanticina.
Un nuevo antibiótico lactamico distinto de la penicilina y cefalosporina es
el moxalactan, ha dado buenos resultados y se difunde rápidamente por el
LCR.
5.− NEISERIA GONORREAE
A.− Poder antigénico
Es una bacteria con una composición antigénica compleja y capaz de
modificar para eludir la R.I. del huésped.
Entre los componentes antigénicos se encuentran los pilis que permiten
adherirse a las células epiteliales del huésped y evitar la fagocitosis. Posee
también varias proteínas con carácter antigenico:
• Proteína I o POR: forman parte de la superficie dando lugar a la
formación de poros a través de los cuales entra en la célula ciertos
nutrientes.
• Proteína II u OPA: mantiene la adherencia y la ayuda a anclarse en
las células del huésped.
• Proteína III o PMR: se asocian a las proteínas POR para formar los
poros de la superficie celular. Posee liposacáridos con carácter
antigénico y endotóxico.
B.− Patología
Neisseria gonorreae tiene apetencia por las mucosas principalmente por las
urogenitales.
Los cuadros clínicos son:
• Gonorrea o Blenorragia Típica: es una E.T.S. que afecta a la mucosa
urogenital produciendo sudoración purulenta, disuria (dolor en la
micción), puede conllevar a esterilización o estrechecimiento en vías
84
urinarias. Es un microorganismo muy infectivo (con un solo contacto
es posible padecer la enfermedad).
En el varón es mas frecuente la uretritis gonocócica con la denominada dota
matinal o militar.
El periodo de incubación es de 2 − 15 días, la infección puede ascender y dar
cistitis, prostatitis y orquitis, en la mujer puede cursar sintomáticamente,
puede producir uretritis, cistitis, cervititis, endometritis u osferitis, peritonitis,
salpintigitis. Puede llegar a producir esterilidad.
• Enfermedad Gonocócica Atípica: localizada en faringe y región
anorectal.
• Septicemias: mas frecuentes en mujeres sintomáticas caracterizada
por lesión en la piel, Ej.: papulas, pústulas y en extremidades (artritis,
principalmente en tobillos y muñecas).
• Oftalmia neonatal: Puede aparecer en raras. Es una conjuntivitis
purulenta del recién nacido que al pasar por el conducto del parto se
infecta, puede producir ceguera. La prevención hasta hace unos años
era con nitrato de plata, hoy se utilizan colirios de penicilina.
C.− Epidemiología
Es una enfermedad de distribución mundial transmitida casi exclusivamente
por transmisión sexual y principalmente por mujeres portadoras crónicas
asintomáticas.
D.− Toma de muestra
En el hombre la muestra será tomada del pus de la gota matinal. En la mujer
de la mucosa vaginal y del cérvix y en los homosexuales en el recto y uretra.
En septicemias la toma de muestra puede ser sangre y muestra faríngea.
E.− Pruebas bioquímicas y serológicas
Se realizan las mismas pruebas que Neisseria meningitidis.
• Bioquímicas ! catalasa (+), oxidasa (+) y fermentación de hidratos de
carbono.
• Serologicas ! inmunofluorescenia directa y ELISA.
F.− Vacunas y tratamientos
Con penicilina o ampilicilina se crea resistencia, se suele sustituir por
cefalosporinas. Es conveniente administrar simultáneamente cefalosporinas
con tetraciclina o eritomicina, debido a la concomitancia de infecciones
(varias infecciones a la vez por parte de más de un microorganismo) por
Clamidias.
En el neonato la gonococia ocular se trata con nitrato de plata con instilación
en el saco conjuntival. También se puede tratar con antibióticos.
6.− MORAXELLA CATARRHALIS.
85
Se habla de Moraxella o Brahnamella. Es catalasa y oxidasa (+), no
fermentan ningún azúcar, dan positiva la DNAasa, reduce nitratos, lo que la
diferencia de las Neisserias.
Produce la enzima butiratoesterasa y −lactamasa.
Crecen bien en medios habituales como agar sangre y chocolate.
Su temperatura óptima es de 35ºC y la incubación puede hacerse en una
atmósfera con CO2.
Las colonias son blanco grisáceas en agar sangre o chocolate.
Estas bacterias pueden formar parte de la flora normal del tracto respiratorio
superior de individuos sanos. No obstante se ha aislado como patógeno en
ciertas infecciones, como: septicemia, meningitis, endocarditis,y en
infecciones otorrinolaringologicas.
Brahnamella catharralis es responsable del 10−15% de los casos de otitis
media y es un agente etiológico importante de sinusitis. Los individuos más
susceptibles a padecer esta infección son los ancianos y los niños.
Las cepas productoras de −lactamasa se consideran resistentes clínicamente
a la penicilina, ampicilina y amoxicilina (los antibióticos que tienen un
anillo −lactamico esta enzima lo rompe y se hacen resistentes).
Son sensibles a amoxicilina−clavulanico y ampicilina−sulfbactem.
TEMA 15.− COCOBACILOS GRAM NEGATIVO.
Haemophylus
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN.
• Dependencia del factor X y V.
• Pruebas bioquímicas.
• Pruebas serológicas.
3.− HAEMOPHYLUS INFLUENZAE.
• Patología
• Tratamiento.
4.− HAEMOPHYLUS DUCREY.
• Patología
• Tratamiento.
5.− AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.
• Toma de muestras.
• Tinciones.
• Medios de cultivo.
86
• Pruebas bioquímicas y serológicas.
1.− INTRODUCCIÓN.
El género Haemophylus está formado por bacterias gram (−), aerobios y
anaerobios facultativos, inmóviles y no esporulados.
Algunas especies poseen cápsula. Son parásitos obligados del tracto
respiratorio superior del hombre y animales, llegando a constituir hasta un
10% de la flora acompañante de la orofaringe en los individuos sanos.
Las especies del género Haemophylus fermentan los hidratos de carbono con
producción de ácido, producen nitratos y la mayor parte son catalasa y
oxidasa (+) .
El crecimiento viene condicionado por la presencia en el medio de factor V y
X. El factor V a diferencia del X no se encuentra libre en sangre, para
liberarlo deben romperse las células sanguíneas por calentamiento.
Los medios de cultivo son agar sangre y chocolate que deben incubarse a
35−37ºC y en atmósfera de un 5−10% de CO2. También se puede emplear
como medio específico Levinthlal.
2.− CLASIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN.
Existen distintas especies del género Haemophylus, las principales desde el
punto de vista patógeno para el hombre son H. influenzae y H. ducrey.
Para la identificación de las especies nos basamos en:
• Dependencia del factor V y/o X.
• Pruebas bioquímicas. (ver cuadro).
• Pruebas serologicas, aglutinación el látex y prueba de hinchamiento
capsular.
3.− HAEMOPHYLUS INFLUENZAE
a.− Patología
Es una bacteria que parasita exclusivamente al hombre localizándose en el
tracto respiratorio superior. Accede a dicho tracto por inhalación colonizando
las mucosas. Hasta un 80% de personas pueden ser portadoras sin que
desarrollen síntomas clínicos.
Es capsulado (virulento) y se ha observado que la cápsula está formada por
polisacáridos distintos que según sus características se diferencian en 6
serogrupos (a!f). En España es más frecuente la de tipo b.
Este microorganismo es junto al neumococo (Streptococo neumoniae) uno de
los agentes etiológicos más frecuentes de otitis media bacteriana y sinusitis
aguda.
Puede invadir el torrente circulatorio y alcanzar las meninges (produciendo
meningitis) o localizarse en articulaciones (produciendo artritis). Es la causa
87
más frecuente de meningitis en niños menores de 5 años. En recién nacidos
es muy rara la infección ya que poseen Ac maternos frente a este
microorganismo.
También afecta a ancianos y adultos debilitados por procesos gripales.
Ocasionalmente puede producir epiglotitis con obstrucción respiratoria aguda
y un desenlace fatal si no se recurre a traqueotomía.
Este microorganismo está implicado como agente etiológico de neumonía
principalmente en niños y adultos con infección pulmonar o historia de
alcoholismo.
b.− Tratamiento
En ausencia de tratamiento puede ser mortal en el caso de meningitis y
epiglotitis.
El tratamiento de elección son ampicilina y cloranfenicol, aunque
últimamente existen cepas resistentes y se recomiendan las cefalosporinas.
A partir de los 18 meses de vida los niños se pueden vacunar frente a
Haemophylus b.
4.− HAEMOPHYLUS DUCREY
a.− Patología
Es el agente etiológico del chancro blando o chancroide (ETS), caracterizado
por la presencia de úlceras en los genitales y zona perianal.
El periodo de incubación es de 7 días, siendo una enfermedad muy similar a
la sífilis.
b.− Tratamiento
A base de eritromicina.
5.− AISLAMIENTO Y DIÁGNOSTICO BACTERIANO
a.− Toma de muestras
Se realiza en condiciones totalmente asépticas a través de exudados faríngeos
esputo o líquido purulento en caso de infección de las vías respiratorias.
En caso de meningitis se saca LCR por punción lumbar.
b.− Tinciones
Generalmente tinción de gram o tinción negativa para el estudio de la
cápsula.
c.− Medios de Cultivo
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Principalmente agar sangre o agar chocolate a los que añadimos discos con
FV y FX y algún Ab para hacer más selectivo el medio.
d.− Pruebas bioquímicas y serológicas
• Pruebas bioquímicas: (ver cuadro)
• Pruebas serológicas: principalmente pruebas de precipitación y
aglutinación.
Brucella
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.
• Estudio microbiológico:
♦ Toma de muestras.
♦ Pruebas bioquímicas.
• Estudio serológico:
♦ Test de seroaglutinación o de Wright.
♦ Test de Coombs antibrucella.
♦ Test de rosa de bengala.
♦ Prueba de la introdermorreacción con la melitina.
♦ Otras.
• Medios de cultivo.
• Técnicas de cultivo:
♦ Técnica de castañeda.
♦ Técnica de isolator.
3.− EPIDEMIOLOGÍA.
4.− PATOLOGÍA.
5.− TRATAMIENTO.
1.− Introducción y Clasificación
Son cocobacilos gram negativos, inmóviles, no esporulados y aerobios
estrictos. Algunos pueden presentar cápsula.
Se observan agrupados en parejas o en cadenas cortas.
Su temeperatura óptima de crecimiento es 37ºC y algunas especies necesitan
presencia de CO2.
Son catalasa +, la mayoría dan la prueba de la oxidasa +, reducen NO3− y
fermentan escasos HC.
Las especies del género Brucella son parásitos obligados de animales y
algunos producen infección en el hombre.
Son bacterias de largo crecimiento y se destruyen con facilidad son
temperaturas de pasteurización (aprox. 70ºC).
89
2.− AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
No es fácil evidenciar la clínica de la brucelosis, debido a que en muchas
ocasiones y sobre todo al principio de la enfermedad, ésta es difusa (no hay
síntomas claros de brucelosis) siendo necesario los estudios microbiológicos
y serológicos.
a.− Estudio microbiológico
• Toma de muestra: La recogida de muestra de los productos en los
que se sospecha presencia de Brucella son principalmente sangre y
en ocasiones líquidos orgánicos como pus y LCR.
De la muestra de sangre se realiza hemocultivo, de vital importancia ya que
la brucelemia (paso de Brucella a sangre) está presente en las primeras fases
de la brucelosis, sobre todo en manifestaciones febriles, teniendo en cuenta
que un resultado negativo de hemocultivo no excluye en principio la
enfermedad.
• Pruebas bioquímicas: Se realizará al menos la prueba de la catalasa y
oxidasa (+), así como la prueba del indol, gelatina, voges proskauer y
rojo de metilo (−). También se realizan otras pruebas ( ver cuadro
12.3)
b.− Estudio serológico
Las pruebas más importantes son:
• Test de seroaglutinación o test de Wright: Consiste en diluciones
sucesivas del suero problema en el medio que contiene antígeno
purificado específico (el Ag de la Brucella), por lo que los títulos
positivos (aglutinación) indicarán un contacto previo con la Brucella
si este es superior a 1/80. Los títulos de brucelosis en fase aguda
están alrededor de 1/320.
En casos de cronicidad los títulos suelen ser muy bajos e incluso negativos,
ya que en este tipo de pacientes aparecen muchos anticuerpos no aglutinantes
(incompletos) que deberán ser detectados por otras pruebas (test de Coombs).
• Test de Coombs antibrucella: Sirve para detectar anticuerpos
incompletos. Es una técnica muy específica y útil en Brucellas
crónicas. Su negatividad no excluye brucelosis.
• Test de rosa de Bengala: Es una prueba muy rápida de aglutinación y
su negatividad no excluye brucelosis.
• Prueba de la introdermorreacción con la metilina: Consiste en una
inyección intradérmica en el brazo o antebrazo de un filtrado
autolisado con bacterias muertas, pero con efecto antigénico y otra
inyección de carácter intradérmico (testigo calentado a 100ºC) en el
otro brazo, que actúa de control (−). Transcurridas 8 horas se
efectuará la lectura, si la reacción es (+) aparecerá una zona roja y
edematosa de 3 o más cm. de diámetro en el lugar donde se aplicó el
autolisado.
• Otras: fijación del complemento, radioinmunoanálisis, etc.
c.− Medios de cultivo
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La Brucella es un microorganismo intracelular, por lo que necesitan
compuestos nutricionales. Existen muchos medios para el aislamiento de
Brucella:
Medios líquidos: como el caldo tripticasa, el caldo de hígado, caldo de
brucella, etc.
Medios sólidos: como el agar tripticasa, agar de brucella, etc.
Medios selectivos: que contienen antibióticos, como el medio de Kurdas y
Mose, Forwel o Jones−Morgan.
Las colonias de Brucella son pequeñas y transparentes y son de dos tipos
morfológicos:
• Colonias lisas o S: son transparentes y corresponden a cepas
virulentas cuya virulencia corresponde a dos factores virulentos:
factor A y M, que son de naturaleza polisacárida.
• Colonias rugosas o R: no son patógenas.
En la tinción de gram para Brucella se recomienda prolongar el tiempo de
contacto con la safranina y resuspender las colonias sospechosas con una
gota de solución salina fenicada al 1%, depositándolo en el portaobjetos con
el fin de evitar el peligro de contaminación para el personal del laboratorio.
d.− Técnicas de cultivo
Las muestras de sangre se cultivan siguiendo dos técnicas:
• Técnica de Castañeda: Utiliza un medio bifásico (medios que tienen
una fase líquida y otra sólida en un mismo frasco). El medio líquido
permite el enriquecimiento previo de la Brucella y el medio sólido
sirve para la siembra. Esta técnica tiene las siguientes ventajas:
• manipilación sencilla.
• frascos de cierre hermético que dificultan la contaminación.
• los frascos pueden llevar CO2.
• conservación indefinida y transporte cómodo.
El volumen de sangre que se siembra no debe superar el 20% del volumen
del medio. El frasco se incuba a 35−37ºC en posición vertical y a las 48 horas
se inclina para que la fase líquida impregne la fase sólida y se incuba
nuevamente en posición vertical.
El hemocultivo se observa cada 2−3 días hasta un total de 30 días.
• Técnica de Isolator: En un sistema de lisis−centrifugación realizado
en el mismo tubo. La sangre inoculada se lisa por la acción de
detergentes y se somete a concentración por centrifugación. El
sedimento se siembra en medio sólido. Esta técnica tiene como
ventajas:
• lisa las células sanguíneas, por lo que permite una mayor
recuperación de patógenos intracelulares.
• se acorta el tiempo de aislamiento.
• mayor número de resultados positivos.
91
Inconvenientes: la tasa de contaminación es mayor al no tratarse de
incubación en recipientes cerrados, sino en placas de agar.
3.− EPIDEMIOLOGÍA.
La brucelosis es una típica zoonosis en la que el hombre es un huésped
accidental. Las posibles fuentes de contaminación son:
• Contagio directo por:
contacto con animales infectados
inhalación de aerosoles
inoculación
contacto con mucosas principalmente en personas que trabajen con animales
• Contagio indirecto por ingestión de leche y derivados no
pasteurizados.
Es importante destacar el peligro que corre el personal del laboratorio que se
puede infectar por:
• contacto con piel y mucosas.
• inhalación de aerosoles.
• inoculación accidental con agujas contaminadas.
Por ello siempre que se sospeche Brucella hay que extremar las condiciones
de trabajo.
Recomendaciones:
• Trabajar en campana de seguridad.
• Usar ropa protectora.
• No oler ninguna placa de cultivo.
• Tirar directamente las jeringas del hemocultivo al contenedor.
4.− PATOLOGÍA
El periodo de incubación de la Brucella es de 1−6 semanas; en este tiempo la
Brucella se multiplica en el interior de las células en el retículo endoplásmico
y de aquí pasa a sangre y tejidos donde se producen granulomas y abcesos.
Es característico el polimorfismo de la enfermedad y la recaída en los
primeros meses.
Es frecuente que la infección se localice en distintos órganos ( hígado,
músculo, huesos, etc).
La Brucella melitensis causa un acusado neurotropismo (tendencia por SNC).
En humanos las complicaciones más frecuentes es la osteomielitis.
La Brucella es el agente productor de brucelosis, fiebre de malta o fiebres
ondulantes. Comienza con fiebre, debilidad, dolores óseos y sudoración. La
fiebre aumenta por la tarde y disminuye por la noche apareciendo una
92
sudoración con olor a paja mojada..
La enfermedad se disemina por vía linfática alcanzando los ganglios
linfáticos, bazo, hígado y vértebras donde se forman nódulos granulomatosos.
5.− TRATAMIENTO
Dado que se trata de un microorganismo intracelular y las reacidas son
frecuentes, los tratamientos han de ser prolongados principalmente por
tetraciclinas−estreptomicinas. También es útil la rifancitina y la doxiciclina.
En ninos menores de 14 años se usa trimetroprimsulfametoxazol.
Bordetella.
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− CLASIFICACIÓN Y ESPECIES MÁS IMPORTANTES.
3.− AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO.
• Toma de muestras.
• Medios de cultivo.
• Tinciones.
• Pruebas bioquímicas y serológicas.
4.− EPIDEMIOLOGÍA.
5.− PATOLOGÍA.
6.− TRATAMIENTO Y PROFILAXIS.
1.− INTRODUCCIÓN
Es un bacilo gram −, capsulado, móvil o inmóvil, no formador de esporas y
se considera parásito estricto.
Crece en células epiteliales ciliadas del tracto respiratorio.
Son muy sensibles al calor y desecación y sobrevive muy poco fuera del
hombre.
2.− CLASIFICACIÓN Y ESPECIES MÁS IMPORTANTES
La especie más importante es Bordetella pertusis. (ver cuadro 12.4)
3.− AISLAMIENTO Y DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO
a.− Toma de muestras
Se toma en condiciones asépticas con una torunda impregnada en alginato
cálcico a través de esputos o incluso con un escobillón de la zona
nasofaríngea. También se puede tomar la muestra por expectoración en placa
en un medio específico para Bordetella pertusis denominado Bordet−gengou.
93
Las placas se incuban a 35ºC en atmósfera húmeda y CO2 opcional.
Las colonias a los 5−7 días de incubación son pequeñas y de color blanco
perlado (similar a gotas de Hg)
b.− Tinciones
Se realiza tinción de gram, de esporas y de cápsula.
c.− Pruebas bioquímicas y serológicas
• Pruebas bioquímicas: (ver cuadro 12.4)
• Pruebas serológicas: Consiste en la búsqueda de Ac de Bordetella
aglutinante mediante reacciones de precipitado del suero del paciente
con suero específico. Suelen emplear técnicas de ELISA, fijación de
C e inmunofluorescencia. Son muy útiles en la fase terminal de la
fase catarla y paroxística cuando el microorganismo disminuye su
número (en fase precoz es más útil el cultivo).
4.− EPIDEMIOLOGÍA
La enfermedad que produce se denomina tos ferina. El periodo de
incubación es de 7−10 días. La fuente de infección es el enfermo,
generalmente niños menores de 5 años.
Se transmite por vía respiratoria al toser, estornudar, hablar, etc.
5.− PATOLOGÍA
Bordetella pertusi posee una enterotoxina dermonecrótica y estimulante de la
tos. Produce la tos ferina y la enfermedad comienza con un periodo catarral
que dura 1−2 semanas. Es un catarro débil con fiebre y tos muy contagiosa.
Se continúa con periodo paroxístico o espasmódico en el cual tras una
inspiración profunda se producen de 10−12 golpes de tos breves pero
periódicos. Bruscamente se produce una inspiración profunda de carácter
sibilante (silbido) que se asemeja al canto de un gallo (se denomina tos
coqueluchoide).
El tórax queda fijo en inspiración y el niño aparece cianótico volviendo a
producir otra serie de golpes de tos.
El mecanismo de la tos es mixto:
• Central: por acción de la enterotoxina en el centro de la tos
• Periférico: por el esputo viscoso y filante y la compresión de los
bronquios.
Se observa un aumento de linfocitos y también puede estar acompañada de
vómitos.
Puede haber fiebre por asfixia.
En lactantes es frecuetne la apnea (ausencia de respiración), cianosis y
94
estertor (inspiración forzada).
Los niños mayores o adultos inmunizados presentan solamente síntomas
catarrales o ligera bronquitis.
6.− TRATAMIENTO Y PROFILAXIS
• Tratamiento: a base de eritromicina. La administración de antibiótico
en la fase previa catarral erradica los microorganismos. Cuando la
enfermedad ha entrado en su fase paroxística la administración de
antibiótico no bloquea el progreso de la misma. Se recomienda
entonces la oxigenoterapia para evitar lesiones cerebrales.
• Profilaxis: durante el primer año de vida se debe vacunar a los niños
frente a Bordetella Pertussi, se administra la vacuna DTT (Difteria,
Tétanos y Tos ferina).
Francisella tularensis.
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
• Toma de muestras.
• Estudios microbiológicos y serológicos.
3.− PATOLOGÍA.
4.− TRATAMIENTO.
1.− Introducción
Es un cocobacilo gram − aerobio y anaerobio facultativo y no esporulado,
responsable de una enfermedad zoonótica llamada Tularemia. Forma parte
de la flora orofaringea normal de un gran número de animales salvajes, desde
donde pasa al hombre por varias vías:
• Contacto con cadáveres de animales infectados.
• Inhalación de aerosoles.
• Ingestión de carne contaminada.
• Picaduras de moscas, mosquitos y garrapatas que actúan de vectores
de las bacterias.
2.− Aislamiento y características bioquímicas
• Toma de muestras ! la toma de sangre se realiza de las heridas,
esputo y sangre.
• Estudios serologicos y microbiológicos ! en cuanto a los estudios
microbiológicos: tinción de gram y tinción de fluorescencia.
• Medio de cultivo ! Thaller − Martin y agar sangre enriquecidos con
glucosa y cisteína a 37º.
• Pruebas bioquímicas: catalasa − y producción de sulfhídrico.
• Pruebas serologicas: pruebas de aglutinación y test de
introdermoreacción en la piel.
3.− Patología
95
Tiene un periodo de incubación de 3−4 días. El paciente tiene fiebre,
escalofríos, dolor de cabeza y linfoadenopatias. La forma mas común de la
enfermedad es la Tularemia ulceroglandular, en la que se observa una lesión
localizada en la puerta de entrada de las bacterias menos habituales, son las
Tularemias Oculo−Glandular y Orofaríngea asociado a infecciones en ojos y
faringe.
Si la infección se produce por inhalación de aerosoles se verán afectados los
pulmones dando lugar a Tularemia Pulmonar.
La ingestión de carne contaminada dará lugar a Tularemia Tifoidal (infección
sistémica con alta tasa de mortalidad).
4.− Tratamiento
Principalmente estreptomicina.
Pasteurella.
1.− INTRODUCCIÓN.
2.− ESPECIES MÁS IMPORTANTES.
3.− PATOLOGÍA.
4.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
1.− Introducción
Son cocobacilos gram − no esporulados, anaerobios facultativos capsulados y
patógenos para algunos hombres y algunos animales.
2.− Especies mas importantes
Existen seis especies siendo la más importante Pasteurella Multocida.
3.− Patología
Tiene una estructura capsular de acción enterotoxica dando un efecto
virulento principalmente en infecciones locales afectando a la piel.
El foco de infección es a través de las heridas, de aquí pasa s sangre
ocasionando bacteriemia, a veces en enfermedades crónicas de origen
pulmonar se han observado sobre infecciones originando cuadros de
neumonía.
También se ha visto implicada en Meningitis.
4.− Aislamiento y características bioquímicas
• Toma de muestra: de heridas
• Tinciones: gram principalmente
96
• Medio de cultivo: agar sangre dando colonias pequeñas y traslucidos
que desprenden olor a champiñón.
• Pruebas bioquímicas: oxidasa, catalasa, Indol, nitratos +. Las
colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas.
• Pruebas serologicas: aglutinación.
• Tratamiento: penicilina.
KINGELLA
Cocobacilo gram − forma parte de la flora normal de la orofaringe del
hombre y rara vez produce daño en este.
Se ha aislado en bacteriemia y en lesiones de piel y huesos.
El tratamiento: penicilina, gentamicina y cloranfenicol.
ACTINOBACILLUS
Son cocobacilos gram − inmóviles y oxidasa +, forman parte de la flora oral
habitual de un gran numero de animales domésticos.
El hombre se infecta por inoculación de esta bacteria generalmente por
mordeduras.
Una de las especies más importantes es Actinobacillus
Actinomycetemcomitans, se le ha asociado a peridontitis destructiva de los
adolescentes. Se considera patógeno oportunista y es sensible a la penicilina.
TEMA 16.− BACILOS Y COCOBACILOS GRAM POSITIVOS
1.− BACILLUS
⋅ Introducción
⋅ Especies más importantes
• Bacillus anthracis
♦ Epidemiología
♦ Patología
◊ Carbunco cutáneo
◊ Carbunco pulmonar
◊ Carbunco intestinal
♦ Aislamiento y características bioquímicas
◊ Toma de muestra
◊ Tinción
◊ Medios de Cultivo
◊ Pruebas biquímicas
◊ Pruebas serológicas
♦ Tratamiento
◊ Bacillus cereus (intoxicación alimentaria)
2.− LISTERIA
♦ Listeria monocitogenes
◊ Introducción
◊ Patología
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◊ Aislamiento y características bioquímicas
⋅ Toma de muestra
⋅ Tinciones
⋅ Medios de cultivo
⋅ Pruebas bioquímicas
⋅ Pruebas serológicas
◊ Tratamiento
3.− Corynebacterium
⋅ Introducción
⋅ Especies más importantes !
Corynebacterium difteriae
⋅ Patología y profilaxis
⋅ Aislamiento y características bioquímicas
⋅ Tratamiento
4.− OTROS
⋅ Erysipelothrix rhusiopathiae
⋅ Kurthia
⋅ Lactobacillus
1.− BACILLUS
A.− INTRODUCCIÓN
La familia Bacillaceae comprende los géneros
Bacillus y Clostridium que son bacilos gram (+)
formadores de esporas (Clostridium lo estudiaremos
en un capítulo aparte de anaerobios).
El género Bacillus comprende numerosas especies
ampliamente distribuidas en la naturaleza pero sólo
unas pocas tienen importancia patológica, entre ellas
destaca B.cereus y B. Anthracis.
Se caracteriza por crecer la mayor parte a 37ºC en
medios generales. Son aerobios y facultativos
(pueden crecer en condiciones anaerobias) y
esporulados.
B.− ESPECIES MÁS IMPORTANTES
Bacillus anthracis
⋅ Epidemiología: Es una zoonosis
principalmente siendo una enfermedad
profesional de pastores, veterinarios,
mataderos, etc. El germen entra a través de
rasguños, heridas, inhalaciones, etc.
⋅ Patología: Es el microorganismo causante
del Carbunco o Ántrax; hoy en día no se
suele dar en países industrializados pero sí
98
en subdesarrollados.
En un bacilo gram (+) que se agrupa en parejas o
cadenas, con bordes cortantes, con aspecto de tiza o
caña de bambú, capsulado, esporulado e inmóvil.
Se puede transmitir por inhalación por lo que se
deberá realizar un aislamiento.
Forma una exotoxina de carácter proteico con una
acción muy tóxica y junto a presencia de cápsula
proporciona a estas bacterias propiedades
antifagocitarias.
El carbunco humano tiene lugar tras el primer
contacto con animales infectados que tras un periodo
de incubación de 2−3 días da lugar a:
Carbunco cutáneo o Pústula maligna: El poder
patógeno se debe a la exotoxina que da lugar a una
pápula que se transforma en vesícula luego en
pústula y posteriormente en úlcera necrótica cubierta
por una costra negra; a partir de ésta se propaga por
vía linfática provocando linfagitis y septicemia. Los
más habitual son formas benignas que se curan con
facilidad tras un tratamiento adecuado.
Carbunco pulmonar: Cursa con edema pulmonar u
pulmonía debido a la inhalación de polvo
contaminado con esporas. También se le denomina
como la enfermedad de los cardadores de lana.
Carbunco intestinal: Conlleva dolor abdominal,
vómitos, diarreas, etc debido a la ingestión de
alimentos contaminados. Es la más rara y grave.
⋅ Aislamiento y características bioquímicas:
• Toma de muestra: se coge a partir de
la pústula o también del esputo. Se
realizara un hemocultivo
(septicemia).
• Tinciones: gram, esporas y cápsula.
• Medio de cultivo: medios generales
como sangre, dando lugar a colonias
grandes en forma de melenas de
león o cabezas de medusas.
• Pruebas bioquímicas: (esquema,
fotocopias: tabla 10.1 y 10.2)
• Pruebas serologicas:
inmunofluorescencia
• Prueba de la Antracina: Es una
prueba de introdermoreaacion, la
cual será positiva si da una reacción
99
eritomatosa de al menos 8 ml de
diámetro a las 24 h.
⋅ Tratamiento: Penicilina y alternativamente
tetraciclina, cefalosporina, cloranfenicol y
aminoglucosidos.
BACILLUS CEREUS
Agente capaz de producir toxiinfecciones mediante
el aislamiento en alimentos y heces del paciente.
Es resistente a los beta−lactamicos, y sensibles a los
aminoglucosidos, vancomicina y clindamicina.
2.− LISTERIA
Existen 8 especies siendo la más importante Listeria
monocitogenes.
A.− PATOLOGÍA
Se han descrito una gran variedad de
manifestaciones clínicas, entre ellas, las importantes
son: sepsis o meningitis neonatal, sepsis o meningitis
en pacientes inmunodeprimidos (particularmente en
transplantados de riñón) y sepsis puerperal (después
del parto) o enfermedad gripal en la gestación.
Se ha observado que se desarrolla en personas que
tienen bajas las defensas pudiendo producir la
muerte.
Listeria monocitogenes es capaz de crecer en el
interior de las células del sistema retículo endotelial
lo que le permite vivir en macrófagos confiriéndole
una extraordinaria resistencia frente a agentes
antibacterianos(Ab). Además este mecanismo le va a
facilitar su diseminación.
Posee una estructura antigénica específica
correspondiente a Ag flagelares (Ag H) y Ag
somáticos (Ag O).
B.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
⋅ Toma de muestra: Sangre, LCR, esputo, etc.
⋅ Tinción: Gram
⋅ Medios de Cultivo: Medios enriquecidos con
ambiente microaerófilo (10% de CO2) a
37−42ºC. Se puede sembrar en agar sangre
para conocer su grado de hemólisis. Listeria
nopresenta ni cápsula ni esporas, pero sí
100
flagelos en disposición peritrítica. Su
distribución es ubicua (en todas las partes,
agua, tierra, ser humano, aire, etc) y se ha
aislado asociado a numerosas enfermedades
de peces, mamíferos, plantas, etc.
⋅ Pruebas bioquímicas: Catalasa, ONPG,
esculina (+); oxidasa, coagulasa,
decarboxilasa, ureasa (−); movilidad (+) a
22ºC. (ver cuadro 10.2)
⋅ Pruebas serológicas: Principalmente pruebas
de aglutinación en el que se evaluará el
título de las aglutininas H de las muestras
del suero del paciente. También se realizan
técnicas de fijación de C' cuyo título se da
como positivo a partir de 1/10. También
técnicas de inmunoprecipitación,
inmunofluorescencia, test de alergia por
introdermoreacción, etc.
C.− TRATAMIENTO
Principalmente ampicilina y eritromicina.
3.− CORYNEBACTERIUM
A.− INTRODUCCIÓN Y ESPECIES MÁS
IMPORTANTES
Comprende un grupo de cocobacilos gram positivos,
no esporulados, generalmente inmóviles y pueden
contener gránulos metacromáticos que se tiñen
irregularmente. Son pleomórficos y lo más
característico es que adoptan una posición en
empalizada o letras chinas.
Están muy distribuidos en la naturaleza y forman
parte de la flora normal del hombre; algunos autores
los denominan difteromorfos.
Son erobios facultativos o microarófilos. La especie
más represantiva es Corynebacterium difteriae que
junto con Corynebacterium ulcerans y
Corynebacterium pseudotuberculosis son los únicos
que pueden producir toxinas o ser patógenos. Las
demás especies son patógenos oportunistas.
B.− PATOLOGÍA Y PROFILAXIS
El Corynebacterium difteriae produce la difteria que
es una enfermedad infecciosa aguda causada por
cepas que producen toxinas.
La vía de entrada es la mucosa respiratoria donde se
101
multiplica y produce la exotoxina que causa necrosis
en los tejidos vecinos provocando una respuesta
inflamatoria con formación de la pseudomembrana
diftérica.
La toxina puede afectar al corazón y nervios
periféricos. El periodo de incubación es de 3−5 días
y teniendo en cuenta el punto de entrada se produce
faringitis o amigdalitis con fiebre y/o diseña
(dificultad respiratoria). Esto se debe a la
pseudomembrana que provoca una obstrucción de
las vías aéreas produciéndose un edema (hinchazón
por retención de líquidos) localizado en el cuello,
denominado cuello de toro, provocando un
taponamiento de las vías respiratorias que puede
llevar a la asfixia lo que se denomina crup diftético.
Si hay una difusión de la toxina se pueden producir
alteraciones hepáticas, renales,etc.
Su efecto patógeno se encuentra directamente
relacionado con dos tipos de Ag:
⋅ Ag O: es un polisacárido termoresistente y
responsable de reacciones cruzadas con
micobacterias.
⋅ Ag K: es un Ag proteico sensible a la Tª y
responsable de da la reacción de
hipersensibilidad.
Otros factores de patogenocidad:
⋅ Hialurodinasa: causa la infección sobre las
células.
⋅ Exotoxina
⋅ Glicoliticos: muy toxico y causa muerte
celular.
En cuanto a la profilaxis: la vacuna DTT.
C.− Aislamiento y características bioquímicas
⋅ Toma de muestra: vías respiratorias.
⋅ Tincones: gram, corpúsculos metacromáicos.
⋅ Medio de cultivo: Loeffler que da colonias
grisáceas pequeñas con bordes irregulares.
⋅ Pruebas bioquímicas: (ver tabla 10.3)
⋅ Prueba de la Toxigenicidad: Puede realizarse
in vivo o in vitro.
• In vivo ! se inyecta
introperitonalmente una suspensión
con el corinebacterium difteriae a un
animal de experimentación (cobaya)
y a un control al que se le inyecta
102
además antitoxina difterica, al cabo
de 2 días si la cepa de la suspensión
fuese toxígena se producirá una
infección.
• In vitro ! se lleva a abo por medio de
un test de inmunodifusion radial en
placa, la prueba será positiva si
aparece el precipitado en el pocillo.
D.− Tratamiento
Penicilina y eritromicina.
4.− OTROS
Erysipelothrix Rhusiopathiae
Solo tiene una especie, es muy frecuente como
patógeno en los cerdos y otros animales. Produce la
Erisipela Porcina. En el hombre puede producir una
lesión inflamatoria en la piel que generalmente
afecta a manos y a dedos que se denomina
Erysipeloide.
Las lesiones presentan un borde eritomatoso elevado
y puede complicarse con septicemia y endocarditis.
La adquisición en el hombre esta vinculado con
contactos de tejidos animales: matarife, carniceros,
pescadores, pescaderos, etc. aunque también puede
estar presente en suelos contaminados.
Diagnostico: muestra de biopsias de las lesiones de
la piel y hemocultivos. Crece bien en los medios
habituales (agar sangre, chocolate). La característica
mas llamativa es la producción de sulfhídrico en el
medio TSI (triple sugar iron) hay que relacionarlo
con el Kligler.
Características bioquímicas: catalasa negativa,
oxidasa negativa, movilidad negativa, sulfhídrico
positiva, nitratos negativa, glucosa positiva, lactosa
positiva, xilosa negativa, manitol negativa, sacarosa
negativa.
Kurthia
Lactobacillus
Son bacilos gram positivos, pleomórficos,
normalmente inmóviles, microaerófilos y catalasa
negativos. Reciben este nombre porque el producto
principal de su metabolismo es el ácido láctico.
Destacan algunas especies como el bacilo de
103
Doderleim presente en la flora vaginal.
Otras especies forman parte de la flora intestinal
como el Lactobacillus acidofilus. Especialmente se
ha aislado en casos de neumonía, sepsis o infección
del tracto urinario. Son sensibles a muchos
betalactámicos.
TEMA.− 17 MICOBACTERIUM Y
ACTINOMICETOS
1.− Introducción.
2.− Micobacterium
◊ Introducción.
◊ Procesamiento de las muestras para el estudio de
micobacterias.
◊ Aislamiento y características bioquímicas.
◊ Realización de baciloscopias.
◊ Patogenicidad.
◊ Especies más importantes: M.tuberculosis y M.
Leprae.
3.− Micobacterim tuberculosis
3.1 Patología.
3.2 Epidemiología.
3.3 Prueba de la tuberculina.
3.4 Tratamiento.
4.− Micobacterium leprae
4.1 Patología: lepra tuberculoide y lepra
lepromatosa.
4.2 Epidemiologia.
4.3 Prueba de la lepromina o mitsuda.
4.4 Toma de muestras.
4.5 Tratamiento.
5.− Actinomicetos
5.1 Introducción.
5.2 Especies más importantes.
104
5.3 Aislamiento y características bioquímicas.
5.4 Patología.
5.5 Tratamiento.
1.− Introducción
De acuerdo con la última edición del manual de
Bergey`s Micobacterium se encuentra en la sección
17 dentro de los Actinomicetes, el orden
actinomiceto presenta ocho familias de las que dos
resultan importantes para el ser humano por su
interés clínico:
⋅ Micobacteriaceae.
⋅ Nocardiaceae.
2.− Micobacterium
2.1.− Introducción
Los Micobacterium son bacilos rectos o ligeramente
curvados de 0.2− 0.6 m, son aerobios, inmóviles y
no esporulados. Siendo típico de estos
microorganismos la pared, ya que se encuentra
altamente enriquecida por ácidos micólicos y en
general componentes céreos, de tal forma que para
su coloración se necesitan colorantes de alta
capacidad tintorial así como calor para facilitar su
penetración ya que este tipo de microorganismos se
tiñen muy difícilmente. Una vez teñidos son
altamente resistentes a la decoloración ácida, por
todo ello son llamados BAAR, que es la principal
diferencia con los demás microorganismos.
La presencia de estos componentes en la pared
ofrecen a las micobacterias resistencia a la
desecación y acción de decolorante, desinfectante y
de agentes antibacterianos.
Así el colorante verde malaquita y el antibiótico
penicilina se emplean en medios habituales de
aislamiento de Micobacterium.
Son gérmenes muy distribuidos en la naturaleza,
pueden ser saprófitos del agua, suelo, etc. , incluso
afectar al hombre causando infecciones graves y en
ocasiones crónicas como la lepra.
De las 57 especies que se conocen al menos 25 se
han aislado en infecciones del hombre.
105
Se tiñen difícilmente con gram pero cuando lo hacen
responden a gram + , aunque su principal
característica es su capacidad BAAR.
Las micobacterias se pueden clasificar :
⋅ Atendiendo a su velocidad de crecimiento.
⋅ Morfología colonial.
⋅ Y a la propiedad de desarrollar pigmentos de
naturaleza carotenoide en determinadas
condiciones.
Según estos puntos Runyon dio los siguientes
grupos:
⋅ Micobacterium fotocromógenos: desarrollan
color cuando se exponen a la luz (pigmento
amarillo−anaranjado)
⋅ Micobacterium escotocromógenos:
desarrollan color en la oscuridad.
⋅ Micobacterium no cromógenos: de
crecimiento lento ( más de 1 semana).
⋅ Micobacterium crecedores rápidos: (menos
de 7 días)
Posteriormente se vio que esta clasificación no era
perfecta puesto que existen micobacterias que
pueden clasificarse en más de un grupo.
Otros autores realizan otra clasificación dividiendo a
las micobacterias en dos grupos importantes:
⋅ Bacilos de Micobacterium cultivables en
medios artificiales, con crecimiento más
bien lento y que en función de su cuadro
clínico que producen en el hombre se
dividen en:
⋅ Especies que producen tuberculosis en el
hombre y animales (Micobacterium
tubercolisis y Micobacterium bovis)
⋅ Especies de micobacterias atípicas de
crecimiento muy lento y que pueden
presentar un poder patógeno en el hombre
distinto de tuberculosis y lepra.
◊ Bacilos de Micobacterium no cultivables en medios
artificiales y patógenos para el hombre
(Micobacterium leprae)
2.2.− PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
PARA EL ESTUDIO DE MICOBACTERIAS
La mayor parte de las muestras que se procesan para
micobacterias proceden del tracto respiratorio
(esputos, líquido pleural, broncoaspirado), orina,
106
LCR, biopsias, etc.
El procesamiento de muestras requiere un paso
inicial que es una concentración por medio de
centrifugación (muestras más peligrosas). La mayor
parte de las muestras contaminadas por flora
acompañante que crece más rápido que las
micobacterias puede inhibir el desarrollo de éstas,
por ello las muestras deben ser sometidas a un
proceso de homogenización−descontaminación
previo a las siembra.
La homogenización de esputo es necesario para
fluidificar la muestra, normalmente muy mucosa,
para ello se utilizan mucolíticos como
N−acetilcisteína o el detergente lauril−sulfatosódico.
La descontaminación se lleva a cabo con ácido o
álcalis, a pesar de que las micobacterias son muy
resistentes a estos agentes únicamente sobreviven de
un 10−20% de la población inicial. El tiempo de
contacto de NaOH no debe ser mayor a 15 minutos.
Los líquidos estériles cono el LCR no necesitan del
proceso de homogenización ni descontaminación y
pueden sembrarse directamente.
El proceso de descontaminación se lleva a cabo en
cabinas de seguridad.
2.3.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
⋅ Toma de Muestras: esputo, LCR,
broncoaspirado, etc.
⋅ Tinciones: principalmente Ziehl−Nielsen y
Auramina−Rodamina.
⋅ Medios de Cultivo: Lowenstein−Jensen que
contiene huevo y verde malaquita y
antibióticos, como penicilina, para inhibir el
crecimiento de otros microorganismos.
Miedlebrook
Hoy se utilizan medios de cultivo radiométricos
siendo el más utilizado Bactec−TB. Este sistema
contiene un medio liquido de soporte de crecimiento
de micobacterias suplementado con Ab y que
contiene un sustrato marcado con C14. Las
micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y
liberan CO2 marcado radiactivamente que puede ser
detectado. La principal ventaja de este método es el
acortamiento del tiempo de crecimiento de
107
micobacterias.
Cuando se emplean medios de cultivo
convencionales deben cultivarse a 35ºC en oscuridad
y en atmósfera húmeda con 5−10% de CO2 durante
1 semana, y después se pone a atmósfera normal.
⋅ Pruebas bioquímicas: Test de la niacina,
reducción de nitratos, catalasa, hidrólisis de
Tween 80, test de la arilsulfatasa, reducción
de telurito e inhibición del crecimiento por la
hidracida del ácido tiofeno2−carboxílico.
Hoy en día se han desarrollado nuevas
técnicas que permiten la determinación de
especies en pocas horas. Las más empleadas
son: técnicas de sondas genéticas de ADN y
análisis cromatográfico de lípidos de la
pared celular.
⋅ Pruebas serológicas: principalmente
precipitación, aglutinación, fijación de
complemento.
2.4.− REALIZACIÓN DE BACILOSCOPIAS
Una vez recogida la muestra debe hacerse un
proceso de concentración−descontaminación y una
tinción BAAR.
El hallazgo de BAAR en un frotis no es diagnóstico
definitivo de infección bacteriana pero permite:
◊ Un diagnóstico de presunción de tuberculosis.
◊ Seguimiento del paciente que está siendo tratado con
antituberculosos, pudiéndose saber cuando la
baciloscopia de vuelve negativa.
Para la realización de la extensión se recoge una
mínima parte de esputo y cubrirá las 2/3 partes de la
superficie, no deben ser gruesas pues dificultarían la
visión.
Cuando se observa una tinción de Ziehl−Nielsen se
recomienda hacer una valoración cuantitativa de los
bacilos presentes en la muestra. El objetivo se debe
colocar en un extremo de la preparación y se recorre
toda una línea. Si se observan aproximadamente 100
campos se cuentan los BAAR encontrados. Si se han
visto 50 BAAR no es necesario continuar y se
informa como 50/1L (50 bacilos en una línea del
porta). Si el número está entre 10 y 50 se informa
con X/1L, siendo X el número de bacilos contados.
Si el número de bacilos es menor de 10, habrá que
observar 2 líneas más, un total de 300 campos,
108
expresándose el número de BAAR como X/3L. Otra
de comunicar la información es por
semicuantificación (sistema de cruces).
El examen microscópico es subjetivo y el
microscopista que carece de experiencia puede
cometer errores, por lo que es necesario conocer las
causas más frecuentes de los falsos positivos y
negativos:
⋅ Falsos positivos:
• Restos de comida en esputo
• Fibras de algodón
• Ralladura del porta
• Precipitados de colorante
⋅ Falsos negativos:
• Mala realización del frotis ( grueso,
no haber cogido la zona más
purulenta, mala fijación, mala
decoloración)
• Fallo del microscopista
2.5.− PATOGENICIDAD
Los bacilos tuberculosos virulentos contienen una
serie de componentes celulares que dañan los tejidos
del huésped. Son ceras, fosfolípidos, proteínas,
polisacáridos y ácidos glucólicos.
También producen factores tóxicos como cera−D y
factor cord (denominado factor cuerda o cuerda
serpentina, ya que al microscopio tiene disposición
de largas cuerdas) cuya presencia está relacionado
con la virulencia.
3.− MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS
3.1.− PATOLOGÍA
Es un bacilo denominado Bacilo de Koch. Es capaz
de crecer en el interior de las células
retículo−endoteliales sin ser destruidas.
Llega al organismo por inhalación aunque
excepcionalmente por ingestión de alimentos
contaminados o heridas en la piel. Tras una única
exposición es menor el riesgo de desarrollar la
infección (3−5%), siendo necesarias exposiciones
repetidas para que aumente esta probabilidad junto
con una inmunidad deteriorada por parte del
huésped.
Cuando el M.tuberculosis llega al huésped por
109
inhalación produce una infección primaria o
primoinfección tuberculosa que actúa sobre el
pulmón y más concretamente a nivel de los alvéolos
provocando una intensa reacción inflamatoria que
produce exudación. Estos bacilos pueden llegar a los
vasos linfáticos, ganglios y retornar a la circulación
venosa originando focos metatásicos en distintos
órganos.
Si no hay tratamiento a tiempo el tubérculo que se
origina en el pulmón se va desarrollando
evolucionando a necrosis caseosa (masa amorfa y
homogénea generalmente debida a proteínas
coaguladas formada por estructura de tejidos en
descomposición; es similar a un queso en su
aspecto). El tubérculo que se forma está constituido
en su parte central por células gigantes en cuyo
interior se encuentran los bacilos, una parte
intermedia de carácter epitelial y con apenas bacilos
y una parte periférica que contiene abundantes
linfocitos, monocitos y bacilos tuberculosos. Esto va
acompañado de fiebre, sudoración nocturna,
adelgazamiento, tos con esputos purulentos y en
fases avanzadas hemoptisis (expulsión de sangre por
la boca procedente de las vías respiratorias bajas).
Además de la lesión primaria también podemos
hablar de tuberculosis post−primaria o reacción
secundaria que ocurre tras una reactivación de la
lesión primaria.
Histológicamente hablamos de que micobacterium
puede producir dos tipos de lesiones:
⋅ Exudativas: son propias de la etapa inicial
apareciendo lesión inflamatoria aguda con
edema y acumulación de polimorfonucleares
alrededor del bacilo tuberculoso. El cuadro
se asemeja a la neumonía. Puede curar
espontáneamente, producir necrosis tisular p
evolucionar hacia una lesión productiva.
⋅ Lesión productiva granulomatosa: consiste
en un granuloma crónico formado en la zona
central por células gigantes y bacilos, una
zona intermedia de carácter epitelial y zona
periférica con linfocitos y macrófagos.
3.2.− EPIDEMIOLOGÍA
Se difunde por las gotículas y esputos de individuos
y animales, también por contaminación de alimentos
(tuberculosis intestinal) y por heridas.
110
Los bacilos pueden sobrevivir hasta 6 semanas en
esputos y se destruyen a la luz solar en poco tiempo.
Su mayor incidencia está en grupos sociales de bajo
nivel, malnutridos y sin condiciones higiénicas.
La tuberculosis es una enfermedad importante a
nivel en países subdesarrollados y en grupos
marginados de países industrializados. El
M.tuberculosis produce cada año de 5−8 millones de
nuevos casos, siendo el responsable de 2−3 millones
de muertes en el mundo.
En el M.tuberculosis la fuente de infección es el
hombre a nivel del tracto respiratorio; en el caso de
M. Bovis la vía de entrada es respiratoria por la tos
de la vaca o por ingestión de la leche no pasteurizada
o de la carne procedente de una vaca tuberculosa.
La tuberculosis afecta principalmente a las personas
inmunideprimidas: alcoholicos, ancianos,
drogadictos, pacientes con SIDA.
3.3.− PRUEBA DE LA TUBERCULINA
Permite diferenciar entre individuos infectados y no
infectados.
⋅ Prueba positiva: indica que el individuo ha
estado en contacto con M.tuberculosis y es
portador de micobacterium en los tejidos. No
implica que exista infección activa en ese
momento pero existe el riesgo de adquirir la
enfermedad por reactivación de dicho foco
primario.
⋅ Prueba negativa: no se corre el riesgo de
reactividad.
A la prueba de la tuberculina también se le llama
prueba de Mantoux, que consiste en una inyección
intradérmica de DPP (derivado proteico purificado);
a las 48−72 horas se mide el grado de induración de
la zona. Tradicionalmente se consideraba positivo
cuando el diámetro es mayor o igual a 10 mm.
Actualmente se siguen las siguientes pautas para
considerara positivo el test:
⋅ Diámetro " 10 mm en pacientes menores de
35 años.
⋅ Diámetro " 15 mm en pacientes de 35 años o
más.
⋅ Diámetro " 5 mm en individuos en contacto
con pacientes tuberculosos e infectados con
111
VIH.
3.4.− TRATAMIENTO
Los fármacos antituberculosos que se usan
normalmente son isoniazida, etanbutol,
rifampicina y estreptomicina. Para evitar la
aparición de resistencia se lleva a cabo la politerapia.
Los tratamientos son largos, de 6−12 meses, ya que
las bacterias son muy resistentes a agentes
terapéuticos; no se debe olvidar que son
microorganismos intracelulares y que el acceso del
antibiótico se dificulta la propia composición
caseosa de las lesiones tuberculosas.
Las micobacterias que producen lesiones cutáneas se
tratan con cirugía. Las infecciones por otras
micobacterias distintas de tuberculosis se denominan
micobacteriosis.
4.− MICOBACTERIUM LEPRAE
4.1.− PATOLOGÍA
Agente etiológico de la lepra. Se trata de una especie
que no se puede cultivar en el laboratorio por lo que
se conoce muy poco sus características
microbiológicas. Se ha observado que el único
reservorio es el hombre con auténtica predilección
por las terminaciones nerviosas.
Son BAR aislados en parejas o masas, se pueden
inocular en animales siendo el armadillo la especie
más receptora. Sí existen pruebas serológicas para la
lepra.
Es un bacilo inmóvil, rectilíneo, que se encuentra en
la mucosa nasal, dermis y biopsias de lesiones de
individuos con lepra.
Son bacilos no esporulados, no flagelados ni
capsulados. En el hombre da lugar a la lepra que es
una enfermedad caracterizada por lesiones
granulomatosas crónicas. Es de lenta evolución que
ocasiona lesiones desfigurantes y mutilantes en las
zonas más frías del cuerpo ya que el bacilo posee
gran afinidad por el tejido cutáneo y nervioso.
Aparecen maculas pálidas y nódulos grandes
llamados lepromas acompañados de anestesia local.
La afección de la cara da lugar a la caída de la cola
de la ceja y a la destrucción del tabique nasal, es lo
112
que se denomina facies leonina o cara de león. La
lepra se puede manifestar de dos formas:
⋅ Lepra tuberuloide: de evolución benigna y
con tendencia a quedar latente con maculas
cutáneas, grave afectación nerviosa y prueba
de la lepromina positiva.
⋅ Lepra lepromatosa: de curso maligno con
aparición de nódulos cutáneos, amputación y
prueba de la lepromina negativa.
4.2.− Epidemiología
Generalmente se necesitan más de un contacto con
enfermos de lepra activa. El material mas infeccioso
son las secreciones nasales y el periodo de
incubación es de 2−6 años. Es una enfermedad
difícilmente de determinar por su elevado periodo de
incubación. Su periodo de invasión es poco
específico y con síntomas raros no asociables a la
lepra. A veces se presenta picor, hormigueo, perdida
de la sensibilidad en manos y pies y a partir de aquí
de forma lenta y progresiva lesiones cutáneas. Suele
durar toda la vida y su evolución más o menos grave
dependerá del grado de inmunidad del huésped.
4.3.− Prueba de la lepromina o Mitsuda
Existe una prueba que indica el estado inmune del
individuo frente a la enfermedad que se denomina
Mitsuda. Se toma un extracto de la lesión leprosa y
se pasa por el autoclave, posteriormente se inyecta
en el antebrazo. Puede ocurrir después de 25 días:
⋅ Aparece una induración de más de 25 mm de
diámetro: Esto indica que estamos frente a
un organismo inmunizado frente a
micobacterium.
⋅ Induración de menos de 3 mm: individuos
sensibles por no haber tenido contacto o por
tener una lepra lepromatosa.
⋅ Induración entre 3−5 mm: son de resultado
dudoso (nos fijaremos en la sintomatología).
4.4.− Toma de muestra
Se realiza un raspado de la mucosa del tabique nasal
o se hace una biopsia de un leproma en la oreja,
ganglio nervioso o trozo de nervio afectado.
4.5.− Tratamiento
Se utilizan sulfanos y rifampicinas.
113
5.− ACTINOMICETOS
5.1.− Introducción
Son bacilos gram positivos aunque se tiñen con
dificultad siendo mas característico porque algunas
especies son baar positivo debido a la composición
de la pared celular (ácidos micólicos y componentes
céreos), dan positiva la prueba de la catalasa y el
microorganismo se ve de forma variable
dependiendo de los géneros, pudiendo ser:
cocobacilos, filamentosos
La morfología filamentosa se asemeja a la de los
hongos, de ahí el nombre de actinomiceto. Estos
microorganismos se encuentran en el suelo, plantas y
vegetales generalmente, aunque también pueden
aislarse en piel, orofaringe y tracto gastrointestinal
del hombre y animales.
El hombre puede infectarse por inhalación o contacto
de una herida, son inmóviles no esporulados y no
capsulados.
5.2.− Especies más importantes
(ver fotocopias tabla 11.2)
5.3.− Aislamiento y características bioquímicas
⋅ Toma de muestras: esputo, secreciones
virulentas, LCR, liquido pleural.
⋅ Tinciones: gram positivas (se ven con
dificultad) principalmente BAAR, Niehl−
Ziensen y Rodamina−Auramina positivas.
⋅ Medios de cultivo: agar infusión cerebro
corazón, Mueller Milton y medio de
Lovestein − Jensein. La Tª de cultivo 20−27
º que impide que se desarrollen otras
bacterias.
⋅ Pruebas bioquímicas: (tabla 11.2)
⋅ Pruebas serologicas: fijación del
complemento, Elisa, aglutinación,
precipitación.
5.4.− Patología
Cualquier infección pulmonar causada por estos
microorganismos se considera nocardiosis. Gran
parte de los estudios de nocardiosis parecen apuntar
a infecciones de carácter oportunistas, es decir que se
requiere de una enfermedad subyacente previa o que
el paciente esté inmunológicamente debilitado.
114
El género Nocardia no producen toxinas pero tiene
en su pared bacteriana una alta proporción de lípidos
muy relacionados con su virulencia ya que le van a
conferir a las bacterias alta resistencia frente a los
sistemas de defensa del huésped. Tiene la capacidad
de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos
y macrófagos de aquí que se hayan considerado
parásitos intracelulares.
Las manifestaciones clínicas mas frecuentes son:
⋅ Nocardiosis pulmonar: causada por
Nocardia, asteroides que producen lesiones
pulmonares con abscesos, inflamación
diseminada semejante a la tuberculosis,
pudiendo dar áreas de necrosis y a partir de
aquí la diseminación general por sangre a
otros órganos. También pueden diseminarse
por el sistema linfático, rara vez puede
afectar al hígado, bazo y miocardio, pero
cuando afecta puede ser grave o mortal, se le
denomina pulmón del granjero como
consecuencia de hipersensibilidad a Ag de
los actinomicetos.
⋅ Nocardiosis cutáneo: generalmente se debe a
la manipulación de tierra y plantas
contaminadas con actinomicetos apareciendo
celulitis pustular.
⋅ Micetomas: infección crónica supurativa
cutánea y subcutánea que afecta a tendones,
huesos y músculos. La localización más
frecuente son las extremidades. El origen
puede ser la inoculación de las bacterias
procedentes del suelo o vegetación. Es una
enfermedad típica en climas tropicales
principalmente la especie Brasiliensis.
5.5.− Tratamiento
Trimetropin− Sulfametosazol combinado con
Rifampicina y aminoglucosidos.
En el caso de micetoma y otras formas graves de
Nocardiosis cutánea es necesario recurrir a la
intervención quirúrgica además de la administración
de antígenos.
TEMA 18.− MICROORGANISMOS
ANAEROBIOS
1.− INTRODUCCIÓN
2.− SIGNOS CLÍNICOS DE INFECCIÓN POR
115
ANAEROBIOS
3.− CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS
ANAEROBIAS
4.− BACTERIAS ANAEROBIAS
ESPORULADAS. GÉNERO CLOSTRIDIUM
4.1.−Introducción
4.2.−Clasificación
⋅ Acción neurotoxica.
⋅ Acción histológica.
⋅ Acción sobre el aparato digestivo.
⋅ Responsables de cuadros purulentos.
5.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
6.− TOMA DE MUESTRAS, TRANSPORTE,
ETC.
1.− INTRODUCCIÓN.
Todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o
mantenerse en contacto con el oxigeno a la presión
atmosférica se consideran anaerobias o anaerobias
estrictas.
A estos microorganismos se les considera que tienen
un metabolismo anoxibiotico, es decir incapaz de
utilizar el oxigeno como aceptor final de electrones,
utilizando como aceptor sustratos orgánicos.
Se sabe que estas bacterias no tienen cierto enzimas
llamados metaloporfirinicos que en los mecanismos
aerobios transportan oxigeno.
Nos encontramos bacterias anaerobias para los que la
presencia de oxigeno es altamente toxica o
bactericida, mientras que para otras bacterias es
bacteriostático de tal forma que cuando se
establezcan de nuevo las condiciones de anaerobiosis
las bacterias crecen.
Las bacterias anaerobias forman parte de la flora
normal (tabla 16.1) y dan lugar a patologías.
2.− SIGNOS CLÍNICOS DE INFECCIÓN POR
ANAEROBIOSIS
(Ver tabla 16.2)
116
3.− CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS
ANAEROBIAS
(Ver tabla 16.1)
4.− BACTERIAS ANAEROBIAS
ESPORULADAS. GÉNERO CLOSTRIDIUM
4.1.− Introducción
Dicho género tiene más de 30 especies y muchas son
peligrosas para el ser humano. Este género se
caracteriza por la formación de toxinas que
responden a sustancias proteicas solubles.
4.2.− Clasificación
Se clasifican en los siguientes grupos:
⋅ De acción neurotoxica, en este grupo se
encuentra Clostridium tetanis (produce
tétanos) y Clostridium botulium (produce
botulismo).
⋅ De acción histotóxica, en este grupo se
encuentra Clostridium perfringes (produce
gangrena gaseosa) y otros Clostridium.
⋅ De acción sobre el aparato digestivo,
destacaremos el Clostridium perfringes,
Clostridium dificille y Aclostridium.
⋅ Responsables de cuadros purulentos,
destacaremos a Clostridium pyogenes,
Aclostridium, Clostridium perfinges y
Clostridium ramosum.
Clostridium Tetanis
Es un bacilo gram +, pequeño, con capacidad de
formar esporas terminales dando a las bacterias un
aspecto de cerillas o palillo de tambor. Su hábitat se
encuentra fundamentalmente en la tierra y en
intestinos de hombres y animales.
Posee 3 toxinas de acción neurotoxica y son
transportados por vía sanguínea hasta el SNC
bloqueando la liberación de neurotransmisores, esto
origina convulsiones y parálisis apareciendo a nivel
periférico en exceso de liberación de acetilcolina en
el músculo esquelético que constituye el cuadro
clínico característico de parálisis, así mismo se ve
alterado el sistema contracción relajación muscular,
de forma que este entra en una fase de contracción y
no se recupera (rigidez tetánica).
117
Para que se produzca el tétano es necesario que el
microorganismo se encuentre en condiciones de
anaerobiosis. Tras una herida mas o menos profunda
ya sea cortante, punzante, mordedura, arañazo,
quemaduras, úlceras por decúbito e incluso heridas
superficiales como rozaduras que se pudieran
infectar y formar costra facilitan la infección
anaerobia.
Si las condiciones son favorables el periodo de
incubación es de 5 − 7 días y se origina la reacción
patógena. Podemos hablar de 2 formas clínicas:
⋅ Local
⋅ Tetánica, que es la más grave.
El tétanos afecta principalmente a países
subdesarrollados, es importante el diagnostico
precoz y las medidas profiláctica (vacunas DTT). De
no ser así el índice de mortalidad es muy elevado.
Clostridium Botulium
Son bacilos gram +, anaerobios estrictos, grandes, no
capsulados, móviles, debido a su flagelación
peritrica. Presentan esporas de carácter subterminal y
en general es capaz de formar toxinas, las toxinas
que se denominan con letras (A ! G). Las más
peligrosas y potentes para el hombre son las
neurotoxinas A, B. y E.
Clostridium Botulium presenta una estructura
antigénica típica debida a los Ag flagelares y a los
Ag de esporas.
Se encuentra ampliamente distribuido en muchos
ambientes como aire, suelo, alimentos. Si las
condiciones son las adecuadas las esporas germinan
facilitando la proliferación de Clostridium Botulium.
Es importante destacar su presencia en las conservas
y pescados.
El efecto patógeno es debido a dichas neurotoxinas y
son venenos biológicos que se conocen muy bien,
una pequeña cantidad del microorganismo es
suficiente para causar la muerte. Las condiciones
para que germine la espora será de anaerobiosis, Tª
aproximada 30º C y un pH neutro o ligeramente
ácido.
Estas toxinas son de carácter proteico y termolabiles,
de tal forma que se destruyen con facilidad a Tª altas
(100ºC 15 min., 70º C 30 − 60 min.)
118
La toxina puede llegar al hombre a través de
alimentos contaminantes, en el tubo digestivo
producirá in situ una toxiinfección alimentaria.
A partir de aquí a través de vía sanguínea y linfática
llega al sistema nervioso periférico donde actúa
sobre terminaciones nerviosas bloqueando la
liberación de acetilcolina y originando como
consecuencia parálisis del músculo esquelético, así
como otras manifestaciones neurológicas como:
visión borrosa, fotofobia, disfagia, sequedad en boca
y faringe y debilidad en los músculos incluyendo los
respiratorios que pueden llegar a paralizarse y en
muchas ocasiones es frecuente la muerte por fallos
respiratorios y arritmias cardiacas.
Su periodo de incubación está en torno a las 16−36
horas después de la ingestión de alimentos
contaminados. Los cuadros más graves se originan a
las 24−48 horas.
Algunos autores hablan del Botulismo del lactante
que se produce por la elaboración de toxinas en el
colon tras la ingestión de esporas. El cuadro clínico
puede ser desde leve a grave y se manifiesta por
dificultad muscular, en la alimentación,
estreñimiento, disminución del reflejo de succión e
insuficiencia respiratoria.
El diagnóstico del botulismo es fundamentalmente
clínico ya que el microbiológico puede retrasarse. Se
puede mostrar presencia de toxinas en sangre por
pruebas serológicas.
El tratamiento consiste en combatir los síntomas,
limpieza a fondo de heridas, administración de
antitoxina botulínica y Ab. También fármacos
relacionados con el funcionamiento de al
acetilcolina.
Clostridium que afecta a los tejidos. Clostridium
perfringes
Es un bacilo gram positivo y anaerobio estricto. Se
caracteriza porque está ampliamente distribuido por
la naturaleza, especialmente en el suelo cuya
concentración habitualmente sobrepasa las 50 mil
bacterias /gramos de tierra, especialmente en tierras
húmedas y abonadas con estiércol.De aquí a través
de heridas puede pasar al hombre produciendo
gangrena gaseosa. Es poco frecuente pero muy
grave.
119
La gangrena gaseosa consiste en necrosis tisular
(muscular)y signos de toxicidad sistémica debido a
la producción de toxinas histológicas. Se caracteriza
por un intenso dolor en la herida seguido de
aparición de lesiones cutáneas como edemas,
ampollas, etc, que se extienden rápidamente y
evolucionan a necrosis y destrucción celular.
El diagnóstico se realiza por cuadro clínico y
presencia en tinción de gram realizada
principalmente en pus o tejidos afectados.
El tratamiento es quirúrgico y altas dosis de
penicilina.
Existe una toxina , que es la principal responsable
de este daño, y otras toxinas y H que son
responsables pero en menor medida.
Clostridium que afecta a tracto digestivo.
Clostridium perfringes
Además de provocar gangrena gaseosa puede dar
lugar a infección toxialimentaria producida por
ingestión de carne contaminada. En el intestino
delgado germinan las esporas dando un cuadro
característico con diarreas, vómitos, dolor
abdominal, etc, pudiendo llegar a estados de shock.
El cuadro es generalmente benigno y el diagnóstico
se realiza mediante detección del microorganismo en
el alimento o heces del paciente.
Clostridium responsable de cuadros purulentos.
Clostridium pyogenes
Suele ir acompañado de otras bacterias anaerobias.
Las toxinas no actúan ejerciendo efectos patógenos
salvo cuando hay complicaciones.
5.− AISLAMIENTO Y CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
⋅ Toma de muestras: Se ha de realizar en
condiciones de asepsia.
⋅ Tinciones: Tinción gram y de esporas
(Clostridium tetani)
⋅ Medios de cultivo: Medios específicos como
agar TSM a base de carne, sangre, huevos,
tripticasa trisulfato y neomicina.
⋅ Pruebas bioquímicas: Se utilizan muchas
siendo las más importantes: hidrólisis de
120
gelatina, producción de indol y pruebas de
fermientación de HC.
⋅ Otras pruebas de identificación:
⋅ Para Clostridium tetani: pruebas de
inoculación en animales, cromatografía de
gases, HPLC, etc.
⋅ Para Clostridium perfringes y Clostridium
botulium: las mismas que para Clostridium
tetani además de RIA e
inmunofluorescencia.
6.− TOMA DE MUESTRAS,
TRANSPORTE, ETC.
La incubación se lleva a cabo con un sistema
de campana, la atmosfera anaerobia se
consigue mediante la introducción en la
misma de un sobre generador de gas (CO2)
y un catalizador.
Se incluirá siempre un medidor de
anaerobiosis, que cambia de color en
ausencia de aire, para comprobar que el
sistema ha funcionado.
El sobre generador de gas se activa
introduciendo en él 10 ml de agua del grifo,
lo que da lugar a la liberación de H2 y CO2.
El oxígeno del interior de la campana se une
al hidrogeno y forma agua que se deposita
en forma de gotas en las paredes del
recipiente. El CO2 generado procuce el
crecimiento de algunos anaerobios.
Los sobres e indicadores de anaerobiosis son
de un solo uso.
(Ir a la pregunta 6 de las fotocopias)
TEMA 19.− RICKETTSIA, CLAMIDIAS
Y MICOPLASMA.
1.− FAMILIA RICKETTSIACEAE
⋅ Introducción.
⋅ Géneros y especies más importantes:
• Rickettsias: R. Prowazekii, R.
conorii y R. rickettsi.
• Coxiella burnetii.
• Ehrlichia.
1.3 Aislamiento y características
bioquímicas
121
2.− CLAMYDIAS
2.1 Introducción.
2.2 Especies más importantes: C. tracomatis,
C. psitacci y C. pneumoniae.
2.3 Tratamiento.
2.4 Aislamiento y características
bioquímicas.
3.− MICOPLASMA.
3.1 Introducción.
3.2 Micoplasma neumoniae.
3.3 Micoplasma genitalis: Ureaplasma
urealiticum y M. Hominis.
3.4 Acholeplasma.
3.5 Aislamiento y características
bioquímicas.
4.− FORMAS L
1.− FAMILIA RICKETTSIACEAE
1.1.− Introducción.
Son microorganismos procariotas que
precisan de células vivas para poder
desarrollarse, es decir son microorganismos
intracelulares que se encuentran adaptados a
un parasitismo celular.
Morfológicamente son cocos o cocobacilos
gram − que presentan una dotación
enzimática muy escasa de ahí que necesiten
microorganismos o células a las que
parasitar.
Producen en el hombre enfermedades
epidémicas o endémicas transmitidas por
vectores (piojos, pulgas, ácaros, etc.).
Esta familia comprende 4 géneros
importantes:
• Rickettsias.
122
• Coxiella
• Ehrlichia.
• Rochalimaea.
1.2.− Géneros y especies más importantes
Rickettsias.
Son cocobacilos gram − y cuyo diámetro es
igual a 0,3−0,5m y 0,8−2m de longitud.
Dentro de estas tenemos:
• Rickettsias prowazekii: produce el
tifus epidémico, lo transmite el
piojo, la vía de entrada en el hombre
a través de la picadura que tras el
rascado produce la penetración. El
periodo de incubación es de 1−3
semanas, los síntomas que produce
son: escalofríos, fiebres muy altas,
dolores generalizados e
inflamaciones que afectan sobretodo
a capilares, arteriolas y vénulas, así
como a piel y músculo. Pueden crear
estados obstructivos que dificulten
la corriente sanguínea debido a la
formación de nódulos y en casos
graves pueden provocar gangrena en
extremidades. Lo más probable es
que en la piel aparezcan manchas
rosadas que luego se vuelven
papulosas y petequiales. Esta
enfermedad es transmitida de
persona a persona produciendo gran
epidemias en guerras. Puede ser
grave (incluso muerte) en
condiciones adversas.
Tratamiento: tetraciclinas y cloranfenicol,
siendo muy importante y decisivo la lucha
contra el piojo (vector) con insecticidas.
Puede presentarse recaídas al cabo de
muchos años llamándose entonces
enfermedad de Brill−Zinsser.
• Rickettsias conorii: produce la
fiebre botonosa, se transmite a
través de la garrapata. Es una
enfermedad endémica en la cuenca
mediterránea, en general es de curso
benigno y da lugar a manchas negras
en el lugar donde muerde la
garrapata. Sus síntomas en primer
123
lugar es macular y posteriormente
papular y botonosa. La enfermedad
se mantiene durante 8−20 días.
Tratamiento: tetraciclinas.
• Rickettsia Rickettsi: Produce la
llamada fiebre de las montañas
rocosas, transmitida por garrapatas,
periodo de incubación 3− 6 días
aparecen fiebres muy altas que
presentan mialgias y manchas
negras en la zona de picadura.
COXIELLA BURNETTI
Produce la llamada enfermedad de la fiebre
Q. La vía de entrada principalmente por
inhalación aunque puede haber otros.
Es un microorganismo bacilar de pequeño
tamaño de 0,3 micrómetros de diámetro y o,
4−1 micrómetros de longitud. Afecta al
ganado, presentando un tropismo especial
por las placentas siendo excretado en el
parto.
Las manifestaciones clínicas son síntomas
generales del estado febril, mialgias y
afectación pulmonar en la mitad de los
casos, por lo que se considera agente de
neumonía atípica, puede dar también
afectación hepática.
El tratamiento es cloranfenicol y
tetraciclinas.
1.3.− Aislamiento y características
bioquímicas
En estados de fiebre las Rickettsias se
mantienen abundantemente en sangre, así
pues será la muestra de elección.
A partir de sangre heparinizada y
centrifugada se usará el sedimento para
obtener una muestra mas concentrada.
Posteriormente realizaremos:
• Tincion directa: Ej.; Giemsa,
apareciendo la Rickettsias de color
púrpura. Tincion de Jiménez: que se
ven de color rojo sobre fondo verde.
Si hacemos un gram se verán
124
negativo. También podemos realizar
técnicas de inmunofluorescencia.
• Medio de Cultivo: se pueden
inocular en cultivos celulares o
embriones de pollo.
• Pruebas serológicas: principalmente
reacciones Ag − Ac, las pruebas mas
usadas son las seroaglutinación,
inmunofluorescencia indirecta y la
técnica de Weil − Félix que consiste
en que a partir de diluciones de
suero problema con esta bacteria
ponerlas en contacto con una
cantidad fija de Ag de Rickettsia.
2.− CLAMYDIAS
2.1.− Introducción
Son microorganismos procariotas que hasta
hace poco se consideraban más bien virus
que bacterias. Son procariotas intracelulares
estrictos ya que no pueden sintetizar ATP.
Morfológicamente son cocos gram −,
inmóviles y tienen 2 tipos de ácidos
nucleicos: ADN y ARN, se multiplican por
división binaria, dato que aleja a las
Clamydias de los virus.
2.2.− Especies más importantes
(ver tabla 12.2)
Clamydia Tracomatis
Puede producir distintas enfermedades:
• Tracoma: que es una
queratoconjuntivitis, causa más
importante de ceguera en el mundo,
principalmente en países
subdesarrollados.
• Linfogranuloma venéreo: que es una
E.T.S. para su detección se realiza
inmunofluorescencia.
Clamydia Psitacci
Puede producir neumonía atípica, la
transmisión suele esta mediada por contacto
con aves, el diagnostico principalmente es
por fijación del complemento.
125
Clamydia Pneumoniae
Es un patógeno de reciente descubrimiento
que produce neumonía.
2.3.− Tratamiento
Sulfamidas.
2.4.− Aislamiento y características
bioquímicas
• Toma de muestra: secreciones
oculares o genitales según el caso.
• Tinciones: Giensa, Jiménez, Gram.
• Técnicas citológicas: para observar
células del epitelio conjuntivas y
genital con el fin de verificar los
gránulos ricos en glucogeno.
• Cultivos: embriones de pollo aunque
ésta técnica no es muy frecuente por
el riesgo de infección en el
laboratorio.
• Pruebas serológicas: principalmente
radioinmunoensayos y fijación del
C´.
3.− MICOPLASMA
3.1.− INTRODUCCIÓN
Da los microorganismos más pequeños y se
caracteriza porque carece de pared celular.
Presenta división binaria.
El carecer de pared celular le confiere una
serie de propiedades tales como:
• sensibilidad a la presión osmótica
del medio en que se encuentra que
puede facilitar su lisis
• pleomorfismo
• resistencia a antibióticos como
cefalosporinas y penicilina
• no se tiñen con gram
Están ampliamente distribuidos en la
naturaleza y pueden afectar al hombre,
principalmente Micoplasma neumoniae.
Requiere medios enriquecidos y apartir de
medios líquidos pueden visualizarse en
microscopio óptico de campo oscuro o
contraste de fase.
126
Las colonias son típicas por su forma de
huevo frito.
Los principales géneros son:
• Micoplasma
• Ureplasma
• Acholeplasma
3.2.− MICOPLASMA NEUMONIAE
Principal agente causal de neumonías
atípicas, con un periodo de incubación de
aproximadamente 3 semana considerando
que es un microorganismo de lento
crecimiento.
Los síntomas son fiebres, mialgias, cefaleas
y tos no productiva afectando principalmente
a los escolares. En muchas ocasiones la
infección es subclínica (no tiene síntomas
claros) o de neumonía suave, pero este
micoplasma puede permanecer varios meses
en el tracto respiratorio tras la infección.
Existen otros micoplasmas que son flora
normal como Micoplasma salivarium,
Micoplasma orale y Micoplasma buccale.
La infección por Micoplasma neumoniae no
presenta distribución estacionaria (no
depende de las estaciones del año). La
enfermedad requiere un contacto estrecho.
Puede tener pronóstico benigno y aparecer
manifestaciones extrapulmonares como por
ejemplo erupciones cutáneas.
3.3.− MICOPLASMA GENITAL
Comprenden este grupo Ureplasma
urealyticum y Micoplasma hominis. Forman
parte de la flora normal de las mujeres el
60% de Ureaplasma y el 20% de
Micoplasma hominis. Se consideran
patógenos oportunistas produciendo
enfermedades uretrales y vaginales como
vaginitis, prostatitis, etc. Pueden producir
fiebre en el postparto.
3.4.− Aislamiento y características
bioquímicas
• Toma de muestras: mucosa faringea,
127
secreción uretral, exudados, esputo,
sangre, etc, según la patología.
• Tinción: de Giemsa principalmente,
también tinción en campo oscuro
con nigrosina. No se hace gram
porque carece de pared celular.
• Medio de cultivo: medios
específicos a 37ºC y ambientes
aerobios.
• Pruebas serológicas:
inmunofluorescencia, RIA, fijación
de complemento.
4.− FORMAS L
No hay que confundirlas con micoplasma
aunque tienen en común carecer de pared
celular. Son variantes de bacterias en los que
ha ocurrido pérdida de pared celular, que se
puede inducir mediante sustancias que
inhiben la síntesis de la pared.
TEMA 20.− VIBRIOS,
CAMPYLOBACTER Y GÉNEROS
RELACIONADOS
1.− VIBRIOS
1.1.− Introducción
1.2.− Especies más importantes
1.3.− Poder patógeno
1.4.− Patología
1.5.− Tratamiento
1.6.− Aislamiento y características
bioquímicas
2.− CAMPYLOBACTER
2.1− Introducción
2.2− Especies más importantes
2.3.− Aislamiento y características
bioquímicas
2.4.− Patología
2.5.− Tratamiento
128
3.− HELICOBACTER PILORI
3.1.− Introducción
3.2.− Métodos de detección
• Directos
• Indirectos
♦ Prueba de la urea rápida
♦ Prueba de la urea
respiratoria
♦ Pruebas serológicas
3.3.− Poder patógeno
3.4.− Patología y Tratamiento
4.− AEROMONAS
4.1.− Introducción
4.2.− Patología
4.3.− Tratamiento
4.4.− Aislamiento y características
bioquímicas
5.− PLESIOMONAS
1.− VIBRIOS
1.1.− INTRODUCCIÓN
Son bacilos gram negativos, anaerobios
facultativos, de morfología curva, no
esporulados y móviles gracias a su
flagelación lofótrica.
Crece bien en medios generales y son
oxidasa positivo, prueba que nos va a
permitir diferenciarlos de las
Enterobacterias.
Aguantan bien elevadas concentraciones de
NaCl, por lo que se le denominan bacterias
halofíticas y su crecimiento se facilita en
medio alcalino.
Reducen nitratos a nitiritos.
Se hallan muy distribuidos en la naturaleza.
Son bacterias acuáticas que habitan en ríos,
129
lagos, etc.
De las 34 especies conocidas sólo 11 se han
aislado en el hombre.
1.2.− ESPECIES MÁS IMPORTANTES
(ver tabla 14.2)
• Vibrio parahaemolyticus: Vive en
ambientes marinos y se transmite al
hombre a través de alimentos como
el pescado y el marisco. En el
hombre produce cuadros
gastrointestinales graves.
• Vibrio fluvialis: Produce cuadros
gastrointestinales a través de
alimentos como el pescado y el
marisco.
• Vibrio alginolyticus: Se asocia a
conjuntivitis y otitis.
• Vibrio vulnificus: Agente causal de
infección de heridas traumáticas
causadas en ambientes marinos.
• Vibrio cholerae: Es el más patógeno
para el hombre. Es el agente
etiológico del cólera. Provoca
diarreas graves hasta llegar a la
deshidratación, shock hipovolémico
y si no hay tratamiento la muerte.
1.3.− PODER PATÓGENO (Vibrio
cholerae)
Presenta 3 componentes antigénicos
responsables de su virulencia:
• Ag somático O: Termoestable y de
naturaleza polisacárida.
• Ag flagelar H: Termolábil.
• Exotoxinas: Son enterotoxinas de
naturaleza proteica y sobre la que se
desencadena el principal efecto
patógeno del cólera.
Las cepas epidémicas de Vibrio cholerae, de
las que existen más de 100, se pueden
separar en función de sus serotipos siendo
los más importantes el 01.
1.4.− Patología (Vibrio cholerae)
El Vibrio cholerae penetra en el organismo
por vía oral a tavés de agua y alimentos
contaminados, principalmente productos
130
marinos crudos.
Debe se capaz de eludir el medio ácido del
estómago, hecho que sucede cuando se
ingiere más de 100 millones de gérmenes,
circunstancia que se facilita en epidemias
sobre todo si se tiene en cuenta que pueden
encontrarse 106 gérmenes/ml de agua
contaminada.
Además de estas condiciones, Vibrio
cholerae deberá traspasar la barrera del
estómago para producir diarrea que da lugar
a una pérdida de agua y electrolitos que
provoca una deshidratación que sin
tratamiento puede causar shock
hipovolémico y la muerte.
El mecanismo por el que produce la
deshidratación es provocado por la
enterotoxina que se encuentra en las
microvellosidades intestinales. Dicha
enterotoxina se divide en dos fracciones: la
fracción a y la fracción b. La fracción b es la
encargada de seleccionar los receptores
específicos a los que se une, y una vez unida
la enterotoxina, la fracción a actuará
activando una enzima, la adenilciclasa, lo
que supone que el ATP de las células que
infecta se transforma en AMP. Como
consecuencia de las elevadas
concentraciones de AMP se producirá una
inhibición de la absorción de Na por parte de
las células intestinales y una liberación de
agua, cloruros, bicarbonatos, K y que en los
casos más graves puede perderse de 10−15
litros al día.
El periodo de incubación es de 1−4 días y
los síntomas clínicos nauseas, vómitos, dolor
abdominal, diarrea, etc. Las heces contienen
moco, células y gran cantidad de Vibrio. La
muerte sobreviene en pocas horas si no se
restablece l equilibrio electrolítico.
1.5.− TRATAMIENTO
El tratamiento es sintomático y encaminado
a la reposición de líquidos. Vibrio cholerae
es sensible a tetraciclinas y
trimetroprimsulfametoxazol.
131
El uso de antibióticos ha dado lugar a la
aparición de cepas resistentes.
Se trabaja en la elaboración de vacunas.
1.6.− AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
Las muestras de heces que no se procesan
inmediatamente se transportan en medio de
Cary−Blair donde los Vibrios se mantienen
viables hasta 4 semanas. Se debe evitar la
exposición al aire ya que son muy sensibles
a la desecación.
El vibrio se desarrolla bien en agar sangre y
Mckonkey, pero el más selectivo es el medio
TCBS (triptona, citrato, bilis y sacarosa)
donde Vibrio cholerae crece dando colonias
amarillas. También se puede utilizar como
caldo de enriquecimiento a partir de heces
agua peptonada al 1% de NaCl. El tiempo de
incubación es de 16−22 horas a 35−37ºC.
2.− CAMPYLOBACTER
2.1.− INTRODUCCIÓN
Son bacilos gram negativos, cortos, con
forma espiral, alas de gaviota o coma. Son
microaerófilos, móviles, con un flagelo
polar, no esporulados, no fermentan HC y
dan posita la oxidasa y catalasa.
Habitan en el tracto gastrointestinal de un
gran número de animales. En el hombre se
asocia a infecciones gastrointestinales y cada
vez más a infecciones extraintestinales como
meningitis, endocarditis, artritis, etc,
especialmente en pacientes con SIDA.
2.2.− ESPECIES MÁS IMPORTANTES (
ver tabla 14.1)
Las especies más importantes de
Campylobacter son:
• Campylobacter jejuni
• Campylobacter coli
• Campylobacter hyointestinalis
2.3.− AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS
132
Hay dos tipos de muestras:
• Muestra de heces
Emplea medios selectivos que poseen
antibióticos para reducir la flora
acompañante (medio Skirrow, Campy o
Buzler).
Uso de atmosfera reducida en oxígeno
(ambiente de CO2) y temperatura de 42ºC.
Un medio alternativo para el aislamiento de
Campylobacter en heces es filtrar las heces
para eliminar los coliformes y otra flora
acompañante. Los filtros son de acetato de
celulosa y se colocan sobre una superficie de
agar, se pone una gota de heces, se incuba
toda la noche, se retira el filtro y se vuelve a
incubar la placa.
• Muestra de sangre
En sangre se han aislado como agente
etiológico se sepsis en pacientes
inmunodeprimidos y con SIDA.
2.4.− PATOLOGÍA
Campylobacter jejuni se ha asociado a
infecciones en el hombre asociadas con
gastroenteritis con eliminación de sangre por
las heces.
El microorganismo se adquiere por vía oral,
por la ingestión de comidas o bebidas
contaminadas, o por el contacto con aves.
Es sensible al pH gástrico por lo que se debe
ingerir un inóculo muy elevado de
microorganismo. Se multiplica en el
intestino delgado e invade el epitelio,
produce inflamaciones, en ocasiones pasa a
sangre y origina fiebre. La diarrea que
produce se acompaña de dolor intestinal,
dolor de cabeza, fiebre, nauseas, etc.
2.5.− TRATAMIENTO
La infección es autolimitada resolviéndose
en una semana sin necesidad de administrar
antibiótico. Los casos más graves se tratan
con eritromicina.
133
Existe una especie la Campylobacter
hyointestinalis que causa infección intestinal
y es común en individuos homosexuales.
3.− HELICOBACTER PILORI
3.1.− INTRODUCCIÓN
En 1982, se aislaron por primera vez en
pacientes con lesiones gástricas y úlceras
peptídicas unos bacilos gram negativos con
forma de espiral y gran actividad ureasa.
3.2.− MÉTODOS DE DETECCIÓN
a.− Métodos directos
Helicobacter pilori se encuentra en los
pliegues de la mucosa gástrica. Si el estudio
no se va a hacer de inmediato es útil como
medio de transporte solución glucosada al
20% o solución salina, manteniéndose viable
en estos medios durante 5 horas a 4ºC.
Las muestras recibidas pueden usarse para
realizar un gram. Las biopsias se cortan en
trozos o se machacan en un mortero estéril
con solución glucosada al 20% y se siembra
en los siguientes medios:
• agar BHI (infusión cerebro corazón)
• agar Müeller−Hinton
• agar Brucella al 1% de almidón
soluble,
• agar sangre o chocolate
Para el aislamiento de Helicobacter pilori es
importante incluir medios selectivos con
antibióticos.
La incubación es de carácter microaerófilo
que se puede conseguir con las jarras de
CO2 y la temperatura óptima es de 37ºC, no
desarrollándose a 25,30 y 42 ºC.
La identificación de Helicobacter pilori se
realiza por la tinción de gram y pruebas
bioquímicas como catalasa, oxidasa y
ureasas positivas, teniendo en cuenta que la
temperatura de crecimiento es muy selectiva.
b.− Métodos indirectos
134
• Prueba de la urea rápida: Un trozo
de biopsia se inocula en un medio
con altas concentración de urea y un
indicador de pH. Un viraje del
indicador a un medio alcalino por
hidrólisis de la urea es significativo
de Helicobacter pilori.
• Prueba de la urea respiratoria: El
paciente ingiere urea marcada y tras
un periodo de tiempo se mide el
nivel de CO2 espirado. Se emplea
urea marcada con C13 o C14 que se
detecta en un espectrofotómetro de
masas.
• Pruebas serológicas: principalmente
ELISA para detectar presencia de
IgG e IgA en individuos con
Helicobacter pilori.
3.3.− PODER PATÓGENO
Se señala al producción de ureasa capaz de
crear un entorno alcalino que protege a los
microorganismos de la acidez gástrica hasta
que se localiza en las capas de la mucosa
gástrica. También las proteasas modifican el
pH gástrico de la mucosa y disminuyen la
capacidad del ácido de difundir al mucus.
3.4.− PATOLOGÍA Y TRATAMIENTO
Helicobacter pilori es el agente etiológico de
gastritis aguda y crónica. En relación a
ulceras peptídicas se aísla en el 100% de los
casos y el ulcera duodenal en el 77% .
Parece ser que la presencia del
microorganismo no es suficiente para
desarrollar la ulcera aunque se cree que
colabora.
Es importante tener en cuenta que hasta el
50% de la población adulta es portadora
desconociéndose el mecanismo de
transmisión.
Tratamiento: Es sensible a succionato de
bismuto y sucsalicato de bismuto y muy
resistente a antibióticos. El tratamiento es
difícil y nunca se emplea monoterapia.
Suelen administrarse varios fármacos juntos
y aún no se erradica el microorganismo
habiendo recaídas.
135
4.− AEROMONAS
4.1.− Introducción
Son bacilos gram − , anaerobios facultativos,
oxidasa + y fermentan la glucosa con o sin
producción de gas, la mayor parte son
móviles y crecen a temperaturas de 4−40ºC.
habitan en aguas dulces y saladas donde
infectan a los animales, generalmente peces
y anfibios.
En el hombre se asocian a infecciones
intestinales en heridas e infecciones
sistémicas.
4.2.− Patología
• Produce una diarrea aguda (diarrea
del viajero) que suele ser
autolimitada.
• Puede dar lugar a celulitis o
infecciones de heridas por contacto
de mucosas, por la tierra o aguas
contaminadas.
• Septicemias en pacientes
inmunodeprimidos.
• Otras (endocarditis, peritonitis,
meningitis,etc.).
4.3.− Tratamiento
Tetraciclinas, aminoglucosidos y
cefalosporinas.
4.4.− Aislamiento y características
bioquímicas
• Toma de muestras: líquidos
orgánicos (sangre o exudados).
• Medios de cultivo: agar sangre y
agar Mc konkey y más selectivos:
agar tripiticasa de soja al 5% y agar
sangre con ampicilina.
5.− PLESIOMONAS
Comprenden una sola especie que es la
sigeloide. Es un bacilos gram −, anaerobio
facultativo, móvil o inmóvil, catalasa y
oxidasa + que fermenta glucosa sin producir
gas y reduce nitratos a nitritos.
La temperatura óptima es de 37ºC aunque
136
crece bien entre 8−44ºC. se aisla bien en el
intestino de peces de agua dulce y no
sobrevive en agua del mar.
En el hombre se asocia a diarrea en zonas
tropicales y subtropicales.
Crece bien en agar sangre y agar SS.
TEMA 21.− ESPIROQUETAS:
TREPONEMAS, BORRELIAS Y
LEPTOSPIRA
1.− INTRODUCCIÓN A LAS
ESPIROQUETAS
2.− TREPONEMAS
2.1.− Introducción
2.2.− Especies más importantes: Treponema
pallidum
• Patología
• Epidemiología
• Aislamiento y características
bioquímicas
• Tratamiento
3.− BORRELIAS
3.1.− Introducción
3.2.− Especies más importantes
3.3.− Patología
• Fiebre recurrente
• Enfermedad de Lyme
3.4.− Tratamiento
3.5.− Aislamiento y características
bioquímicas
4.− Leptospira
4.1.− Introducción
4.2.− Especies más importantes
4.3.− Patología
4.4.− Tratamiento
137
4.5.− Aislamiento y características
bioquímicas
1.− INTRODUCCIÓN A LAS
ESPIROQUETAS
Existe una serie de bacterias con morfología
espiral y flexible denominadas
espiroquetas. Presentan una movilidad
característica no asociada a flagelos, sino a
un filamento axial que se extiende
longitudinalmente por debajo de la envoltura
externa.
Presenta una pared muy fina y flexible de
naturaleza liposacárida y lipoproteica donde
se vana a encontrar la mayor parte de los Ag
específicos.
Son gram negativas, pero presentan muchas
dificultades para teñirse. Se tiñen con
impregnación argéntica, tinción de Giemsa o
microscopía de fases. Presentan
metabolismo fermentativo u oxidativo
siendo aerobios o aerobios facultativos.
Se encuentran muy difundidos en la
naturaleza, en el agua, suelo y mucosas del
hombre y animales.
Dentro de la familia Espiroquetaceae existen
5 géneros:
• Treponema
• Borrelia
• Leptospira
• Espiroqueta
• Cristipira
2.− TREPONEMA
2.1.− INTRODUCCIÓN
Comprende especies patógenas que afectan
al hombre y otras que forman flora normal
del tracto intestinal, boca y tracto genital.
Son espiroquetas muy helicoidales, finas,
pequeñas y móviles. Son anaerobias
facultativas y presentan un metabolismo
fermentativo.
Se tiñen difícilmente con gram utilizándose
138
giemsa e impregnación argéntica.
No crece en cultivos in vitro y requiren un
medio in vivo.
2.2.− ESPECIES MÁS IMPORTANTES
La especie más importante es Treponema
pallidum, que produce la sífilis. Afecta
principalmente a adultos. Es de distribución
mundial. Es una ETS, siendo una infección
congénita. Produce lesiones destructivas e
infecta a todos los tejidos.
• PATOLOGÍA
Es el agente causante de la sífilis. Es un
microorganismo que no es capaz de resistir
fuera del organismo humano.
La sífilis comienza con un primer contacto
(sexual, ETS), con lesiones primarias ricas
en treponemas presentes en la mucosa.
Después de un periodo de incubación de
10−90 días, con termino medio de 20 días,
aparece en la zona genital un chancro
primario, es lo que se denomina Periodo
primario de Sífilis, con abundantes
treponemas que poco después se diseminan
por vía sanguínea y linfática a otras
localizaciones convirtiéndose en una
enfermedad sistémica.
Es frecuente su multiplicación en los
ganglios linfáticos próximos a la zona
genital originando pequeños tumores.
Transcurrido un tiempo corto (2−6 semanas)
estos signos desaparecen espontáneamente y
entran en fase de latencia. Transcurrido un
tiempo (2 meses−2 años) surge la Sífilis
secundaria o florida. De forma súbita hay
una espiroquetemia en genral muy
abundante y que da lugar a manchas en la
piel y mucosas muy ricas en treponemas y
altamente infecciosas. También se pueden
producir lesiones en otros órganos, fiebre, y
en ocasiones pústulas o pápulas ricas en
treponemas. Si esto se produjese nos
encontraríamos con una forma eruptiva, pero
la mayor parte de los casos no aparece
debido a la fuerte respuesta inmunitaria.
Este cuadro clínico de carácter sistémico
139
remite a las pocas semanas (2−6 semanas)
volviendo a entrar en fase de latencia.
Transcurrida la fase de latencia (3−30 años),
surge la Sífilis terciaria, forma muy grave y
mal pronóstico si los pacientes no han sido
tratados. El número de treponemas en sangre
es muy escaso y abundante en ganglios,
hueso, bazo, sistema cardiovascular, SNC,
etc. Cuando afecta al SNC se denomina
Neurosífilis, formándose también unas
lesiones granulomatosas denominadas
grummas.
Recientemente de distingue entre:
⋅ Sífilis precoz: menos de 1 año de evolución
⋅ Sífilis tardía: mas de 1 año de evolución
• EPIDEMIOLOGÍA
La transmisión más frecuente es la sexual,
pudiendo aparecer lesiones en labios, boca,
tronco, etc.
Otra modalidad de transmisión es la
transplacentaria, llamada Sífilis congénita,
que para evitarla se hace un estudio
serológico durante la gestación. También se
realiza este estudio a donantes de sangre
para evitar contagio por vía transfusional.
En la actualidad han disminuido los
contagios por una buena metodología del
diagnostico y tratamiento eficaz aunque se
está lejos de la erradicaión.
También se le denomina Lues venerium.
• AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
• Toma de muestras: Se realiza
exprimiendo el chancro primario o
condiloma (mancha que aparece en
la piel en la sífilis secundaria)
• Medios de cultivo: No crece en
medios in vitro, solo en medios in
vivo como testículos de conejo.
• Tinciones: de Giemsa e
Impregnación argéntica.
• Diagnóstico: Puede ser directo o
indirecto:
• Directo: Buscamos
microorganismos en tinciones.
140
• Indirecto: Pruebas serológicas donde
se busca en el suero del paciente Ac
frente Treponema pallidum por
medio de distintas pruebas:
♦ Pruebas reagínicas o no
treponémicas: Son baratas,
rápidas y ofrecen buena
indicación de la actividad de
la enfermedad, pero son
inespecíficas, ya que dan
falsos positivos. También se
denominan pruebas
cardiolipínicas, ya que el Ag
utilizado no el es Ag de
treponema sino la
cardiolipina, que es un
lípido extraído de tejidos de
mamíferos (generalmente
corazón de buey). Esta
prueba es positiva entre las
2−3 semanas de infección
no tratada. Existen 2
pruebas:
◊ Prueba de la
floculación o VRDL
o RPR: La
cardiolipina que
actúa de Ag se
combina con la
reagina (Ac tipo Ig
E) que el huésped
produce para dar
aglutinación visible.
◊ Prueba de
Wassermann o
Fijación de
complemento: Las
reaginas del suero
fijan el
complemento en
presencia de
cardiolipinas .
Estas pruebas no
treponémicas tienen
gran sensibilidad.
♦ Prue
trepo
Se
utiliz
para
141
conf
Los
Ag
utiliz
son
trepo
y
se
utiliz
test
de
fluor
deno
prue
FTA
y
de
aglut
(TPH
que
tiene
la
venta
de
que
es
senc
y
no
nece
micr
de
fluor
Tam
se
utiliz
ELIS
⋅ TRATAMIENTO
Penicilina, siendo
alternativas
eritromicina,
cefalosporinas y
tetraciclinas.
3.− BORRELIA
3.1 Introducción
Es una espiroqueta
de mayor tamaño,
con espirales más
amplias e
142
irregulares, son
móviles y existen
especies patógenas
para el hombre y
animales,
originándose fiebres
recurrentes y
endémicas. Es
anaerobio con
metabolismo
fermentativo y se
tiñen con facilidad,
son gram − , se
cultivan in vitro con
medios complejos y
enriquecidos.
3.2 Especies más
importantes
Todas las bacterias
son transmitidas por
artrópodos:
⋅ Piojo:
dando lugar
a Borrellia
recurrentis,
que provoca
fiebres
recurrentes
a nivel
mundial.
⋅ Garrapata:
produciendo
Borrellia
hispanica
que produce
fiebres
recurrentes
endémicas
en España.
También
por
garrapatas
se transmite
la Borrellia
turicatae y
Borrellia
hermsii que
producen
fiebres
143
recurrentes
en Estados
Unidos.
Borrellia
burgoloferi
produce la
enfermedad
de Lyme,
etc.
3.3 Patología
1.− Fiebres
recurrentes:
Se manifiesta como
una enfermedad
septicémica febril
con periodo de
incubación de 3−15
días, la fiebre
persiste y continua
con periodos
afebriles de varios
días o semanas
pudiéndose repetir
las recidivas hasta
10 veces en
pacientes no
tratados. Esto ocurre
por las variaciones
antigénicas que se
van produciendo en
el microorganismo.
A causado grandes
epidemias en la 2ª
guerra mundial con
un millón de casos
declarados,
calculándose en más
de 9 millones las
infecciones reales.
Actualmente es
anormal en nuestro
país.
2.− Enfermedad de
Lyme.
Es una enfermedad
cuyo agente
etiológico se conoce
144
desde 1981, que
produce una
reacción
inflamatoria que en
su inicio aparece
como un eritema
crónico migratorio
(ECM),
acompañado de
mialgias, fiebre y
adenopatías
semanas o meses
más tarde produce
complicaciones
como
meningoencefalitis,
artritis, miocarditis,
etc.
Se da en España,
pero las dificultades
de su diagnóstico
hace que se detecten
menos casos de los
que se podrían
esperar.
3.4 Tratamiento
Penicilinas y
tetraciclinas.
3.5 aislamiento y
Características
bioquímicas
Se toma la muestra
de sangre en estados
febriles y se realiza
tinción de gram y
giemsa, también se
realiza inoculación
en animales de
experimentación por
ejemplo ratas y en
ocasiones también
se realizan técnicas
serológicas.
4. LEPTOSPIRA
4.1. Introducción
145
Formada por
espiroquetas finas
con espiras
regulares muy
numerosas y
apretadas con sus
extremos
ligeramente
incursados. Son
móviles. Se tiñen
débilmente con
gram siendo gram −
también con Giensa
e impregnación
argéntica.
Se pueden cultivar
in vitro en medios
ricos en albúmina y
con ácidos grasos.
Su metabolismo es
oxidativo y
necesitan
condiciones
aerobias.
Existen en la
naturaleza
Leptospiras
saprófitas y
parásitas. En el
hombre pueden
originar
lectosporiasis que
originan cuadros
febriles. El
reservorio son
animales y de hecho
las lectosporiasis se
consideran
zoonosis.
4.2. Especies más
importantes
◊ Lectospira biflexia:
no es patógena para
el hombre y es
abundante en agua.
◊ Lestospira
interrogans: que da
lugar a cepas
146
parasitarias.
4.3. Patología
Presentan cuadros
clínicos variados de
leves a muy graves
y en ocasiones
mortales. Tras
incubación de 5 días
a 3 semanas surge
una 1ª fase febril,
donde la Leptospira
se disemina por el
aparato circulatorio
originando
leptospiremia. Le
sigue una 2ª fase de
lectospiuria y en
algunos casos
también aparece en
heces. Cuando la
gravedad es extrema
aparece ictericia,
hapetomegalia,
hematuria, nefritis,
es decir principal
afectación renal y
hepática.
4.4. Tratamiento
Tetraciclinas,
penicilinas
4.5. Aislamiento y
características
bioquímicas
Toma de muestra
sanguínea en
periodos febriles. Si
la toma es de orina
se realizara a los 10
− 15 días de la
enfermedad y recién
cogida se intentara
visualizar la
Leptospira por
examen directo así
como aislarla en
medios específicos
147
como Jonhson −
Harrys. Esto se
realiza
inmediatamente ya
que la Leptospira se
destruye con
facilidad. Si la
muestra es suero se
recurre a muestras
inmunológicas para
demostrar la
presencia de Acs
frente a Leptospira
como pruebas de
fijación de
complemento,
ELISA, ect.
TEMA 22.−
BACILOS GRAM
NEGATIVOS NO
FERMENTADORES
DE GLUCOSA.
PSEUDOMONAS.
1.−
INTRODUCCIÓN
2.−
PSEUDOMONAS
2.1 Características
2.2 Clasificación
⋅ Primer
grupo
(pigmentos
fluorescentes)
: P.
Aeruginosa,
P. Putria y
P.
Fluorescens.
⋅ Segundo
grupo
(producen
el muermo)
: P. Mallei y
P.
Pseudomallei.
⋅ Tercer
148
grupo
(excepcionalmente
patógenas) :
P. Cepacea,
P.
Diminuta,
P.
Maltopila y
P.
Acidovorans.
2.3 Poder patógeno.
⋅ Antigenos:
Ag.
somático O,
Ag.
flagelñar H
y Ag.
mucoide M.
⋅ Toxinas:
enterotoxina
y
eritrodermica.
⋅ Piocianina.
2.4 Patología.
1º A nivel
respiratorio:
⋅ sinusitis,
neumonía,
faringitis,
etc.
2º A nivel del
aparato circulatorio:
⋅ endocarditis
en
drogadictos
y personas
con SIDA.
3º A nivel del
aparato digestivo:
⋅ enterocolitis,
principalmente
pacientes
con SIDA.
4º A nivel del
sistema nervioso:
⋅ meningitis
149
en neonatos
e
inmunodeprimidos.
5º A nivel del
aparato urinario:
⋅ pielonefritis.
6º A nivel de la piel:
⋅ infecciones
graves por
quemaduras.
7º A nivel del
sistema
osteoarticular:
⋅ artritis.
8º A nivel de ojos y
oídos:
⋅ ceguera y
sordera.
En casos graves
bacteriemia y
muerte.
2.5 Aislamiento y
características
bioquímicas.
3.− OTROS
MICROORGANISMOS
NO
FERMENTADORES
DE GLUCOSA.
1.−
INTRODUCCIÓN
Son
microorganismos
que aparecen como
saprofitos o como
comensales de
hombres y animales.
En ocasiones se
asocian a
infecciones
afectando sobretodo
a
inmunodeprimidos.
Todos son
150
incapaces de
fermentar la
glucosa. El principal
patógeno es
Pseudomona
aeruginosa,
considerado como
el segundo agente
patógeno
nosocomial después
de E.coli.
2.−
PSEUDOMONAS
2.1 Características
Son bacilos gram −,
aerobios estrictos,
oxidasa + y
móviles, con
flagelación polar a
excepción de P.
Mallei que es
inmóvil. No
fermentan los
hidratos de carbono,
pero pueden usar los
azúcares
oxidándolos. Es
catalasa + y salvo
alguna excepción no
forman cápsula, no
son esporulados.
De 27 especies sólo
8 tienen importancia
clínica por el
posible efecto
patógeno que
podrían
desencadenar.
2.2 Clasificación
⋅ Primer
grupo: se
caracteriza
por dar
pigmentos
fluorescentes.
Se pueden
151
encontrar de
forma
saprofita en
piel y tubo
digestivo,
aunque
puede
crecer en
órganos
debilitados
(quemados,
graves
infecciones)
provocando
cuadros
graves y
mortales
(septicemias).
⋅ Segundo
grupo:
generalmente
se asocian a
zoonosis,
aunque se
podrían
aislar en el
hombre. P.
Mallei es el
agente
causal del
muermo
(zoonosis
transmitida
generalmente
por equinos
que produce
alteraciones
cutáneas,
cuyo agente
causal es P.
mallei).
2.3 Poder patógeno
(Pseudomonas
aeruginosa).
Presentan 3
antígenos:
⋅ Antígeno
somático O.
⋅ Antígeno
flagelar H.
152
⋅ Antígeno
mucoide M.
Presenta también
toxinas:
⋅ Enterotoxina,
que provoca
nauseas,
vómitos,
dolor
abdominal,
etc.
⋅ Eritrodermica.
⋅ Y en
ocasiones
también
toxinas con
mecanismo
de acción
parecido a
la toxina
diftérica
que
disminuye
el consumo
de oxigeno.
También es capaz
de formar ciertas
sustancias, como la
piocianina que es un
pigmento azulado
de acción
bactericida o la
fluoresceína de
color verde amarillo
o incluso pigmentos
melénicos de color
marrón.
2.4 Patología
Dependerá de que
los cuadros sean
graves o muy
graves, del carácter
oportunista, es
decir, de las
características del
huésped.
1.− A nivel
respiratorio:
153
⋅ sinusitis
⋅ neumonía
⋅ faringitis,
etc.
2.− A nivel del
aparato circulatorio:
⋅ endocarditis
en
drogadictos
y personas
con SIDA.
3.− A nivel del
aparato digestivo:
⋅ enterocolitis,
principalmente
pacientes
con SIDA.
4.− A nivel del
sistema nervioso:
⋅ meningitis
en neonatos
e
inmunodeprimidos.
5.− A nivel del
aparato urinario:
⋅ pielonefritis.
6.− A nivel de la
piel:
⋅ infecciones
graves por
quemaduras.
7.− A nivel del
sistema
osteoarticular:
⋅ artritis.
8.− A nivel de ojos
y oídos:
⋅ ceguera y
sordera.
En casos graves
bacteriemia y
muerte.
2.5 Aislamiento y
características
154
bioquímicas
Se realizará un
frotis y tinción de
gram (si la pus es
azulada se
sospechará de la
existencia de P.
aeruginosa).
También tinción de
flagelos o tinción
con anticuerpos
fluorescentes para
poder visualizar
piocianina o
pioverdina. Se
cultiva a 37ºC.
Es importante el
estudio de los
pigmentos pudiendo
distinguir 4:
⋅ Piocianina:
color
azulado que
puede
adquirir el
medio y es
característico
de P.
Aeruginosa
es el único
que la
posee).
⋅ Pioverdina:
color verde.
⋅ Eritorgeno:
color rojo.
⋅ Melenico:
color
marrón.
Se pueden presentar
distintas colonias:
⋅ R: rugosas.
⋅ S: lisas.
⋅ M:
mucoide.
⋅ Medio de
cultivo:
Agar
155
cetrimida.
En otros
medios
como
Mckonkey,
agar sangre,
podemos
ver
hemólisis
con olor
característico
a fruta,
debido a la
producción
de
aminoacetofenona,
lo que
ayuda a su
identificación.
⋅ Toma de
muestras:
generalmente
se realiza de
cualquier
producto
patológico
de carácter
purulento.
Características que
ayudan a la
identificación de
Pseudomonas
aeruginosa
1º En agar sangre
aparición de
colonias azuladas y
olor afrutado.
2º Catalasa, oxidasa
y reducción de
nitratos + .
3º Crecimiento a
42ºC.
4º Oxidación de
glucosa y hidrólisis
de arginina.
5º Tolerancia a la
cetrimida.
156
TRATAMIENTO
Es resistente a la
mayor parte de los
antibióticos,
excepto
aminoglucosidos,
carbencilinas y
colistina.
3.− OTROS
BACILOS GRAM
− NO
FERMENTADORES
DE GLUCOSA.
(Ver pregunta 5 de
fotocopia)
TEMA 23.−
ENTEROBACTERIAS
I
1.
INTRODUCCIÓN.
2.
CARACTERÍSTICAS
MÁS
IMPORTANTES.
3. ESTRUCTURA
ANTIGÉNICA.
3.1 Antígenos: O, H
y K (capsular).
3.2 Toxinas:
exotoxinas,
endotoxinas,
hemolisinas y
colimicinas.
4. GÉNEROS.
4.1 Fermentadores
rápidos de lactosa.
4.2 Fermentadores
lentos de lactosa.
4.3 No
157
fermentadores de
lactosa
5. PRUEBAS
BIOQUÍMICAS.
6. AISLAMIENTO
Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS.
6.1 Medios de
cultivo:
⋅ Diferenciales
poco
selectivos:
McKonkey
y EMB.
⋅ Diferenciales
selectivos:
SS, XLD y
Hektoen.
⋅ Complejos
diferenciales:
KIA y TSI.
6.2 Caldos de
enriquecimiento:
⋅ Selenito.
⋅ Tetrationato.
6.3 Prueba de la
DNAasa.
1.INTRODUCCIÓN.
Son bacilos gram −,
aerobios y/o
anaerobios
facultativos,
móviles (con
flagelación) o
inmóviles que en la
última edición del
manual de Bergey's
se clasifican en la
familia
Vibrionaceae.
Se caracterizan por
ser fermentadores
de glucosa, suelen
158
ser huéspedes
habituales del tracto
gastrointestinal de
hombres y animales,
produciéndose en
muchas ocasiones
efectos patógenos,
en otros casos puede
actuar como
saprofito de la flora
intestinal.
Se pueden encontrar
en agua y suelo y se
pueden comportar
como oportunistas.
2.
CARACTERÍSTICAS
MÁS
IMPORTANTES.
⋅ Son
cocobacilos
gram −.
⋅ Aerobios
y/o
anaerobios
facultativos.
⋅ Móviles o
inmóviles.
⋅ Oxidasa −.
⋅ Catalasa +.
⋅ Fermentadores
de glucosa.
⋅ Reducen
nitratos a
nitritos.
⋅ Son muy
importantes
las pruebas
del INVIC,
KIA y TSI.
⋅ Pueden
producir
gran
cantidad de
fermentos
como
gelatinazas,
descarboxilasas,
ureasas y
159
galactosidasas.
⋅ Algunos
pueden
producir
sulfhídrico.
⋅ Presentan
gran
similitud
biológica
con los
vibrios, por
eso se
estudian
conjuntamente
aunque los
vibrios son
oxidasa +.
3.−
ESTRUCTURA
ANTIGÉNICA
3.1.−
ANTÍGENOS
⋅ Antígeno
somático O:
Termosestable,
ligado a la
pared
bacteriana
siendo una
endotoxina
que
presenta
una parte
proteica
responsable
del poder
antigénico,
y una parte
lipídica
responsable,
en parte de
la toxicidad.
⋅ Antígeno
capsulado
K: De
naturaleza
polisacárida
con
propiedades
antiparasitarias.
160
⋅ Antígeno
flagelar H:
De carácter
proteico y
responsable
de la acción
patógena de
las
bacterias.
3.2.− TOXINAS
⋅ Exotoxina:
son
enterotoxinas.
⋅ Endotoxinas:
responsables
del shock
tóxico.
⋅ Hemolisinas:
las
producen
algunas
cepas.
⋅ Colimicinas:
susutancias
son efecto
antibiótico
(son tóxicas
para las
cepas de la
misma o
distinta
especie de
las cepas
que las
producen).
4.− GÉNEROS DE
ENTEROBACTERIAS
Las enterobacterias
siempre han sido
clasificadas en
función de su
capacidad de
fermentar la lactosa.
Hay tres grupos:
◊ Fermentadores
rápidos de lactosa:
en él se encuentran
Escherichia coli,
Klebsiella y
161
Enterobacter.
◊ Fermentadores
lentos de lactosa: se
encuentran
Citrobacter,Serratia,
Yersinia y Shigella
sonnei. Estos dos
grupos de les
denomina
coliformes por su
capacidad de
fermentar la lactosa.
◊ No fermentadores
de lactosa: son no
coliformes, se
encuentran
Salmonella,
Shigella y Proteus.
5.− PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
(Ver tabla 13.2)
6.−
AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
6.1.− MEDIOS DE
CULTIVO
Los medios más
utilizados son:
1.− Medios
diferenciales poco
selectivos: Permiten
ver las diferencias
entre fermentadores
y no fermentadores
de lactosa. Se
utilizan:
• Mackonkey
(MK):
donde
los
fermentadore
aparecen
formando
colonias
162
rosas
y
los
no
fermentadore
colonias
incoloras
• EMB
(Medio
eosina
azul
de
metileno
o
Levine)
2.− Medios
diferenciales más
selectivos: Son:
• Agar
SS
• Medio
XLD
• Medios
Ektoen
3.− Complejos
diferenciales: Son:
• KIA
(agar
triple
Fe):
contiene
lactosa
y
glucosa
• TSI
(triple
azucar
Fe):
contiene
lactosa,
glucosa
y
sacarosa
Tanto TSI como
KIA son medios
sólidos en tubo que
constan de 2 partes:
a.− Parte superior
acabada en pico de
163
flauta que permite
ver el crecimiento
aerobio
b.− Parte inferior
que permite ver el
crecimiento
anaerobio.
La siembra se hace
a partir de una
colonia bien aislada,
tanto en la
inclinación como en
el fondo.
Las reacciones que
pueden tener lugar y
sus interpretaciones
son:
Parte
Fondo
aeróbica
Inclinació
roja y fon
amarillo,
hay
fermenta
de la gluc
Alcalino Ácido
Parte
Fondo
aeróbica
Amarillo
Amarillo,
Ácido
Ácido fermenta
de glucos
lactosa.
Rojo / Ro
Alcalino Alcalino hay
fermenta
Indica
inclinació
/ fondo
naranja, n
Sin
hay
Alcalino
cambio fermenta
de azucar
únicamen
utiliza las
peptonas
164
Los medios KIA y
TSI permiten
observar si hay
producción de gas
en cuyo caso
aparecerá burbujas
de aire o elevación
del medio y en
ocasiones
desquebrajamiento
del medio.
A las bacterias
productoras de gas
se les denomina
aerogénicas y las
no productoras
anaerogénicas.
La producción de
sulfhídrico se pone
de manifiesto con la
aparición de
coloración negra,
debido a las sales
ferrosas como
consecuencia de la
reacción del
sulfhídrico con Fe
3+.
Por tanto KIA y TSI
ponen de manifiesto
tres características:
⋅ Capacidad
para
fermentar la
lactosa
(KIA) o
lactosa y
sacarosa
(TSI).
⋅ Producción
de gas por
fermentación
de azucares.
⋅ Producción
de
sulfhídrico.
6.2.− Caldos de
enriquecimiento
165
Para que las
bacterias se
multipliquen y
crezcan podemos
utilizar caldos de
enriquecimiento, ej.:
⋅ caldo
selenito !
Salmonella
⋅ caldo
tetrationato
!
Salmonella
y Shigella.
Estos caldos son
muy utilizados en
las pruebas de
heces, se toma con
una torunda la
muestra y se
disuelve en dicho
caldo 24 − 48 h.
6.3.− Prueba de la
ADNasa
Se realiza sobre un
agar que contiene
verde de metilo
como indicador y
ADN como sustrato.
Los organismos que
producen ADNasa
se identifican por la
producción de una
zona clara alrededor
de la colonia.
TEMA 24.−
ENTEROBACTERIAS
II
1.−
SALMONELLA
1.1.− Introducción
1.2.− Epidemiología
1.3.− Acción
patógena e interés
166
clínico
⋅ Fiebres
tifoideas
⋅ Fiebres
paratifoideas
⋅ Infección
gastrointestinal
1.4.− Tratamiento
1.5.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
2.− SHIGELLA
2.1.− Introducción
2.2.− Acción
patogénica e interés
clínico
⋅ Ag O y K
⋅ Exotoxinas
(neurotoxina,
citotoxina y
enteroinvasiva)
2.3.− Tratamiento
3.−
ESCHERICHIA
COLI
3.1.− Introducción
3.2.− Clasificación
según cuadro
clínico
◊ Enteropatógenas
◊ Enterotoxígena
◊ Enterohemorrágica
◊ Enteroinvasiva
3.3.− Profilaxis y
tratamiento
3.4.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
4.− YERSINIA
167
4.1.− Introducción
4.2.− Especies más
importantes
◊ Yersinai pestis
(bubónica,
pulmonar y
septicémica)
◊ Yersinia
pseudotuberculosis
◊ Yersinia
enterocolítica
4.3.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
5.− OTRAS
ENTEROBACTERIAS
(OPORTUNISTAS)
1.−
SALMONELLA
1.1.−
INTRODUCCIÓN
El género
Salmonella es el
responsable de un
gran número de
gastroenteritis por
los alimentos.
Es móvil, con
flagelación
perítrica, no
coliforme, no
esporulado y casi
nunca capsulado.
Tiene un carácter
más o menos
patógeno según las
especies.
1.2.−
EPIDEMIOLOGÍA
Las fuentes más
frecuentes de
infección son las
168
aves (pollos, patos,
etc.) y sus productos
(huevos).
Los brotes suelen
aparecer por
ingestión de
alimentos que
contienen huevos
crudos o carnes
poco hechas, dado
que la Salmonella es
sensible al ácido
gástrico se tienen
que ingerir un gran
número de
microorganismos
(106−109 o/ml. o
gr.) para que
aparezcan los
síntomas,
multiplicándose en
el intestino delgado.
1.3.− ACCIÓN
PATOGÉNICA E
INTERÉS
CLÍNICO
Su acción
patogénica va a ser
dependiente de los
antígenos
estructurales y
toxinas. Poseen 3
antígenos:
⋅ Antígeno
somático O.
⋅ Antígeno
flagelar H.
⋅ Antígeno
capsular K.
También posee una
endotoxina y una
enterotoxina
responsable del
efecto irritante y en
ocasiones citotóxico
sobre el tracto
intestinal.
169
Las especies del
género Salmonella
pueden actuar sobre
el hombre y
animales, los más
importantes son: S.
typhi, S. paratyphi,
S. choleraesuis y S.
enteritidis.
Los principales
cuadros clínicos
son:
a.− Fiebres
tifoideas(S. Typhy)
y Fiebres
paratifoideas(S.
paratyphi)
La Salmonella tras
ser ingerida llega al
intestino delgado y
penetra por
endocitosis
destruyendo parte
de la mucosa
intestinal. Una vez
dentro la
Salmonella son
fagocitadas por
macrófagos
originando una
primera
bacteriemia que
tiene una duración
de 8−15 días, a
partir de aquí hay
un comienzo brusco
de signos y
síntomas de la
enfermedad.
La Salmonella en
sangre es de nuevo
captada por los
mononucleares y de
aquí pasa al bazo,
hígado, etc.
produciendo la
multiplicación de
nuevas Salmonellas,
170
volviendo de nuevo
al intestino donde
provocan unas
placas ulceradas con
necrosación
denominadas placas
de peyer y en casos
más graves pueden
originar perforación
y hemorragias.
Las fiebres pueden
alcanzar 40ºC y
durar varias
semanas. Van
acompañadas de
dolores de cabeza,
anorexia, debilidad,
dolor muscular, etc.
El germen se
elimina a través de
las heces
(Salmonella en
heces es patógeno)
b.− Infecciones
gastrointestinales
Es la infección más
frecuente en caso de
Salmonella. El
periodo de
incubación es de
8−48 horas de haber
ingerido el alimento
contaminado.
Aparecen nauseas,
vómitos, etc.
El síndrome
requiere tratamiento
de
aproximadamente 6
días. Puede ser que
no existan bacterias
en sangre , sin
embargo sí aparecen
en heces.
Las personas más
propensas a padecer
171
la infección son
niños, ancianos e
inmunodeprimidos.
Tras una infección
de fiebres tifoideas
un 1−3% se vuelven
portadores crónicos
eliminándolo en las
heces durante largos
periodos de tiempo.
Desde el punto de
vista
epidemiológico
tiene gran
importancia dado
que de este modo se
contribuye a la
diseminación del
patógeno.
En las salmonelosis
no tifoideas menos
del 1% de los
pacientes van a
seguir excretando el
bacilo por heces.
1.4.−
TRATAMIENTO
Ampicilina,
cloranfenicol,
trimetropim,
sulfametoxazol y
cefalosporinas.
1.5.−
AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
Toma de muestras
Se realiza en
alimentos
contaminados,
sangre y heces.
En caso de
enfermedades
172
gastrointestinales
son importantes los
coprocultivos y
alimentos
sospechosos.
En casos de fiebres
tifoideas y
paratifoideas las
muestras se
obtienen de sangre,
orina y heces.
2.− SHIGELLA
2.1.−
INTRODUCCIÓN
Bacilo gram −, no
esporulado, no
flagelado, no
produce
desaminasas, ni gas,
ni H2S.
2.2.− ACCIÓN
PATOGÉNICA
Se debe a los
factores antigénicos
0 y K y a la
producción de
toxinas,
principalmente
exotoxinas que
presentan
propiedades
citotóxicas,
neurotoxicas y
enteroinvasivas.
La toxina esta
compuesta por 2
subunidades:
⋅ subunidad
b, que actúa
adheriendose
a las células
del epitelio
gastrointestinal
(efecto
173
enteroinvasivo).
⋅ subunidad
a, cuyo
mecanismo
consiste en
el bloqueo
de la
síntesis
proteica
(efecto
citotóxico
que origina
un estado de
necrosis
celular con
la
consiguiente
formación
de ulceras,
hemorragias
y
perforaciones,
siendo un
cuadro
clínico muy
grave.
Cualquier especie
de Shigella al llegar
al intestino
comienza a ejercer
la acción toxica para
pasar después al
colón complicando
el proceso, lo que
origina neurosis y
en general los
signos y síntomas
anteriormente
descritos.
Los cuadros
diarreicos van
acompañados de
dolor cólico,
nauseas, vómitos,
fiebre y
deposiciones cada
vez más
sanguinolentas
(disentería bacilar),
con moco y pus, los
más afectados son
174
los niños.
2.3.−
TRATAMIENTO
El mismo que para
Salmonellas y
también
fluoroquinolonas.
3.−
ESCHERICHIA
COLI
3.1.−
INTRODUCCIÓN
Y
CLASIFICACIÓN
SEGÚN EL
CUADRO
CLÍNICO
Bacilo gram
negativo, no
esporulado, móvil
con flagelos
períticos, raramente
capsulado y su
capacidad
antigénica se debe a
los Ag O y K
confiriéndole
propiedades
antifagocitarias y de
resistencia frente a
sustancias
bactericidas,
proporcionándole
con ello alto poder
invasivo.
También presenta
distintos tipos de
toxinas, así los
cuadros clínicos de
las cepas
patogénicas para el
hombre son más o
menos variables
según el tipo de
toxina que la
origina:
175
◊ Escherichia coli
enteropatógena:
forma una
enterotoxina
citotóxica con
cuadros diarreicos
en brotes
epidémicos que
afecta
principalmente a
niños y lactantes.
◊ Escherichia coli
enterotoxígena:
forma una
enterotoxina
semejante a la del
Vibrio cholerae,
provocando
procesos diarreicos
que afecta a niños y
adultos. Produce la
diarrea del viajero.
◊ Escherichia coli
enterohemorrágica:
es similar a Shigella
disenteriae que
produce procesos
diarreicos graves de
tipo hemorrágico
(sangre).
◊ Escherichia coli
enteroinvasiva: se
presenta
principalmente en
niños y adultos
produciendo
cuadros diarreicos
graves con fiebre,
dolor abdominal,
diarreas con gran
contenido de moco
junto con leucocitos
y PMN.
En Escherichia coli
no se recomienda
dar profilaxis
antibiótica para
diarrea del viajero
con el fin de evitar
cepas resistentes, sí
es conveniente
176
tomar precauciones
como tomar agua
embotellada, no
consumir hortalizas
crudas, etc. En caso
de padecer esta
infección se
procederá a la
restauración del
equilibrio
electrolítico.
3.2.−
TRATAMIENTO
El tratamiento en
lactantes es
neomicina y en
adultos
fluorquinolonas.
3.3.−
AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
Escherichia coli es
saprofito del tubo
digestivo y en
general su presencia
en agua y alimento
es indicativo de
contaminación fecal
reciente.
A parte de
trastornos
gastrointestinales
puede originar otras
lesiones urinarias,
biliares, infección
de heridas y lesión
en meninges
principalmente en
neonatos.
Es uno de los
principales
microorganismos
productores de
infecciones
nosocomiales.
177
En cuanto a las
pruebas
bioquímicas,
destacar:
⋅ las de la
tabla 13.2
⋅ las pruebas
del IMVIC
⋅ Kliger
4.− YERSINIA
4.1.−
INTRODUCCIÓN
Bacilo o cocobacilo
gram negativo con
flagelación
peritrica, moviles a
25 ºC e inmoviles a
37ºC. No fermentan
la lactosa, no
forman esporas y
excepcionalmente
pueden presentar
capsula.
4.2.− ESPECIES
MÁS
IMPORTANTES
Son: Yersinia pestis
Yersinia
pseudotuberculosis
Yersinia
enterocolitica
1.− YERSINIA
ENTEROCOLITICA
Afecta
principalmente a
animales aunque
también al hombre y
principalmente a
niños.
Es un patógenos
capaz de crecer a
temperaturas de
178
refrigeración (4ºC),
por lo que es un
microorganismo a
tener en cuenta en
industria
alimentaria.
Se requiere un
inóculo de 109 o
/gr para adquirir la
infección. Tras un
periodo de
incubación de 4−7
días aparecen
síntomas clínicos
como: dolor
abdominal, fiebre y
en ocasiones
diarrea. En los casos
en los que no hay
diarrea se confunde
la yersioniosis con
apendicitis aguda.
Afecta a niños de
5−15 años y
principalmente en
Europa.
Es sensible a
aminoglucosidos,
cloranfenicol y
trimetroprim−sulfametoxaz
No se recomienda la
utilización de Ab en
caso de que los
síntomas solo sean
gastrointestinales,
ya que la infección
suele ser
autolimitada.
2.− YERSINIA
PESTIS
Es el agente causal
de la peste en el
hombre. Se origina
de forma epidémica,
da lugar a cuadros
agudos y febriles
con alta inflamación
179
de ganglios
linfáticos,
hemorragias
internas, petequias y
cuadros
septicémicos y de
neumonía.
Es grave y muy
contagiosa aunque
para ello es
necesario la
presencia de ratas y
roedores,
encargados de su
diseminación. Se
origina en lugares
de salubridad baja.
Los factores de
virulencia que
determinan la
gravedad de
Yersinia pestis son:
⋅ Toxina
murina: de
carácter
proteico;
bloquea la
utilización
de oxígeno
por parte de
ciertas
células y en
general sólo
se liberan al
medio
cuando
muere la
bacteria.
⋅ Endotoxinas:
liberadas
por la
bacteria en
el
transcurso
de la
enfermedad;
están
relacionadas
con el
180
proceso
febril.
⋅ Antígeno V:
le confiere
propiedades
antofagocitarias.
⋅ Coagulasas
y
fibrinolisinas.
A Yersinia pestis
también se le
denomina Yersinia
bubónica; Llega al
hombre a través de
pulgas infectadas
por ratas con peste.
Tras la picadura de
la pulga atraviesa
los vasos linfáticos
y de aquí a los
ganglios donde se
multiplica formando
bubones
(inflamación de los
ganglios). De aquí
pasa a sangre y
posteriormente se
disemina por bazo,
hígado, pulmones,
piel y mucosas
donde aparecen
lesiones con
carácter piógeno,
hemorrágico,
necrótico y
edematoso.
En casos graves
puede aparecer
coagulación
intravascular por
acción de las
coagulasas y
hemorragias por
acción de las
fibrinolisinas,
colapso circulatorio,
toxemia
generalizada y
muerte.
Existen varias
181
formas clínicas
dependiendo de su
localización. Las
más importantes
son:
◊ Peste bubónica: Es
la más frecuente y
tras un periodo de
incubación de 3−7
días aparecen los
primeros síntomas
con escalofríos,
vómitos, bubones en
ingles, axilas y zona
submaxilar. Si no
hay tratamiento se
produce la muerte.
◊ Peste pulmonar: Es
una complicación
de la peste
bubónica,
produciéndose una
afectación pulmonar
grave con
insuficiencia
respiratoria, siendo
altamente mortal.
◊ Peste septicémica:
Corresponde a los
últimos estadíos de
la peste en
cualquiera de sus
formas, pulmonar o
bubónica. Es
generalmente
mortal.
4.3.−
AISLAMIENTO Y
CARACTERÍSTICAS
BIOQUÍMICAS
La toma de muestra
es a través de
exudados
purulentos, bubón,
sangre, LCR, tejido
pulmonar, esputo,
etc.
5.− OTRAS
182
ENTEROBACTERIAS
OPORTUNISTAS
⋅ Klebsiella,
Enterobacter
y Serratia
producen
enfermedades
nosocomiales.
⋅ Klebsiella
neumoniae
es el agente
etiológico
del 3% de
las
neumonías
de origen
bacteriano.
Afecta
principalmente
a individuos
con diabetes
mellitus y
alcohólicos
con
infección
pulmonar
crónica.
⋅ Enterobacter
se asocia a
infecciones
de heridas,
quemaduras,
e
infecciones
del tracto
urinario y
respiratorio.
⋅ Serratia
coloniza el
tracto
respiratorio
y urinario
de pacientes
hospitalizados.
⋅ Citrobacter
se asocia a
infecciones
respiratorias
y urinarias
y, en
ocasiones,
183
en neonatos
se ha
aislado en
meningitis.
⋅ Proteus,
Morganella
y
Providencia
se han
relacionado
con
enfermedades
del tracto
urinario;
tienen la
capacidad
de
hidrolizar
urea con
liberación
de
amoniaco
produciendo
la
alcalinización
de la orina
que induce
a la
formación
de cálculos
renales. La
movilidad
de Proteus
favorece la
invasividad
del tracto
urinario. El
género
Providencia
se ha
asociado a
bacteriemias
en pacientes
con
catéteres
venosos.
TEMA 25.−
LEGIONELLA,
GARDNERELLA,SPIRILI
HIMUS,STREPTOBACILL
MOVILIFORMES
Y
184
CALYNMATOBACTERIU
GRANULOMATIS
1.−
LEGIONELLA
NEOMOFILA
1.1.− Introducción
1.2.− Hábitat
natural y patogenia
de la infección
1.3.− Interés clínico
1.4.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
1.5.− Tratamiento
2.−
GARDNERELLA
VAGINALIS
2.1.− Introducción
2.2.− Hábitat
natural e interés
clínico
2.3.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
2.4.− Tratamiento
3.−
STREPTOBACILLUS
MOVILIFORME
(produce la Fiebre
Norverhill)
4.− SPIRILIUM
HIMUS (produce la
Fiebre de Sodoku)
5.−
CALYNMATOBACTERIU
GRANULOMATIS
(produce
Granuloma inguinal
185
o Donovalosis)
1.− LEGIONELLA
NEOMOFILA
1.1.− Introducción
Presenta 29
especies, tres
subespecies y
distintos subgrupos.
De ella Legionella
neomofila es el
patógeno mas
frecuente. Se aisló
por 1ª vez en 1976 a
partir del tejido
pulmonar en un
brote de pulmonía
ocurrida en un
grupo de legionarios
de Philadelfia por lo
que se conoce como
la enfermedad de
los legionarios.
Es un bacilo gram
−, aerobio, de 0,5 −
2 micras que
produce potentes
citotóxicas que
pueden ser
responsables de la
lesión tisular del
pulmón. La mayor
parte de las especies
posee flagelos.
Todas las especies
son catalasa y
gelatina +, en
general, no
fermentan ni oxida
HC y es nitrato − y
urea −. Los
aminoácidos son su
mayor fuente de
energía y todas las
especies necesitan
N − cisteína para su
crecimiento.
186
1.2.− Hábitat
natural y
patogenia de la
infección
El hábitat es el agua
y a partir del agua
se pueden
contaminar
residencias,
cuarteles, hospitales
Este
microorganismo
resiste Tª de hasta
60º C y se a aislado
en agua fría y
caliente, sistemas de
aire acondicionado
con desagües. Los
aerosoles que se
generan en estos
ambientes son la
principal fuente de
infección. Los
pacientes de alto
riesgo que pueden
adquirir en
enfermedades a
través de esta fuente
en los hospitales.
Legionella es un
parásito intracelular
facultativo, se
desarrolla en el
interior del
citoplasma de
células respiratorias,
en ella se libera
enzimas como
lipasa, nucleasas,
fosfatasas y
potentes enzimas
proteolíticos que
dan lugar a la
destrucción celular.
En el organismo
humano se replica
preferentemente en
los macrófagos
alveolares.
187
1.3.− Interés
clínico
La enfermedad de
los legionarios es
una neumonía
aguda con
manifestaciones
multisistémicas que
pueden presentarse
como brotes
epidémicas e
infecciones
nosocomiales. Tiene
principal influencia
en los meses de
verano siendo mas
frecuente en el
hombre que en la
mujer.
El periodo de
incubación es de
una semana. La
enfermedad
comienza con fiebre
aguda, mialgia,
debilidad y tos no
productiva.
Posteriormente
comienza los
síntomas
respiratorios con
esputo
sanguinolento o
purulento, disnea,
dolor pleural,
bradicardia,
anorexia y en
general un cuadro
típico de neumonía
atípica. También va
acompañado de
síntomas
extrapulmonares
como confusión,
desorientación,
vómitos, nauseas,
diarrea
La radiografía del
tórax muestra un
188
filtrado pulmonar y
a menudo derrame
pleural. Otras
alteraciones
analíticas es un
aumento de
creatinina,
hipolatremia,
hipofosforemia y
aumento de
transaminasas sin
ictericia, aumento
de VSG e
insuficiencia renal.
Los factores que
favorecen la
infección son la
inmunosupresión,
cirugía reciente,
edad elevada y
tabaquismo.
Además produce un
cuadro semejante a
la gripe que se
denomina fiebre de
Pontiac,
caracterizado por
fiebre, tos, mialgia,
dolor torácico,
diarrea
1.4.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
Toma de muestras:
Generalmente son
respiratorias aunque
también existen
muestras
extrarespiratorias
como liquido
peritoneal,
pericardico,
exudados de heridas
y en ocasiones
hemocultivo.
El esputo es una
muestra valida para
189
el cultivo de
Legionella ya que
no forma parte de la
flora normal. Si el
paciente no
expectora, se tomara
una muestra por
broncoscopia.
En el transporte se
debe evitar el uso
con solución salina
porque el Na inhibe
el crecimiento de
Legionella.
En cuanto al
diagnostico
microbiológico
destacaremos:
◊ Examen directo: se
pueden hacer
tinciones de gram,
giensa, Jiménez
aunque son muy
útiles las técnicas de
inmunofluorescencia
directa. El hecho la
inmunofluorescencia
sea negativa no
excluye la
enfermedad y es
necesario realizar
un cultivo.
◊ Pruebas
serológicas:
principalmente RIA
y ELISA el
inconveniente es
que no están
comercializadas.
◊ Técnicas de
hibridación de ADN
con PCR.
En cuanto a los
medios de cultivo el
más utilizado es:
Bcye − . Las
placas se incuban a
35º C en atm. De
190
CO2 con humedad,
un mínimo de 7 días
algunos laboratorios
incuban 2 semanas
antes de desecharlas
como −, la
identificación de las
colonias se hacen
comparándola con
una cepa control a
las que se dan pases.
1.5.− Tratamiento
Principalmente
eritromicina y en
ocasiones
rifampicina.
2.−
GARDNERELLA
VAGINALIS
2.1.− Introducción
Se suelen agrupar
en bacilos gram −
pero se caracterizan
por tener una pared
laminar no típica de
gram + y gram −,
por tanto, es un
bacilo gram
variable, es
anaerobio
facultativo y
oxidasa y catalasa
−.
2.2.− Hábitat
natural e interés
clínico
Se encuentra en
flora vaginal de
mujeres sanas de un
20 − 70 % este
microorganismo
desempeña un papel
importante en el
síndrome de
vaginosis
191
bacteriana
caracterizado por:
⋅ Exudado
vaginal
maloliente
⋅ Ph vaginal
mayor 4, 5
⋅ Flujo
vaginal
abundante
⋅ Pruebas de
las aminas
+. Esta
prueba
consiste en
mezclar una
gota de
KOH al
90% con
una gota de
exudado
vaginal y si
es + se
aprecia un
fuerte olor a
pescado
podrido.
⋅ Presencia
de células
CLUE, que
son células
epiteliales
recubiertas
de bacterias.
En vaginosis
bacteriana el
síndrome se
caracteriza por la
presencia de al
menos 3 de los
síntomas expuestos,
también se ha
descrito bacteriemia
debido a
Gardnerella
vaginalis sobre todo
en la fiebre post
parto o post aborto.
También esta
asociado a
meningitis neonatal,
192
peritonitis, abscesos
hepáticos e
infecciones
urinarias.
2.3.− Aislamiento y
Características
bioquímicas
La toma de muestra
se realizara de
exudado vaginal y
es preferible la toma
de 2 muestras:
⋅ para
examen
directo
⋅ para cultivo
que se
realiza entre
48 − 72 h
con medios
semiselectivos
con agar
sangre
humana con
colistina y
ácido
nalidísico.
Para su
determinación se
utilizan pruebas
bioquímicas,
enzimáticos y
cromatografiítas
acompañados de
APIs.
2.4.− Tratamiento
Metromidazol,
clindamicina y
gentamicina.
3.−
STREPTOBACILLUS
MOVILIFORMES
Son bacilos gram −
pleomórficos y
anaerobios
193
facultativos. Se
encuentra en
nasofaringe de ratas.
El hombre adquiere
la infección por
mordedura,
arañazos de ratas u
otros roedores.
Produce la fiebre de
Norverhill que se
adquiere tras ingerir
leche, agua u otra
comida
contaminada.
La fiebre por
mordedura de rata
consiste en
aparición rápida de
fiebre, cefaleas,
nauseas y en un 75
% aparecen eritema
primero macular
papilar en la palma
de la mano y planta
del pie.
También puede
haber diarreas y en
la mitad de los
pacientes poliartritis
migratoria.
En ocasiones
existen
complicaciones
graves como
neumonías,
meningitis,
endocarditis.
Se aísla en
hemocultivos y
líquido sinovial y
crecen en medio con
agar sangre y
chocolate a 35º
El tratamiento:
penicilina,
estreptomicina y
194
tetraciclina.
4.− SPIRILiUM
HIMUS
Produce la fiebre de
Sodoku, se produce
por mordedura de
rata y la
sintomatología va a
ser igual que el del
Streptobacillus
moviliformes.
⋅ CALYNMATOBAC
Son bacilos gram −,
pleomorficos, no
móviles y
capsulados.
Produce la
donovalosis o
granuloma
inguinal. La
enfermedad se
adquiere por vía
sexual y se
caracteriza por
aparición de
lesiones ulcerosas
en el área ano
genital y algunas
veces también en el
área extragenital. La
mejor muestra es
una biopsia donde
se realiza tinción de
giemsa. La
donovalosis se
caracteriza por la
presencia de
cuerpos de Donovan
que consiste en
reacciones donde el
microorganismo
aparecerá como
racimos teñidos de
azul oscuro o negro
en el citoplasma de
células
mononucleares.
195
No existen medios
de cultivo eficaces.
Tratamiento es
penicilina,
tetraciclina y
gentamicina.
TEMA
26.−IDENTIFICACIÓN
BACTERIANA
1.− PRUEBA DE
IDENTIFICACIÓN
◊ Epidemiología.(1ª
evaluación)
◊ Morfología.(1ª
evaluación)
◊ Tinciones.(1ª
evaluación)
◊ Pruebas de
susceptibilidad.(tema
de antibióticos)
2.− SISTEMAS
COMERCIALES
Y SISTEMAS
AUTOMÁTICOS
2.1 Sistemas
multipruebas:
⋅ Macrotécnicas:
KIA y TSI.
⋅ Microtécnicas:
API, Tubos,
otros.
⋅ Sistemas
rápidos:
tiras
reactivas,
métodos
automáticos.
2.2 APIS.
⋅ Introducción.
⋅ Fundamento.
⋅ Material.
⋅ Reactivos.
⋅ Técnica:
1º Preparación de la
196
galería.
2º Preparación del
inóculo.
3º Realización de la
inoculación.
4º Periodo de
incubación.
5º Resultados e
interpretación.
API
Es un sistema de
10−20 microtubos
que contienen los
medios
deshidratados. Se
cultivan con una
suspensión
bacteriana que los
rehidrata. Durante la
incubación el
metabolismo del
microorganismo
origina cambios en
el color del medio o
bien se produce al
añadir reactivos.
La interpretación de
estos cambios se
produce mediante
tablas de lectura u
otros sistemas
automáticos.
Si la practica la
realizamos
manualmente
obtendremos un
perfil numérico que
nos servirá para la
identificación de
microorganismos.
(Ver figura 17.15 y
libros de
Staphylococos y
197
Enterobacterias)
TEMA 27.−
ANTIMICROBIANOS
Y PRUEBA DE
SENSIBILIDAD A
LOS
ANTIMICROBIANOS
1.−
CLASIFICACIÓN
2.−
CONSIDERACIONES
PRÁCTICAS
2.1.− Elección de
antibiótocos
2.2.− Controles
durante la
antibioterapia
2.3.− Fallo en la
respuesta
2.4.− Asociación de
antibiótocos
3.−
ANTIBIÓTICOS
EN
SITUACIONES
ESPECIALES
3.1.− Embarazo
3.2.− Lactancia
3.3.− Antibióticos
en insuficiencia
renal
4.−
DEFINICIONES
4.1.− Antibiótico
sensible
4.2.− CMI
4.3.− CMB
198
4.4.− Coeficiente
terapéutico
4.5.− Resistencia
5.− MÉTODOS
DE
ANTIBIÓTICOS
5.1.− Dilución
⋅ Sólido
⋅ Líquido
5.2.− Difusión.
Fuentes de error son
debidas a:
⋅ Medio
⋅ Antibióticos
⋅ Microorganismo
⋅ Observador
5.3.− Elucción de
discos
6.−
RESISITENCIA A
LOS
ANTIMICROBIANOS
6.1.− Alteración de
permeabilidad
6.2.− Alteración de
blanco o diana
6.3.− Inactivación
enzimática
6.4.− Reflujo
6.5.− Bloqueo
1.−
CLASIFICACIÓN
1.1.−
−LACTÁMICOS
En su estructura
química presentan
un anillo
−lactámico.
199
Su mecanismo de
acción se basa en la
inhibición de la
formación de
peptidoglucano
componente
esencial de la pared
celular. Para ello se
fijan a las PDP/PFD
(proteínas fijadoras
de penicilina). Su
acción suele ser
bactericida y los
grupos principales
son:
◊ Penicilinas
◊ Cefalosporinas
◊ Carbapenemas
◊ Monobactamas
◊ INBIL (inhibidores
de −lactamasa)
1.− PENICILINAS
La base se estos
compuestos es el
6−amino
penicilánico
(6−APA).
Dentro de las
penicilinas hay
varios grupos:
◊ Penicilina G y V: Se
suelen administrar
oralmente. Son
útiles para gram
positivos como
neumococo,
streptococo,
strptococo
pyogenes,
anaerobios,
espiroquetas y
enterococo. No es
activa frente a
enterobacterias.
Presenta baja
toxicidad y se
asocian a procaína
200
y benzatina para
prolongar la
semivida plasmática
(concepto de tiempo
de activación de los
Ab en el
organismo),
también se puede
unir al probenecid
que bloquea su
excreción por los
túbulos renales.
◊ Aminopenicilinas:
Se destacan la
ampicilina y
amoxicilina. Son de
amplio espectro
(pueden actuar
sobre gram
positivos y gram
negativos). Actúan
bien sobre
enterobacterias
aparece resistencia
en cepas de
Escherichia coli.
◊ Isoosazolil: Son
penicilinas
resistentes a
penicilasas y son
muy útiles como
tratamiento de
elección para
Staphylococos
aureus. Las
principales son:
oxacilina,
cloxacilina y
meticilina.
◊ Carboxipenicilinas:
Se recomiendan
para gram
negativos,
principalmente para
Enterobacterias y
Psudomonas. La
principal es la
carbenicilina.
◊ Ureidopenicilinas:
Muy utilizado frente
a enterococos y
streptococos,
201
destacando la
piperacilina.
2.− Cefalosporinas
El núcleo es el
7−aminocefalosporamico
(7−ACA)
Proceden de
productos de
fermentación de
hongos del genero
Cefalosporium cuyo
anillo básico es el
anterior.
Se clasifican por
generaciones
estando en
desarrollo la 4ª
generación;
◊ 1º generación:
actúan sobre gram +
y tiene una acción
moderada sobre
gram −. Destacan:
cefalotina y
cefactor.
◊ 2º generación: útiles
sobre gram − y
algunos anaerobios.
Destacan cefoxitina
y cefamandol.
◊ 3º generación:
aunque disminuye
su actividad sobre
gram + aumenta
sobre gram −.
Destaca
Cefotaxima. Hoy
existen preparados
activos sobre vía
oral como cefixima.
3.− Carbapenemas
El principal es
IMIPENEM. Tiene
la siguiente
estructura:
202
Es inestable y
destruido por
dihidropeptidasas
renales por lo que se
une a lafilaxtatina
para evitarlo. Tiene
un gran espectro de
acción generalmente
todos los cocos
gram + y gram −,
bacilos gram +,
anaerobios y la
mayor parte de
enterobacterias y
algunas
pseudomonas son
sensibles a él.
Es resistente a
Staphilococo
Aureus y no se
absorbe por vía oral.
4.− Monobactamas:
Son derivados
monociclicos cuyo
principal
representante es
aztreonam cuya
formula es:
Se caracteriza por
tener un espectro
más reducido siendo
activo solo gram −
especialmente
pseudomonas y
enterobacterias
5.− INBIL
Inhibidor de
−lactamasa. Su
actividad
antimicrobiana es
reducida pero su
unión irreversible
sobre algunos
−lactamasa
impiden que estos
destruyan los Ab
203
−lactámicos por lo
tanto estos
inhibidores suicidas
deben ir asociados a
otros Ab
−lactámicos
proporcionando un
aumento de su
espectro. Destaca el
Ácido clavulanico,
cuya estructura es:
1.2.−
INHIBIDORES
DE LA SÍNTESIS
PROTEICA
Antibióticos que
actúan sobre la
subunidad 30s de
los ribosomas
⋅ Aminoglucósidos:
Son
antibióticos
naturales y
semisintéticos.
Son
potentes
bactericidas
y pueden
derivar de
Streptomyces
o
Micromonospora
(son
hongos).
Los
principales
aminoglucosidos
son:
Streptomicina,
Gentamicina,
Trobamicina,
Neomicina,
Amikacina.
El mecanismo de
acción se centra en
el ribosoma en la
subunidad 30s,
produciéndose una
inhibición de la
204
síntesis proteica o
proteínas
defectuosas por
error en la lectura
del ARNm. Son
muy activos sobre
gram − entre ellos
Psudomonas,
Acinetobacter y
sobre gram + como
Staphylococo
aureus.
Pueden presentar
sinergismo con
−lactámicos, con
los que
frecuentemente se
asocian.
Las reacciones
adversas más
importantes son
toxicidad renal y
auditiva.
⋅ Tretraciclinas:
Son
antibióticos
de amplio
espectro
bacteriostático
que se unen
a la
subunidad
30S del
ribosoma
inhibiendo
la síntesis
proteica.
La más utilizada es
la Doxiciclina que
presenta un amplio
espectro sobre gram
− y + (Ej: Brucella,
Vibrio, Micoplasma,
Micobacterium,
Clamidia, etc.).
En la actualidad el
nivel de resistencia
de Neumococos y
205
Enterobacterias es
elevado.
No se utilizan en
niños menores de 8
años ya que pueden
afectar a la
dentición y huesos.
Pueden provocar
trastornos
gastrointestinales y
hepáticos.
5
6
Tetraciclina
CH2OH
Clortetraciclina
CH2OH
Doxicilina
OH CH3
Antibióticos que
actúan sobre la
subunidad 50s de
los ribosomas:
⋅ Cloranfenicol:
Su acción se
sitúa en la
subunidad
50s del
ribosoma,
impidiendo
la
transpeptidación.
Su espectro
abarca gram
− y + (Ej:
anaerobios,
espiroquetas,
micoplasmas,
etc.),
aunque se
suelen
reservar
para
infecciones
graves ya
que produce
toxiinfección
medular.
Si: R es NO2
−−−−−−−−− >
Cloranfenicol.
206
R es
CH2−SO2−−−−>
Tranfenicol
⋅ Macrólidos:
Dentro de
este grupo
tenemos dos
principalmente:
• Eritromicin
que
procede
de
Streptomyces
Es
un
antibiótico
de
medio
espectro
que
actúa
a
nivel
de
la
subunidad
50s
impidiendo
la
transpeptidac
y
translocación
inhibiendo
la
elongación
de
la
cadena
proteica.
Su
espectro
abarca
gram
+,
Micoplasma,
Trachomatis
Legionella,
siendo
resistentes
las
Enterobacter
207
• Clindamicin
es
un
antibiótico
frente
a
anaerobios
y su
espectro,
mecanismo
de
acción
y
farmacología
es
parecida
a
los
macrólidos.
Se
considera
por
esto
compuesto
similar
a
los
macrólidos.
1.3.−
QUINOLONAS Y
FLOXACINAS
Son quimioterápicos
que se obtienen por
síntesis química; su
mecanismo de
acción se basa en la
inhibición de la
ADN−girasa,
enzima necesaria
para la duplicación
del ADN.
Son bactericidas.
El primero que se
introdujo fue el
ácido nalidíxico
como antiséptico de
vías urinarias.
La norfloxacina
208
supuso una
ampliación de
espectro sobre gram
positivos y
pseudomonas.
La Ciprofloxacina
se puede utilizar en
infecciones distintas
de las vías urinarias
debido a la buena
concentración que
alcanza en los
tejidos. Presenta
buena actividad
sobre parasitos
intracelulares y
amplio espectro.
Puede actuar sobre
Rickettsias,
micobacterias,
parásitos
intestinales y
genitales. Se puede
utilizar por vía oral.
El uso desmedido
de las quinolonas
llevan a un aumento
de la resistencia.
R1
Ac. Nalidíxico −CH2−CH3
Norfloxacina −CH2−CH3
Ciprofloxacinol
1.4.−
GLUCOPÉPTIDOS
Destacan la
vancomicina y
teicoplamina.
Tienen actividad
sobre los gram
positivos. Presentan
toxicidad renal y
ótica y no se
absorben por oral.
Están reservados
para infecciones por
gram positivos
resistentes. Su
mecanismo de
209
acción se dirige
contra la formación
de la pared celular
inhibiendo la
síntesis de
peptidoglucanos.
1.5.−
SULFAMIDAS Y
TRIMETROPRIM
Ambos inhiben a
distintos niveles la
síntesis de ácido
fólico. Se utiliza el
trimetroprim−sulfametoxaz
Las sulfamidas
derivan del
paraaminobencenosulfamida
cuya estructura es:
Suele administrarse
por vía oral. No se
utiliza en neonatos
porque compite con
la bilirrubina.
Presenta un amplio
espectro que
comprende gram
positivos, gram
negativos,
actinomicetales,
clamidias y algunos
parásitos como
toxoplasma,
plasmodium, etc.
1.6.−
NITROIMIDAZOLES
Destaca el
metroimidazol que
es bactericida.
Actúa sobre el ADN
y es útil sobre
anaerobios y
algunos parásitos
como triquina,
tricomonas y
entamoeba.
210
1.7.− OTROS
ANTIBIÓTICOS
⋅ Nitrofurantoína:
es un
antiséptico
de vías
urinarias y
actúa sobre
gram
positivos y
gram
negativos.
⋅ Ácido
fusídico:
actúa sobre
Staphylococos
aureus
⋅ Rifampicina:
esun
antituberculoso;
también
actúa contra
el
meningococo,
gonococo,
clamydias y
haemophylus.
⋅ Fosfomicina:
de origen
español, de
amplio
espectro
que actúa a
nivel de la
pared
celular.
2.−
CONSIDERACIONES
PRÁCTICAS
2.1.− ELECCIÓN
DEL
ANTIBIOTICO
Para elegir un
fármaco hay que
tener en cuenta:
⋅ microorganismo
⋅ condiciones
de la
211
infección
⋅ condiciones
del paciente
Siempre que sea
posible, el
tratamiento debe ser
elegido o iniciado
sólo después de que
se haya determinado
el agente etiologico;
esto nos obliga a un
conocimiento de los
principales
gérmenes
implicados en
infecciones
específicas así como
el Ab más
específico para cada
gérmen.
Un punto
importante a tener
en cuenta son las
condiciones del
paciente. Tenemos
que considerar la
posible historia de
hipersensibilidad,
estado inmunitario,
función hepática y
función renal. Una
vez determinadas
dichas condiciones
debemos elegir el
Ab que debe
cumplir los
siguientes
requisitos:
⋅ ser el más
activo y
específico, a
ser posible
bactericida
⋅ menos
tóxico
⋅ más barato
2.2.− CONTROL
DURANTE LA
ANTIBIOTERAPIA
212
Son necesarios
debido a la
aparición de efectos
secundarios. Estas
medidas son más
necesarias en
aquellas
condiciones en las
que se prevea un
mayor riesgo por
edad, alteración
hepática, renal, etc.
Estas medidas
incluyen controles
químicos,
hematológicos,
bioquímicos,
bacteriológicos, etc.
2.3.− FALLOS DE
RESPUESTA
Ante este problema
se debe plantear de
nuevo toda la
sistemática
relacionada con la
elección del Ab. Si
las causas son:
◊ Debidas al germen:
⋅ Que no sea
el agente
etiológico
⋅ Que
presente
resistencia
⋅ Que haya
sobreinfección
(haya más
de un
microorganismo
implicado
en la
infección)
⋅ Debidas al
antibiótico:
• Que
no
sea
el
Ab
213
adecuado
para
el
germen
• Que
no
sea
la
vía
de
administració
adecuada
• Que
no
sea
la
dosis
adecuada
• Debidas
a
característica
del
paciente
o de
su
infección:
♦ Prese
de
cuerp
extra
♦ Acce
insuf
dren
(la
sang
no
llega
al
lugar
de
infec
♦ El
pacie
no
cump
el
trata
2.4.−
ASO
DE
ANT
214
Los
objet
que
se
persi
con
la
asoc
de
Ab
son:
Es
impo
esco
antib
con
distin
meca
de
acció
cuya
acció
tenga
un
efect
sinér
a
ser
posib
bacte
Se
debe
admi
por
sepa
y
cada
uno
en
215
su
dosis
terap
3.−
ANT
EN
SITU
ESP
3.1.−
Emb
Las
regla
gene
para
el
uso
de
Ab
en
gesta
es
el
sigui
♦ Cont
abso
de
drog
antiv
♦ Evita
medi
nuev
♦ Evita
fárm
en
el
1º
trime
♦ Emp
el
meno
nº
de
fárm
en
los
mese
sigui
216
Se
cons
siem
contr
Se
suele
utiliz
amp
eritr
y
mico
3.2.−
Lact
En
la
leche
mate
se
alcan
nivel
simil
a
los
sang
con
el
uso
de
clora
eritr
sulfa
y
tetra
3.3.−
ANT
en
insu
rena
En
pacie
con
insuf
renal
217
se
debe
evita
los
Ab
mas
tóxic
y
los
de
elim
exclu
renal
4.−
Con
4.1.−
antib
Sens
Cuan
un
deter
Ab
alcan
nivel
plasm
igual
a
la
CMI
en
el
lugar
de
la
infec
4.2.−
CMI
La
míni
canti
de
antib
que
inhib
el
creci
218
4.3.−
CMB
Es
la
conc
míni
bacte
(mat
al
micr
4.4.−
Coef
terap
Es
la
relac
entre
la
conc
en
el
lugar
de
la
infec
y
CMI
4.5.−
Resi
Es
cuan
no
inhib
el
creci
5.−
Méto
de
antib
219
5.1.−
Dilu
220
1.−
Prep
diluc
de
antim
a
parti
de
la
soluc
madr
por
el
caldo
de
Müe
2.−
Se
coloc
en
una
serie
de
tubo
de
rosca
1
ml
de
cada
soluc
de
antim
e
inocu
con
1
ml
de
221
susp
de
micr
3.−
Incu
37
º
C
18
−
24
h.
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
261
262
263
264
265
266
267
268
269
270
271
272
273
274
275
276
277
278
279
280
281
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309
310
311
312
313
314
315
316
317
318
319
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
331
332
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