GUÍA RÁPIDA Procedimiento en tubo 1.- Recolectar, mediante venopunción, 1ml de sangre (hasta la línea) de cada paciente en cada uno de los 3 tubos de recolección de sangre QuantiFERON®-TB: 1. Tubo tapón GRIS: Control Nulo 2. Tubo tapón ROJO: Antígenos TB 3. Tubo tapón LILA: Mitógeno 2.- Mezclar el contenido de los tubos girándolos hacia uno y otro extremo de 8 a 10 veces o durante 5 segundos, asegurándonos de que la sangre moja las paredes del tubo y se resuspenden los antígenos liofilizados que se encuentran adheridos a ellas. (muy importante) 3.- Incubar 16-24 horas a 37ºC de forma vertical. 4.- Después del periodo de incubación, centrifugar a 1500-2200 g durante 5-10 minutos. Separar el plasma en tubos (se puede guardar a 4ºC durante 1 semana o a –20ºC o -70ºC, indefinidamente). Cuando se descongelan las muestras, pueden aparecer coágulos de fibrina. Si los coágulos no son muy importantes, se pueden deshacer vorteando las muestras. En caso de ser considerables, habrá que retirarlos con una punta de pipeta o centrifugando los tubos a 1500-2200g durante 5-10 minutos. Conservar las muestras a 4ºC hasta realizar el análisis. En caso de no procesarlas antes de una semana, hay que conservarlas congeladas (-20ºC o -70ºC) ELISA de IFN- humano Antes de empezar a trabajar, hay que preparar los reactivos de la curva estándar, la solución de trabajo del conjugado (X1) y la solución de lavado. 1.- Sacar el kit de la nevera una hora antes mínimo (muy importante) y esperar a que se atemperen los reactivos. 2.- Resuspender el Standard de INF- con agua desionizada con la cantidad que se indica en la etiqueta del vial. Asegurarse que está bien disuelto (vortear si es necesario). La solución de Stock tendrá una concentración de 8 UI/ml. Realice la siguiente dilución para la preparación de los estándares (S1, S2, S3 y S4: 150 L 50 L 150 L Diluyente Verde (Estándar del Kit) 8,0 IU/mL Estándar 1 4,0 IU/mL 50 L 150 L Diluyente Verde Estándar 2 1,0 IU/mL 150 L Diluyente Verde Estándar 3 0,25 IU/mL 150 L Diluyente Verde Estándar 4 (cero) (Diluyente Verde SOLAMENTE) 3.- Diluir el tampón de lavado 20 veces: (1 parte de tampón 20x + 19 partes de agua destilada). 4.- Reconstituir el conjugado con 0.3ml de agua desionizada para tener una solución a una concentración de 100X. La concentración de trabajo es 1X. El volumen a preparar, dependerá del número de tiras que necesitemos (preparar siempre una tira en exceso) como se muestra en la tabla : NÚMERO DE TIRAS VOLUMEN DE CONJUGADO CONCENTRADO 100X VOLUMEN DE DILUYENTE VERDE 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10 L 15L 20 L 25 L 30 L 35 L 40 L 45 L 50 L 55 L 60 L 1,0 mL 1,5 mL 2,0 mL 2,5 mL 3,0 mL 3,5 mL 4,0 mL 4,5 mL 5,0 mL 5,5 mL 6,0 mL Una vez tenemos preparado el conjugado 1X, necesario, hay que guardar a 4ºC, ,inmediatamente después de su uso, el conjugado 100X sobrante, del vial madre. Sacarlo sólo cuando tenga que usarse para preparar solución de trabajo 1X. 5.- Pipetear 50l de conjugado 1X en cada uno de los pocillos. 6.- Añadir 50l de muestra en los pocillos correspondientes en el siguiente orden: · Control Nulo (tubo GRIS) · Antígeno TB (tubo ROJO) · Mitógeno (tubo LILA) 7.- Añadir 50l de los estándares, por duplicado, y en orden decreciente de concentración. 8.- Agitar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas. 9.- Lavar la placa con el programa QUANTI del lavador o manualmente con 400l de tampón de lavado 6 veces. 10.- Pipetear 100l de sustrato en todos los pocillos. 11.- Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. 12.- Parar la reacción añadiendo 50l de solución STOP. 13.-Leer la densidad óptica de la placa con el programa Innolisa. Lectura directa con un filtro de 450nm usando un filtro de referencia de 620nm.