Manual Técnico Biología reproductiva y citogenética de la papa

Manual Técnico
Biología reproductiva y citogenética
de la papa
Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale
Abril 2009
Red LatinPapa
Centro Internacional
de la Papa (CIP)
Biología reproductiva y citogenética de la papa – Manual Técnico
Matilde Orrillo & Merideth Bonierbale
Centro Internacional de la Papa (CIP) 2009
ii
Tabla de Contenidos
Prólogo
iv
Agradecimientos
v
Introducción
vi
1
Biología reproductiva de la papa
1
1.1 El ciclo de vida en papa
1
2
1.1.1
Ciclo de vida asexual
1
1.1.2
Ciclo de vida sexual
1
Mitosis (División nuclear somática)
3
2.1 Determinación de ploidía en células somáticas
3
4
5
4
2.1.1 Método de preparación de cromosomas en raíces de papa
4
2.1.2 Conteo del número de cloroplastos en las células guarda
6
2.1.3 Determinación de ploidía por Citometría de flujo
7
Meiosis
9
3.1 Meiosis I
9
3.2 Meiosis II
11
3.3 Observación de meiosis en células sexuales
12
3.4 Gametos 2n
13
Observación de polen y determinación de su fertilidad
14
4.1 Cultivo de polen in Vitro
14
4.2 Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo)
17
Cultivo in vitro de embriones inmaduros
Literatura consultada
19
21
iii
Prólogo
La citogenética surge de la necesidad de relacionar los hechos descritos por la genética
con los fenómenos que ocurren dentro de la célula u órganos especializados. Ella ha
permitido conocer la estructura y función de cada uno de los componentes de la célula, y de
estructuras más especializadas, en relación con funciones como la reproducción sexual.
La citogenética clásica y molecular ha hecho posible el análisis, interpretación y
trascendencia de ciertas características, desde las más simples a las más complejas
(cromosomas y genes, cromosomas condensados y linearizados), contribuyendo en gran
medida a la resolución de problemas en aspectos taxonómicos, evolutivos y aplicativos.
Asimismo, los estudios citogenéticos permiten realizar valiosos aportes al conocimiento de
los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiación en las plantas.
También permite la observación de los caracteres citológicos de células especializadas, su
función y comportamiento ante cambios del entorno, o la serie de procesos que se suceden
durante la fertilización, aportan conocimiento a la ciencia básica.
En los programas de mejoramiento la citogenética ayuda dilucidar ciertos fenómenos
genéticos, como: el apareamiento y entrecruzamiento entre los cromosomas homólogos, la
relación entre el polen y pistilo (fertilización-fecundación) e identificación de
incompatibilidades, irregularidades meióticas en híbridos, producción de gametos 2n y su
relación con la formación de poliploides, etc.
El presente manual servirá como guía de capacitación de investigadores, profesores,
estudiantes y técnicos. El documento busca llevar a la práctica diversas técnicas clásicas y
básicas, que faciliten la observación e interpretación de parámetros y resultados genéticos,
ayudando a proyectar convenientemente un plan de mejoramiento, así como también en
determinados estudios a nivel molecular.
Los ejemplos y las ilustraciones han sido tomados de la papa, la cual, a pesar de contar con
cromosomas pequeños, hace posible evidenciar ciertos fenómenos al nivel citológico y
estos a su vez relacionarlos con la constitución y el comportamiento genético.
Además, se da los conceptos teóricos en cada uno de los temas tratados, pudiendo estas
técnicas ser aplicadas en otros cultivos.
Los autores
iv
Agradecimientos
La publicación del presente Manual es gracias al soporte financiero de:
•
Red Iberoamericana de Innovación en Mejoramiento y Diseminación de la Papa Red LatinPapa
•
INIA España
•
FONTAGRO
•
Federal Ministry for Economic Cooperation and Development (BMZ)
•
Centro Internacional de la Papa (CIP)
v
Introducción
El número básico de cromosomas en el género Solanum es doce (× =12). En las papas
silvestres y cultivadas existen diferentes números de ploidía, pueden ser 2n=2×=24,
2n=3×=36, 2n=4×=48, 2n=5×=60, 2n=6×=72. El más importante y de gran significación en la
evolución de las especies de la papa es el nivel tetraploide, que cubre un amplio rango de
distribución desde la parte meridional de EE.UU. a la región austral y sur de Chile. El nivel
de ploidía se determina contando el número de cromosomas en las células somáticas y/o
células sexuales. Otro método rápido y directo es por citometría de flujo que cuantifica la
cantidad de de ADN nuclear, sin embargo necesita de un aparato llamado citómetro de
flujo.
El análisis citogenético ha sido ampliamente usado en estudios de genética,
comportamiento de los cromosomas, compatibilidad cromosómica, evolución, filogenia,
origen y taxonomía, así como también para determinar la viabilidad del polen evaluando su
fertilidad tanto in vitro como in vivo (germinación in situ); determinar la presencia de
gametos no reducidos, el mecanismo por los cuales se producen etc., estudios que nos
permitirán estimar el potencial de las especies o híbridos para propósitos de mejoramiento
permitiéndonos desarrollar las estrategias a seguir en la transferencia de resistencias a
enfermedades, plagas, etc., a través de la manipulación de ploidía.
Y es a través de la biología reproductiva ya sea asexual o sexual por la cual las plantas
producen nuevos individuos, así:
Microsporogénesis, megasporogénesis, barreras de pre y post fertilización, mutantes
meióticos, polinización, embriogénesis, desarrollo del endospermo, etc., están involucrados
en todo el proceso de vida, y su entendimiento nos provee de una guía para la selección de
las hibridizaciones que serían exitosas tanto artificialmente como en la naturaleza,
proporcionando las llaves para una eficiente y efectiva manipulación del material del
germoplasma silvestre, cultivado y avanzado de papa. Alguno de los más importantes tipos
de información necesitada por un mejorador incluye los principios de genética y
citogenética.
Nuevas técnicas citológicas moleculares como FISH, GISH, DNA fibers, abren actualmente
un abanico de oportunidades, sirviendo como intermediario entre mapas físicos y mapas
genéticos, mostrando posiciones aproximadas de genes y marcadores moleculares, en sus
distancias relativas a marcadores estructurales como centrómeros, telómeros, bandas de
heterocromatina y constricciones secundarias.
vi
Capítulo 1. Biología reproductiva de la papa
1.1 El ciclo de vida en papa
Hay una generación diploide, que consiste en una serie de divisiones mitóticas, seguido por
meiosis. Continúa con una serie de divisiones haploides, seguido de la fusión de dos
núcleos haploides (gametos), para dar un diploide. Es convencional llamar a la fase
haploide gametofito y la diploide esporofito.
1.1.1 Ciclo de vida asexual
Reproducción vegetativa de la papa: Asegura la conservación clonal del genotipo, una
nueva planta se forma a partir de tubérculos, brotes o yemas dando lugar a clones
genéticamente idénticos a la planta original, reproducción que se realiza por mitosis. La
propagación asexual ha sido una gran ventaja para los mejoradores de papa puesto que se
puede fácilmente obtener un genotipo seleccionado y multiplicarlo. Otro uso práctico de la
propagación asexual es el cultivo de tejidos y el cultivo de meristemas para la erradicación
de algunos patógenos.
1.1.2 Ciclo de vida sexual
Reproducción sexual de la papa: Permite que el material genético de dos individuos se
combinen y se formen nuevas combinaciones alélicas, requiere de la participación de
órganos reproductivos femeninos (pistilos) y masculinos (anteras) y por el proceso de
polinización se formen bayas con semillas y cada una de estas constituye un nuevo
individuo.
Morfología floral: las flores se encuentran reunidas en agregados llamados inflorescencias,
sosteniendo a la inflorescencia se encuentra el pedúnculo, y lo que sostiene a cada flor es
el pedicelo, que está dividido en pedicelo inferior y superior.
Una flor contiene 2 juegos de envolturas florales: el cáliz y la corola los que forman el
receptáculo floral ubicado debajo de las partes fértiles de la flor y compuesto por los
estambres y el pistilo. El estambre consiste de un corto filamento que sostiene a la antera
con dos lóbulos que contiene el polen, los cinco estambres se encuentran separados de la
corola. El pistilo está diferenciado en ovario, en la parte baja lleva los óvulos, el estigma es
el que recibe el polen y el estilo es el que conecta a ambos. Cada óvulo contiene una célula
madre llamada megaspora, la cual está rodeada de un tejido llamado nucela y de un
integumento, cuando es fertilizado y maduro el óvulo desarrolla en una semilla.
Esta fase comprende dos aspectos: Meiosis y fertilización.
El más importante acontecimiento de la reproducción sexual es la creación de variación
genética, nuevos genotipos con atributos genéticos de ambos padres pueden estar
combinados en las semillas formadas. De dos eventos en la meiosis como es el “crossing
over” en la Profase I y la separación al azar de bivalentes en Metafase I, podemos decir que
cada producto es un único genotipo. El uso práctico de la reproducción sexual es lo que
constituye una de las formas para la conservación de germoplasma, especialmente
silvestre, otro uso es para la producción de semilla verdadera de papa.
1
•
Megasporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido del ovario (contiene de
300 a 600 óvulos) y en las células madre de las megasporas, dando lugar a células
reproductoras llamadas sacos embrionarios, que contienen al gameto femenino u
ovocélula. Una célula materna, megaspora, mediante la I y II división meiótica forma
4 megasporas, las 3 superiores degeneran y la inferior se convierte en megaspora
funcional, esta dará origen al saco embrionario, que se agranda por
megagametogenesis ocurriendo tres divisiones mitóticas, sin citocinesis que darán
origen a 8 núcleos que al orientarse forman el saco embrionario. Uno de los 3
núcleos del extremo micropilar del saco embrionario se trasforma en huevo
funcional. Hay varias alternativas en la formación del saco embrionario, la descrita
ocurre en la mayoría de las Angiospermas.
•
Microsporogénesis. Este proceso tiene lugar en el tejido esporágeno de las
anteras, los núcleos de células madres del polen son muy largas justo antes de la
meiosis y en la formación de las tétradas de las microsporas la pared de callosa
alrededor de cada célula madre del polen puede ser detectada durante la iniciación
de la meiosis y en cada nueva microspora joven de la tétrada, la que es también
separada por una capa de callosa después de la II división meiótica, tan pronto
como la formación de la pared externa del polen empiece a formarse, la callosa
empieza a desaparecer. Las capas meristemáticas que dan origen a las diferentes
estructuras u órganos en las plantas, son denominadas L1 que dan lugar a la
epidermis (cloroplasto), L2 que forman las hojas, tallos y flor (órganos sexuales) y la
L3 que generan los tejidos internos del tallo.
2
Capítulo 2. Mitosis (División nuclear somática)
Este proceso ocurre en las células conocidas como meristemas (raíces, hojas, flores) y
meristemas axilares, estas estructuras tienen la capacidad de dividirse a lo largo de todo el
ciclo de vida del organismo.
Es un proceso continuo, en el cual se suceden en una secuencia cuidadosamente
ordenada los complejos preparativos para la división, por la cual se hace un reparto
equitativo del material genético ya duplicado entre las dos células resultantes, manteniendo
así la ploidía original de la célula. Implica que cada cromátida pueda migrar a un diferente
polo, separación que es posible mediante el huso mitótico o acromático, estas fibras están
formadas de microtúbulos y sus proteínas asociadas por un proceso de polimerización, que
se asocian a las cromátides permitiendo que cada una migren hacia los polos una vez que
ambas se separan a nivel centromérico.
Esta polimerización puede ser inhibida experimentalmente y muchos tratamientos con
sustancias como la colchicina, 8-hidroxiquinoleína, Tjio y Levan (1950), paradiclorobenceno, piretroides (Klein, 1990, Watanabe y Orrillo 1993, Chen, 2005) y
tratamiento por frío pueden efectivamente acumular células en metafase y cromosomas
condensados durante la mitosis. La mitosis comprende una división nuclear y somática
(citocinesis) lo que permite que los organelos pasen más o menos al azar a una u otra de
las dos células.
El más importante carácter de la mitosis es que el número cromosómico permanece
constante a través de sucesivas divisiones celulares, con una exacta distribución de
cromosomas en las nuevas células formadas, genéticamente idénticas entre sí,
manteniéndose la ploidía original de la célula.
Convencionalmente la mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y
telofase.
•
Interfase. Es el periodo entre las sucesivas divisiones donde los cromosomas son
prácticamente invisibles aún con la ayuda del microscopio, durante esta fase antes
que la célula se divida tiene lugar la replicación, que es la síntesis del ADN y
formación de las fibras que conforman el uso mitótico o “spindle” bipolar. Este
periodo pertenece a las etapas G1, S, G2. El genoma completo se replica una y solo
una vez en cada ciclo.
•
Profase. En esta etapa se aprecia la aparición nítida de los cromosomas en el
núcleo, ya están suficientemente condensados y son visibles bajo el microscopio
óptico. Se ve, que cada cromosoma consiste en dos copias longitudinales, llamadas
las cromátidas hermanas, se observan claramente unidas por los centrómeros, el
nucléolo pierde visibilidad, la membrana nuclear desaparece, el huso acromático va
tomando cuerpo y muchas fibras cortas lo forman, las fibras polares, que llegan
desde cada polo del huso a la región central hasta la mitad y las fibras cinetocóricas
que se insertan en los cromosomas duplicados. Como vemos, estos dos grupos de
fibras posibilitan la separación de las cromátidas hermanas durante la mitosis, los
cromosomas inician un proceso de acortamiento y engrosamiento. Al final de la
profase, los cromosomas están completamente condensados y con la desaparición
de la envoltura nuclear, quedan en contacto con el citoplasma.
3
•
Metafase. En esta etapa, los pares de cromátidas, se acortan y se alinean en un
solo plano alrededor del centro de la célula, se observan más gruesas.
•
Anafase. En esta etapa se duplican y separan los centrómeros y las cromátidas
hermanas se liberan, se repelen y son engarzadas por las fibras del huso que hacen
tracción sobre ellas, dirigiéndose a los polos, convirtiéndose cada cromátida en un
nuevo cromosoma. A medida que continúa la anafase, los dos conjuntos idénticos
de cromosomas se mueven hacia los polos opuestos del huso.
•
Telofase. Al iniciarse esta etapa se nota la futura región nuclear y aparece la
membrana nuclear, los cromosomas pierden su estado de condensación y se
alargan. Comienza la formación del nucléolo. Se produce simultáneamente la
citocinesis, o sea la segmentación y separación del citoplasma, se termina de formar
la placa celular, la nueva pared celular entre las células recién formadas.
2.1 Determinación de ploidía en células somáticas
Ploidía es un término referido al número de grupos o “juegos” de cromosomas que una
célula posee.
2.1.1 Método de preparación de cromosomas en raíces de papa
Para una correcta determinación del número de cromosomas es necesario contar con
técnicas citológicas que den buenos resultados, con un número aceptable de metafases
contables, con cromosomas bien separados y coloreados, por lo que las muestras deberán
ser colectadas en estado de metafase. Para la acumulación de cromosomas metafásicos
varios pre-tratamientos químicos son usados y el mejor protocolo usado en nuestro
laboratorio es descrito (Watanabe y Orrillo, 1993). No hay una técnica universal, cada
laboratorio toma una o varias técnicas de acuerdo a las exigencias de cada cultivo.
El conocer la ploidía de una especie es de gran ayuda en la determinación taxonómica y de
gran importancia en los programas de mejoramiento.
La papa no es una especie ideal para estudios citogenéticos. Los cromosomas somáticos
de S. tuberosum miden de 1.0 a 3.5 μm (Dong et al., 2000), nuevas técnicas (FISH; GISH,
Fiber FISH), estudios de cromosomas en estadío de Paquiteno, permiten hoy la
identificación de los cromosomas y la caracterización del genoma de la papa. Figs. 1, 2 y 3.
1. Materiales
Sembrar en macetas pequeñas, con musgo bien fino, o vermiculita tubérculos bien
brotados (también se pueden usar “esquejes” de plantas bien enraizadas, semillas
germinadas, plantas de in vitro). La colección de raíces se realiza en plantas bien
pequeñas de unos 5 -10 cm de altura. Unas horas antes de colectar es conveniente
regar bien las plantas. La colección de las raíces se hace generalmente temprano,
en la mañana alrededor de las 11 am.
2. Pre-tratamiento
Usando una pinza de punta bien fina se colecta puntas de raíces, aproximadamente
de 10 mm y se coloca en frasquitos o “vials” conteniendo agua destilada a
temperatura ambiente, después de 1 h pasar a una solución de (Permetrina:
La composicion quimica que figura en el envase es la siguiente: (3-Fenoxifenil)metil
4
Método de preparación de cromosomas en raíces de papa
Colección de raíces en:
(H2O destilada + 15uL Permetrina, pH
5-5.8)
Eliminar la solución
de pre-fijación
Hidrólisis con HCl 1 N
previamente precalentado
24
horas
Colocar las raíces en Placa
Petri
Eliminar la solución &
Adicionar H2O destilada
8-10 min a 600C
Fig. 1: Toma de la muestra de raíces de papa, prefijación e hidrólisis con HCl.
Tinción con Lacto-Propiónico Orceína (15min
aprox.)
Cortar 1-2mm de la punta de las
raíces
Aplastado
(Squash)
Presionar para extender el
tejido
Lámina lista
Fig. 2: Coloración con lacto propiónico orceína, aplastado (squash).
a
Observar al
microscopio
4X
2X
4X
Fig. 3: Observación de células en metafase de raíces de papa, ploidías 2× y 4×.
b
(±) cis-trans 3-(2,2-dicloroetenil) 2,2-dimetil carboxilato de cicloropropano
(Permetrina),15 μl en agua helada a pH 5 a pH 5.8, por 24 horas a 4° C. Caso de no
tener disponible la Permetrina, utilizar agua helada por 48 horas a 4° C, colocando
las botellitas conteniendo las raíces en un termo con hielo.
3. Fijación
Es optativo, se puede obviar este paso si es que se desea ver las muestras
inmediatamente, caso de querer guardar las muestras por más tiempo se fijaran en
alcohol 96 % 3p: ácido acético 1p; y se deja a medio ambiente por 24 horas.
Si se quiere guardar en fijador hacerlo en alcohol de 70% y en refrigeración a 4° C,
prepare suficiente cantidad de solución fijadora, de tal manera de cubrir bien las
raíces. Los fijadores se preparan al momento de ser usados.
4. Hidrólisis
Se colocan las muestras en HCl 1N a 60° C de temperatura, por 8 -10 minutos; el
ácido se calentara previamente, transcurrido el tiempo de hidrólisis se procederá a
quitar el ácido y a lavar con agua destilada.
5. Coloración
Con lacto-propiónico orceína u orceína-acética, se procede a colocar las raíces en
pequeños contenedores o Petris conteniendo el colorante.
6. Aplastado o squash
Se colocan las raíces en un porta-objeto, usamos solamente 1-2 mm de la punta,
con una gota del mismo colorante (también podemos usar ácido acético al 45 %), se
coloca un cubre-objeto y asegurando uno de los extremos procedemos con una
varilla de goma, o un borrador de un lápiz o la punta de él a presionar suavemente, o
dando golpecitos repetidos, pero firmes, permitiendo la disociación del tejido.
Colocar el porta-objeto entre papel de filtro y presionar fuerte con el dedo pulgar
“squash”, pero tratando de evitar cualquier movimiento lateral del porta-objeto.
7. Observación
La muestra se coloca bajo microscopio óptico, inicialmente a 10 X, 20 X con el
objetivo de seleccionar las mejores metafases y luego pasar a objetivos de 40 X y
100X para el conteo de cromosomas, las células deben estar intactas, no
superpuestas ni con artefactos que puedan distorsionar el conteo exacto de
cromosomas.
Preparación de Lacto-propiónico orceína: Disolver 1 g de orceína en una mezcla de 23
ml de ácido láctico y 23 ml de ácido propiónico a temperatura ambiente, completar a 100 ml
con agua destilada, agitar bien y filtrar (Haskell y Wills, 1968) NOTA: Para obtener buenos
resultados es necesario tener muy buenas raíces, finas, no muy gruesas; las plantas deben
estar en perfecto estado de desarrollo.
Pre - tratamiento
Propósito: Separación de los cromosomas, acortarlos, y la clarificación de los
centrómeros a fin de hacerlos visibles para chequear el número básico.
5
Otro pre-tratamiento que da buenos resultados es con agua helada, en lugar del uso
de Permetrina, se utiliza agua destilada helada por 48 horas a 4° C y colocando los
frascos (vials) que contienen las raicillas en un termo en el cual se ha colocado
cubitos de hielo con agua, el resto del procedimiento es igual.
Otras técnicas utilizan:
8-Hidroxiquinoleía, es insoluble en agua y éter. Soluble en alcohol, acetona,
cloroformo y benceno.
Preparación: 0.002M, solución en agua destilada. Pesar 0.29 g de 8Hidroxiquinoleína y disolver en 25 ml del solvente escogido (generalmente alcohol) y
se agrega el agua destilada poco a poco, haciéndola deslizar muy lentamente por
una bagueta o vara de vidrio, evitando la precipitación de solución, hasta completar
1 l. Usar un frasco oscuro y guardar a medio ambiente. Tratamiento por un mínimo
de 3 horas, lo óptimo sería 5 horas a 15 ° C.
Colchicina, 0.05-0.5% W/V en agua destilada por 4-6 horas a 10-15° C en
refrigeración. Es una técnica popular desafortunadamente bastante cara y con
posibilidad de ser este producto carcinogénico. Para obtener raíces en mitosis se
puede usar bajas concentraciones de colchicina en semillas en estado de
germinación.
Paradiclorobenceno, alpha-bromonaftaleno, son otros de los químicos usados.
2.1.2 Conteo del número de cloroplastos en las células guarda
Aunque no es una técnica para determinar la exacta ploidía de un genotipo, cuancdo
manejamos una gran cantidad de material nos permite discriminar el grupo diploide de los
otros grupos. Por ejemplo cuando queremos seleccionar haploides (2n=2×=24).
1. Toma de la muestra
Colectar hojas o los folíolos terminales de una misma planta y colocarlos en una
placa Petri con papel toalla o filtro humedecido con agua.
2. Procedimiento
Obtener con la ayuda de una pinza fina el tejido epidérmico del envés de la hoja, de
la zona próxima a las nervaduras, e inmediatamente colocarlo sobre un portaobjetos donde previamente se ha colocado una a dos gotas de solución de KI - I y
luego volver a colocar muy suavemente encima de la muestra otras dos gotas de KI
- I y cubrir suavemente con un cubre-objeto.
3. Observación
Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 10 X, 20 X ó
40 X. El contaje de cloroplastos se realiza solo en una de las células guarda de los
estomas. El número promedio de cloroplastos nos dará una indicación de nivel de
ploidía, así para una ploidía 2x en papa, el promedio es de 5 - 8 cloroplastos por
célula guarda, contajes mayores a 9 nos indica un nivel más alto de ploidía. Es
aconsejable por lo menos obtener el promedio en 10 células guarda. Figs. 4 y 5.
6
Conteo del número de cloroplastos en las células guarda
Colecta de hojas,
foliolos
Muestra lista para su
cbservación
Obtención del tejido epidérmico
del envés usando una pinza fina
Fig. 4: Procedimiento para la obtención de muestras para el contaje de cloroplastos en
células guarda de estomas.
Promedio del N °
de cloroplastos
por célula guarda
Posible
ploidía
7-8
2X
9 - 11
3X
12 -14
4X
15 -16
5X
núcleo
Cloroplasto
Célula
guarda
Huamán, 1995
Contar los cloroplastos en 10 células guarda, de tamaño similar y
solo una célula por estoma
Genotipo Diploide
Posiblemente Genotipo
Tetraploide
Fig. 5: Criterios de evaluación para el contaje del número de cloroplastos.
c
Determinación de ploidía por Citometría de flujo
Fig. 6: Citómetro de Flujo (Ploidy Analyser) PARTEC I.
Fig. 7: Materiales requeridos.
d
Es recomendable utilizarlo en la selección de diploides y no para ploidías más altas.
Huaman (1995) asocia niveles de ploidía al número de cloroplastos por célula
guarda en determinaciones hechas en papas cultivadas.
Preparación de KI-I
1. 1 g de KI
2. 1 g de I
3. Ambos reactivos disolver en 100 ml de Etanol al 70%, guardar en frasco oscuro.
2.1.3 Determinación de ploidía por Citometría de flujo
La técnica de la citometría de flujo es, básicamente un método analítico que permite la
medida de emisión de fluorescencia y dispersión de luz de muestras marcadas (núcleos)
con sondas fluorescentes, que a medida que desfilan, de una en una y son arrastradas por
un flujo portador del analizador de ploidía (Partec PA-II Ploidy Analyser), que fluye del punto
de inyección al detector y finalmente a la botella de desecho, frente a un sistema de
detección (lámpara de mercurio que emite luz ultravioleta de 488 nm de longitud de onda).
La corriente de núcleos en suspensión pasa por una cámara de cuarzo (conducto de 10 µm
que no permite el paso simultáneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz
ultravioleta; produciéndose dos fenómenos simultáneos: Dispersión de luz y el fluorocromo
DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN en el núcleo,
emisión de luz fluorescente que es reconocida y captada por un fotorreceptor.
De esta forma, la citometría de flujo permite medir la cantidad de ADN existente en los
núcleos de las células, es un método rápido y directo de establecer la ploidía de una planta.
El citómetro de flujo debe ser previamente calibrado antes de iniciar el proceso de
evaluación de ploidía. Fig. 6.
Calibración del aparato
El sistema se calibra previamente situando el pico correspondiente a un contenido de ADN
igual a 2C (diploide) sobre el valor 100 de la escala de abscisas, o en su defecto sobre el
valor 50. El patrón se determina según el área relativa en porcentaje de los picos
correspondientes a las distintas poblaciones celulares (2C, 4C, 5C, etc.).
El GAIN, se utiliza para mejorar la ampliación y el alto voltaje del foto multiplicador, entre 0
y 1000 V, según el aumento o reducción del Gain la relación eje de abscisas (eje x) y
ploidía puede tener con valor = 50, 2C diploide, 75 igual a 3C (triploide) y 100 igual a 4C
(tetraploide), mientras si se aumenta dicho GAIN, este puede tener la siguiente relación:
100= 2C (diploide), 150=3C (triploide) y 200= 4C (tetraploide).
Es importante también el uso de controles de conocida ploidía en cada cultivo a evaluar.
Procedimiento
1. Materiales
Colectar folíolos jóvenes de la parte apical y colocarlos en placas Petri, y luego
tomar apróximadamente unos 40-50 mg. Fig. 7.
7
2. Preparación
La muestra a analizar se coloca en una placa Petri y se adiciona 0.5 ml del buffer de
extracción (CyStain UV Ploidy) y se cortan los folíolos con una hoja de afeitar,
seccionando muy finamente en pequeños cuadraditos. Una vez está disgregado el
tejido, se le adiciona nuevamente 1.5 ml del buffer de extracción y se incuba por 5
minutos a temperatura ambiente. Este buffer de extracción de núcleos, contiene el
fluorocromo DAPI (4, 6 –diamino-2-phenilindole), que tiñe el ADN.
Una vez resuspendida la mezcla se pasa a través de un filtro de nylon de 30 µm
(Partec 50 µm, Cell TricsTM), lo cual permite separar los núcleos, que caen a un tubo
receptor, el cual se coloca en el analizador. Figs. 8 y 9.
3. Observación
Los resultados de la muestra son cuantificados por el sistema electrónico, que se
encarga de la cuantificación de los destellos de la fluorescencia y de la luz
dispersada, bajo el control del ordenador, el cual almacena los datos de miles de
células por cada muestra, y representa los resultados gráficamente.
El sistema informático que lleva incorporado el citómetro convierte cada señal
fluorescente en un resultado que es presentado en un histograma en una escala
logarítmica. El gráfico resultante ordena los datos según el contenido nuclear de
ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el número de núcleos de cada tipo en el eje
de ordenadas. Figs. 9 y 10.
Todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN
medido, y este pico representa un nivel de ploidía.
El ruido consiste en una pequeña señal indeseada y aparece en los canales bajos.
Una razón para este ruido son los fragmentos resultantes de las células al momento
de su preparación.
La cuantificación del ADN nos permite conocer también la existencia de
aneuploidías, donde los histogramas se desplazan levemente hacia uno u otro lado
de la ploidía esperada.
Interpretación del histograma
El histograma resultante muestra el número de células por ml, que han sido contabilizadas
(eje y), mientras que en el eje horizontal (eje x) indica el contenido nuclear de ADN, así
todas las células que pertenecen a un solo pico tienen la misma cantidad de ADN y un pico
representa un nivel de ploidía. Fig. 11.
8
Colectar aprox. 50mg
hojas jóvenes apicales
Cortar solo los foliolos
Adicionar 1.5ml de CyStain
UV ploidy e incubar por 5
minutos
Colocarlos en 0.5 ml el
buffer de extracción
(Cystain UV ploidy)
Picar muy suavemente y
de arriba hacia abajo
Fig. 8: Procedimiento utilizado en la preparación de muestras para su análisis en el
Analizador de ploidía (Citómetro de Flujo).
Colocar la muestra en el
Clitómetro de Flujo
Filtrar la muestra en
filtros de 30µm
(Partec Cell Trics 30)
Citómetro de Flujo
Ploidy Analyzer (PA) Partec I
Fig. 9: Filtración de la muestra y su colocación en el Citómetro de flujo para su lectura.
e
K.Soto
Se establece los parámetros para
la lectura de la muestra
Histograma de la muestra
Fig. 10: Medición, procesamiento de los datos y representación de los resultados.
2x
4x
< 4X
Fig. 11: Histogramas con los resultados para plodías 2×, 4× y <4×, encontradas en GON,
ADG y en un híbrido somático respectivamente.
f
Capítulo 3. Meiosis
Este término se deriva del griego meioum (reducir). Cada organismo tiene un número de
cromosomas característico de su especie.
Este proceso ocurre antes de la formación de las células reproductivas o esporas, en el
cual el número diploide normal se reduce a un juego único o haploide (n) en cada gameto,
el número haploide se designa como n y el número diploide como 2n. La meiosis es
también precedida por una fase S, durante la cual ocurre la síntesis de ADN (algo de
síntesis de ADN ocurre durante la primera profase de la meiosis). Antes de iniciarse la
meiosis el material genético en el núcleo diploide ha sido replicado sólo una vez, cada
cromosoma consiste de dos cromátidas hermanas idénticas.
Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, ellas son distinguidas como meiosis I y
meiosis II.
La comprensión del proceso de la meiosis es fundamental para interpretar el proceso y
función de la recombinación genética en la evolución cromosómica.
Todo este proceso es dinámico, abarca atracción, apareamiento, intercambio y ulterior
separación de los cromosomas homólogos paternos y maternos.
Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos.
En toda célula diploide, cada cromosoma proviene del gameto de uno de los progenitores y
su pareja, del gameto del otro progenitor, estos pares de cromosomas se conocen como
pares homólogos, los que se asemejan en tamaño, forma y en el tipo de información
hereditaria que contienen.
Además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación,
es una fuente de nuevas combinaciones de material genético dentro de los mismos
cromosomas.
Cada división meiótica es formalmente dividida en profase, metafase, anafase y telofase.
De esos el más complejo y largo es la profase I la cual está subdividida en: leptoteno,
zygoteno, paquiteno y diacinesis.
3.1 Meiosis I
3.1.1 Profase I
La cromatina se condensa y los cromosomas se hacen visibles con el microscopio óptico.
Durante este proceso cada gameto lleva sólo un miembro de cada par de homólogos.
•
•
Leptoteno: Los cromosomas aparecen como largos filamentos, y repartidos a lo
largo se pueden observar los cromómeros como las cuentas de un rosario. No se
pueden individualizar los cromosomas y la membrana nuclear está presente.
Zygoteno: Comienza el apareamiento de los cromosomas homólogos, a este
proceso se le llama sinapsis, aquí se hace evidente la pareja de cromosomas
homólogos, atraídos uno con otro. El apareamiento es muy preciso, punto por punto
9
•
•
•
a manera de un cierre de cremallera. Cada homólogo consta de dos cromátidas
hermanas y el par de homólogos consta de cuatro cromátidas (tétrada) y a los pares
asociados se les llama bivalentes. Es el complejo sinaptonémico de naturaleza
proteica el que mantiene los cromosomas homólogos estrechamente unidos
formando un bivalente, se cree que su existencia es necesaria para que se produzca
el entrecruzamiento, la formación de quiasmas (del griego, Chiasma: punto de
cruzamiento) y el evento de recombinación.
Paquiteno: Este estado evidencia la unión longitudinal de los homólogos y
desdoblados cada uno en dos cromátidas. Las cromátidas de cada homólogo se
llaman cromátidas hermanas. Dos cromátidas homólogas se rompen al mismo nivel
y de inmediato se intercambian en este punto ambos segmentos, las otras dos
quedan intactas. Esto es lo que se conoce como entrecruzamiento, la evidencia
citológica visible son las llamados quiasmas. Una serie de intercambios de material
genético ocurre entre cromátidas no hermanas u homologas.
Diploteno: Los cromosomas homólogos comienzan a repelerse entre sí, excepto en
los puntos de intercambio o quiasmas. El nucléolo y la membrana nuclear
desaparecen y el “crossing-over” se hace visible. La consecuencia es la formación
de nuevas combinaciones de genes, con alteración de la información genética
localizada en los cromosomas afectados.
Diacinesis: Las bivalentes se hallan más condensadas. Paulatinamente el proceso
de terminación continua a medida que el número de quiasmas disminuye y empieza
a aparecer el huso acromático, los bivalentes quedan unidos por sus centrómeros al
huso, y la membrana nuclear desaparece y comienza a formarse el “spindle”.
3.1.2 Metafase I
Los bivalentes se sitúan a cada lado del plano ecuatorial. El huso (spindle) se ha formado
completamente y cada homólogo tiene su centrómero. Por ello el cromosoma completo se
dirige a uno de los polos. Los cromosomas aparecen más condensados.
3.1.3 Anafase I
Los cromosomas homólogos se han separado y migran hacia los polos respectivos u
opuestos de la célula por acción de los microtúbulos del huso acromático, sin embargo
debido a los entrecruzamientos ocurridos, las cromátidas no son idénticas como lo fueron al
comienzo de la meiosis. Nuevas combinaciones han surgido en cromátidas no hermanas,
en tanto que las otras dos quedan intactas. Los centrómeros no se dividen, las cromátidas
hermanas continúan unidas, pero los homólogos se separan. Como resultado para
cualquiera de los pares homólogos, un polo recibe un cromosoma de origen paterno y el
polo contrario un cromosoma de origen materno. Y no todos los cromosomas paternos se
dirigen hacia el mismo polo. De hecho cualquier combinación de cromosomas maternos y
paternos puede desplazarse hacia un polo determinado.
3.1.4 Telofase I
Los cromosomas propenden a alargarse, algunas veces el nucléolo y la membrana nuclear
reaparece. Las células formadas contienen la mitad del número de cromosomas presentes
en la célula madre. Set haploide de cromosomas. Los cromosomas se encuentran
reagrupados en cada polo.
10
Ha concluido la fase reduccional en la cual el par de cromosomas homólogos son
separados en dos células hijas.
3.2 Meiosis II
Se parece a la mitosis, excepto en que no está precedida por la duplicación del material
cromosómico
3.2.1 Profase II
Cada célula es haploide, la membrana nuclear empieza a desintegrarse y el nucléolo
desaparece al final de la profase II, ésta es corta y le sigue una reorganización del huso
acromático.
3.2.2 Metafase II
En esta etapa los cromosomas que han quedado en los polos se colocan en el plano
ecuatorial y se adhieren a las fibras del huso.
3.2.3 Anafase II
En esta fase los centrómeros se dividen y las cromátidas hermanas, que ahora son
cromosomas, se separan y se van hacia los polos opuestos.
3.2.4 Telofase II
En esta fase se forma una tétrada de microsporas, se han formado nuevas paredes
celulares, cada núcleo lleva un número haploide de cromosomas, cada cromosoma está
representado una vez, Y cada núcleo de un segmento puede recibir cualquier combinación
factible de cromátidas de origen materno y paterno.
La división meiótica tiene tres importantes eventos
1. Transformación de los cromosomas por la ocurrencia del entrecruzamiento
(crossing-over) en combinaciones completamente nuevas.
2. Re-arreglo del genoma por una distribución al azar de los cromosomas homólogos.
3. Reducción del número de cromosomas de diploide (2n) a haploide (n).
De estos eventos, el más decisivo es la recombinación, siendo probablemente la más
importante contribución a la evolución y a la diversidad genética.
11
3.3 Observación de meiosis en células sexuales de papa
El proceso de microsporogénesis generalmente termina entre los 7 y 14 días anteriores a la
floración, muestras apropiadas de botones florales dependen de varios factores: como el
medio ambiente, la hora y los factores genéticos. Figs. 12, 13, 14 y 15.
Procedimiento
1. Fijación
Usar Carnoy modificado fresco (3:1 alcohol absoluto: solución saturada de acetato
férrico en ácido propiónico), el cual es dispensado en frascos con tapa rosca,
sumergir la muestra de botones de diferentes estados de desarrollo, previamente
haciendo un corte con un bisturí en la punta de los botones para permitir que el
fijador penetre. Aquí deben permanecer de 24 a 48 horas a temperatura ambiental.
Para largos periodos de almacenamiento en refrigeración, se recomienda guardar
las muestras en etanol al 70 % a 4° C.
2. Preparación
Tomar varios tamaños de botones en una placa Petri o en un vidrio de reloj con 70
% de etanol y chequear cada botón si está en estado óptimo para la observación de
meiosis.
Diseccionar la antera, sobre una lámina porta objeto, cortando los extremos aplastar
presionándola con una aguja de disección para luego remover los restos de la
antera y colocando rápidamente una gota de carmín propiónico o de lacto propiónico
orceína, cubrir con un cubre objeto.
Las agujas, pinzas de disección deben limpiarse frecuentemente para evitar su
corrosión.
3. Observación
Examinar la preparación bajo el microscopio óptico, a un aumento de 40 X o 100 X,
si estuviera en un estadío óptimo, calentar levemente la muestra pasando por la
llama de un mechero y retirar el exceso de tinte colocando la lámina entre 2 papeles
de filtro. Se puede golpear suavemente el cubre objeto para expandir los
cromosomas.
Preparación de la solución saturada de acetato férrico: Se añaden 10 g de acetato
férrico a 100 ml de ácido propiónico puro, mezclar bien, dejar sedimentar y decantar
cuidadosamente la solución, evitando que parte del precipitado pase a la solución a usarse.
Preparación de carmín propiónico: Preparar una solución al 45% de ácido propiónico,
calentar hasta que hierva, luego añadir 1 g de carmín, dejar hervir y filtrar.
A esta solución agregar 5 gotas de solución saturada de acetato férrico en
45% de ácido propiónico.
12
Observación de meiosis en células sexuales
Botones florales recolectados
en Fijador Carnoy Modificado
Anteras en alcohol de 70%
colocadas en placa Petri listas
para su disección
Antera diseccionada
Fig. 12: Fijación y preparación de muestras de botones florales.
Microsporogénesis
Células madre del
polen
Células madre del
polen
Células
nutritivas
Arquesporio
Células del Tapetum
Meiosis
Polen
Fig. 13: Microsporogénesis -Tejido esporágeno - Formación del polen.
g
Profase I
Paquiteno
Diacinesis
AI
MI
Metafase I
Anafase I
Fig. 14: Meiosis I, mostrando Paquiteno - Diacinesis (Profase I), Metafase I y Anafase I.
Telofase I
M II
Metafase II, ejes de
los spindles (flecha)
son paralelos
AII
Anafase II, ps y
telofase temprana II
(flecha)
TI
Telofase I,
Anafase II
Anafase II, husos
normales y
paralelos
AII
Fig. 15: Meiosis I, Telofase I y Meiosis II, Metafase II, Anafase II, Telofase II, husos
normales y paralelos.
h
3.4. Gametos 2n
Gametos con el número somático de cromosomas (gametos 2n) son el resultado de
mecanismos que afectan formación normal de los gametos, durante la fase premeiotica,
meiótica y post meiótica. La incidencia de gametos 2n es frecuente en el reino vegetal, y su
ocurrencia ha sido reportada en muchas especies de familias, incluyendo Crucíferae,
Leguminosae, Rosaceae, Solanaceae y Vitaceae (Veilleaux, 1985).
Los gametos no reducidos son de gran utilidad, ya que facilitan la poliploidización sexual y a
la vez proporcionan un método muy efectivo para transmitir la heterocigosidad y la epistasis
del nivel 2X al 4X.
Pueden ser detectados: Por la ocurrencia de progenie tetraploide en cruzamientos 2x × 4x,
4x × 2x; distribución bimodal del diámetro del polen: grande (2n) & normal (n). La presencia
de tétradas, diadas y/o triadas en el estadío de formación de microsporas. Fig. 16.
La poliploidía es una característica distintiva del reino vegetal y ha tenido un papel muy
importante en la evolución de las plantas superiores especialmente la Angiospermas,
incluyendo las especies cultivadas de mayor importancia mundial tales como el trigo, papa,
avena, caña de azúcar y algodón que son poliploides. Camadro (1986).
Los poliploides pueden originarse por duplicación espontánea del complemento
cromosómico somático (poliploidización asexual) o por el funcionamiento de gametos 2n
(poliploidización sexual).
n
2n
Formación de
tétradas y
diadas
Formación de
polen normal y
polen 2n
Formación de triadas
(orientación tripolar)
y tétradas
Fig.16: Formación de díadas por husos paralelos-polen 2n y formación de triadas en
Telofase II, los husos adoptan una configuración tripolar.
13
Capítulo 4. Observación de polen y determinación de su
fertilidad
El término viabilidad o fértil se refiere a la capacidad de los granos de polen de germinar en
el estigma, este conocimiento es uno de los más importantes aspectos para una eficiente
reproducción sexual. Granos de polen funcional (viables o fértiles) se observan claramente
redondos con el citoplasma teñido uniformemente de rojo, con morfología normal, son
considerados potencialmente funcionales, mientras los granos abortivos, no viables o
estériles, no se tiñen, o son poco coloreados, con el citoplasma granular y permanecen
encogidos, con citoplasma retraído (eclipse de esterilidad), deformes. Figs. 17, 18, 19, 20 y
21.
1. Colectar las flores próximas a la dehiscencia.
2. Colocar una o dos gotas de colorante gelatina aceto-carmín glicerol, en el centro de
un porta-objeto, y sobre ella colocar una pequeña cantidad de polen que puede ser
obtenido de una o más anteras con la ayuda de un vibrador o dando golpecitos a las
anteras con una aguja de disección para hacer caer directamente el polen sobre la
lámina porta-objeto. Si el polen ha sido colectado en cápsulas de gelatina, una
cantidad suficiente es colocada de la misma manera con la punta de una aguja o
con mondadientes.
3. Mover ligeramente con una aguja de disección o con el mismo mondadientes para
asegurar una distribución uniforme y luego cubrir con un cubre-objeto, dejar por lo
menos 24 horas para que los granos de polen se tiñan. Colocar las muestran en una
mesa o tablero, evitando colocarlas verticalmente hasta después de unos días en
que hayan sellado y luego colocar en cajas porta-objetos para guardarlas en
refrigeración a 4° C.
Otro test de viabilidad es el X-Gal test, donde el polen es incubado por 30 minutos en la
oscuridad a 37° C en un medio (Singh et al., 1985) de 1 mg X-Gal (5-bromo-4-cloro-3indoyle-β-galactoside) disuelto en 50 μl de N, N dimethyl formamide y 1 ml del buffer
acetato (50 mmol, pH 4.8). Este test es recomendado por Trognitz, 1991 por su alta
reproducibilidad. El grano de polen es considerado viable si se torna azul y si se muestra
con un citoplasma teñido uniformemente. Figs. 22 y 23.
Preparación de gelatina aceto-carmín glicerol
Preparar una solución de 45% de ácido acético con agua destilada y calentar hasta llegar a
ebullición, luego agregar 2 g de carmín hasta que el carmín esté completamente disuelto y
quede aproximadamente 60 ml. Dejar enfriar y filtrar, finalmente agregar igual volumen de
glicerina. Todo el proceso se realiza bajo campana extractora y constante agitación. (Marks,
1954).
4.1 Cultivo de polen in vitro
La observación del desarrollo del tubo polínico al cultivar el polen en un medio adecuado,
nos permite distinguir el polen no viable de las incompatibilidades que pueden ocurrir a nivel
del estilo. Varios investigadores han reportado el uso de medios de cultivo para la
germinación y crecimiento del tubo polínico. Mortenson y col (1964) reportaron que una
solución de 20 % de sucrosa + 50 ppm de ácido bórico fue el medio más adecuado para la
14
Observación de polen y determinación de su fertilidad
Polen colectado en
cápsula de gelatina
Colección de polen
La muestra es colocada en 2 - 3
gotas de colorante
Materiales
Fig. 17: Procedimiento para la toma de muestra, coloración del polen.
Fig. 18: Muestras fijadas de polen para su observación.
i
COLORANTE: Gelatina Aceto-carmín Glicerol
COLORACIÓN + polen bien formado= VIABILIDAD
Polen normal (n) + polen
estéril no coloreado
Polen estéril (n) coloreado y no coloreado
Polen doble,
coloreado y no
coloreado
Fig. 19: Diferentes calidades de polen, normal (n), estéril, polen 2n, polen doble.
Eclipse de
esterilidad
Polen
anómalo
Tétradas estériles
Fig. 20: Polen anómalo: Con eclipse de esterilidad, malformado y tétradas estériles.
j
Polen n y 2n coloreados
Polen n y 2n estériles
Fig. 21: Polen (n), polen 2n coloreados (viables) y estériles.
A
B
C
D
Fig. 22: A. Polen normal (n), B. Polen n y 2n, C. Polen normal y estéril, D. Polen estéril.
Coloración X-Gal.
k
A
B
C
D
Fig. 23: A. Polen con 3 poros germinativos, B. Polen doble, C. Polen con 2 poros
germinativos, D. Polen estéril. Coloración X-Gal.
l
Cultivo de polen in vitro
Materiales y medio de sucrosa al
20% + ácido bórico 200 ppm +
Tween 20 (0.2%)
Polen ya sembrado bajo
cámara húmeda
Siembra del polen en el
medio de cultivo
Fig. 24: Procedimiento para el cultivo de polen in vitro en medio de sucrosa, ácido bórico y
Tween 20 bajo condiciones de cámara húmeda.
A
B
C
D
Fig. 25: A y B. Polen germinado y con buen crecimiento en el medio de cultivo. C. Polen
con mediana germinación D. Polen con escasa germinación.
m
A
B
C
D
Fig. 26: A. Polen no germinado, B. Sólo uno de los granos del polen doble germinando,
C. Escaso polen germinado, D. Polen soltando su contenido.
n
germinación in vitro de polen de Solanum, mientras que Bamberg y Hanneman (1991)
encuentran que el medio de 20% de lactosa + 50 ppm de ácido bórico fue superior al medio
con sucrosa, así Trognitz (1991) encuentra una respuesta altamente variable para este
mismo medio. Gonzáles y col (2002) usando un medio compuesto por sacarosa 12%,
Nitrato de Calcio (CaNO3) 300 ppm, Sulfato de Magnesio (MgSO4) 200 ppm, Nitrato de
Potasio (KNO3) 100ppm, Acido Bórico (H3BO4) 100 ppm en solución acuosa pH=6, refieren
que les reportó resultados confiables.
4.1.1 Preparación del medio
1. Reactivos
Sucrosa (sacarosa), concentración en la solución al 20%
Acido Bórico (H3BO4) 100 ppm (Solución madre 200 mg en 100 ml)
Tween 20, 0.2 %
2. Preparación del Medio de cultivo
Se prepara con 5 ml de la solución madre de ácido bórico a 200 ppm y se agrega 20
g de sucrosa y Tween 20, 0.2% en un cilindro graduado (Vaso de 100 cc) y se
completa el volumen a 100 cc, agitar bien.
3. Procedimiento para la Germinación
Colocar 4 gotas (aproximadamente 15 μl de medio/gota), en una placa Petri con la
ayuda de una aguja, o con palillo de dientes colocar pequeñísimas cantidades de
polen sobre cada gota, la tapa de la placa Petri a la cual se ha colocado un papel
filtro humedecido va a contribuir a formar una pequeña cámara húmeda. Las placas
Petri se colocan a 20-24 ° C. Después de 24 horas se coloca una gota de lugol, o de
colorantes como orceína acética, carmin propiónico, lacto propiónico orceina y se
cubre con un cubre-objeto de 22 x 40 mm y se procede a la observación bajo el
microscópio óptico. Se cuenta como granos germinados aquellos que por lo menos
el tubo del polen ha crecido de igual tamaño o mayor al diámetro del grano de polen.
Para registrar los datos se cuentan en unos 10 sitios el número de granos de polen
que muestran el tubo de germinación. Figs. 24, 25 y 26.
Polinización y fertilización
Cuando las anteras se tornan dehiscentes, los granos de polen son transferidos al
estigma(s) por los insectos o la mano del hombre. Una vez en contacto con el estigma, los
granos de polen germinan formando el tubo polínico. En cada una de las microsporas
haploides formadas durante la meiosis, el núcleo se divide por mitosis y desarrolla un grano
de polen bicelular (gametofito masculino inmaduro). Una de las células se divide
posteriormente otra vez habitualmente después del desarrollo del tubo polínico, dando
como resultado tres células haploides por grano de polen: dos gametos masculinos
masculinos (núcleo germinativo y núcleo espermático).y la célula generadora del tubo
polínico. El tubo continúa creciendo y entra al óvulo a través del micrópilo. Los dos gametos
son entonces liberados dentro de la sinérgida. El saco embrionario contiene 8 núcleos y
cada uno con una dotación haploide de cromosomas. Los dos núcleos cerca al centro del
saco embrionario son referidos como núcleos polares; la célula huevo u oosfera está
situada cerca al micrópilo.
Finalmente un núcleo espermático entra en la célula huevo y el otro se une a los dos
núcleos polares, este acontecimiento es llamado doble fertilización, entonces se forma un
cigoto diploide, que luego desarrolla en embrión y la unión del otro núcleo espermático con
15
dos núcleos polares, llamado fusión triple resulta en la formación del tejido nutritivo llamado
endospermo (3n). Se conoce a este proceso como doble fertilización, este es un proceso
complejo, el embrión pasa por sus primeras etapas de desarrollo mientras se encuentra
dentro del ovario de la flor, los integumentos se desarrollan en la cubierta de la semilla y el
ovario mismo madura y se transforma en fruto.
Las polinizaciones o fertilizaciones, deben realizarse usualmente en la mañana antes de las
10 a m, si los días son calurosos es posible hacerlos al final de la tarde. El probable éxito
del cruzamiento es apreciado por un pedicelo sostenido y ligeramente curvado, unos 2-4
días después de la polinización con un posterior desarrollo de frutos (bayas), los cuales
serán cosechados cerca de 30-45 días dependiendo de las especies. Normalmente los
frutos son protegidos durante su desarrollo con una malla de fina gasa. Después de la
cosecha, (25-40 días), se colocarán en bolsas de papel hasta su maduración a temperatura
ambiente, esperando hasta que se tornen suaves lo cual permite que el proceso de
extracción sea más fácil, la extracción que se hace en un recipiente con agua donde son
separadas las semillas de las otras partes del fruto. Las semillas viables tienden a irse
hacia el fondo, mientras las semillas llamadas vanas flotan. Las semillas obtenidas así
deberán ser secadas, colocadas en papel de platina especial y selladas para guardar en
cámara de refrigeración a 4 ° C. Fig. 27.
Polinización y fertilización
Colecta de polen
Emasculación de las anteras
Identificación del
Polinización
cruzamiento
Guardar el polen en
cápsulas de gelatina
Fig. 27: Procedimiento para efectuar las polinizaciones en un bloque de cruzamientos.
16
4.2 Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo)
Un método útil para monitorear la fertilidad del polen es teñirlo y visualizarlo para observar
como crecen a lo largo del pistilo. Durante la polinización, el grano de polen hace contacto
con las células receptivas del pistilo lo que favorece el crecimiento del polen de algunos
genotipos, mientras que se opone o rechaza otros. Esta interacción polen–pistilo establece
límites de endogamia o de exogamia.
El análisis del crecimiento del tubo polínico nos permite hallar las diferencias existentes en
cruzamientos compatibles, parcialmente o completamente incompatibles.
Dos tipos de incompatibilidad pueden ser distinguidos en Solanum, auto-incompatibilidad o
incompatibilidad interespecífica.
Para monitorear el crecimiento del tubo polínico in situ:
1. Fijación
Sumergir los carpelos (pistilos) en la solución de Schreiter (Schreiter and Tiemann,
1977), los que serán colectados 48 horas después de realizada la polinización, 2-6
pistilos por muestra, los que serán retirados intactos de las flores, cortados desde la
base con un escapelo. Se debe guardar las muestran en refrigeración a 4° C hasta
una semana antes de la preparación. La solución es re-usable cerca de 10 ciclos. Si
se torna turbia o grumosa debe nuevamente filtrarse. La solución debe manejarse
con mucho cuidado y con guantes ya que el azul de anilina es cancerígeno.
2. Preparación
Hervir las muestras fijadas en un baño de maría, hasta que el tejido se aclare y
suavice suficientemente, pero no más que 30 minutos. El tiempo de preparación
dependerá de la consistencia del tejido, variando entre genotipos. El tejido en esta
etapa se torna extremadamente frágil, hay que tener mucho cuidado en su
manipulación.
3. Montaje
Los pistilos serán extendidos y montados en láminas porta-objetos, en una gota de
solución acuosa de 50% de glicerol/agua, cubiertos con un cubre-objeto y aplastados
suavemente. Los pistilos preparados de esta manera donde los tubos polínicos que
contienen callosa pueden ser coloreados por azul de anilina y detectados con luz UV
(Dionne y Spicer, 1958).
Preparación de la solución
Para una cantidad total de 1.2 litros de solución:
•
•
•
•
100 ml (1 parte) (w/v) de la solución acuosa de azul de anilina (2%), hervir y filtrar.
700 ml (7 partes) solución acuosa de 0.2 N K3PO4 * 3 H20 (49.53 g completar a 700
ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) 1.0 N Na OH (8.0 g completar a 200 ml con agua destilada)
200 ml (2 partes) (v/v) 10% solución acuosa de Tween 20 (180 ml de agua destilada
+ 20 ml de Tween 20).
Al azul de anilina preparada, se agrega las demás soluciones y luego se procede a guardar
en frasco oscuro en refrigeración a 4° C, la solución toma un color amarillo claro.
17
La evaluación del crecimiento del tubo del polínico se realizará en microscopio de
fluorescencia, en una magnificación x 100 con una lámpara HBO 200 UV- como fuente de
luz, BG 12 filtro de excitación y UG 1 filtro de barrera y un filtro de protección Y-455.
Se coloca el carpelo cocinado en una lámina porta-objeto con una gota del glicerol/ agua al
50%. La concentración demasiado alta del glicerol afecta el material. Pero es posible
sustituir el agua en la solución del montaje posteriormente agregando el glicerol puro. De
esta manera, las preparaciones son durables si se mantienen en la oscuridad. El tiempo de
la preparación depende de la consistencia del tejido y varía entre los genotipos.
El crecimiento del tubo polínico será evaluado usando una escala o matriz combinada de 18
niveles cualitativos (nivel al que llegan los tubos polínicos) y cuantitativa (cantidad de tubos
polínicos, Trognitz, 1991). Figs. 28 y 29.
18
Crecimiento del tubo polínico in vivo (en el pistilo)
Cantidad (número total de tubos polínicos en
el estilo-ovario)
Niveles*
> 30
10-30
<10
Valor combinado del nivel y cantidad
de polen
16
17
18
13
14
15
10
11
12
Estilo (final)
7
8
9
Placenta
4
5
6
1
2
3
No germinado
Estigma
Estilo-estigma
Estilo
Fig. 28: Matriz de valores combinados para evaluación cualitativa (nivel de crecimiento al
cual llegan los tubos polínicos en el pistilo) y cuantitativa (número de tubos polínicos
llegando a los diferentes niveles a lo largo del pistilo).
* Niveles de longitud del tubo del polen llegan: 6 - Polen no germinado; 5 - estigma; 4 - estilo
- estigma; 3 - estilo; 2 - final del estilo; 1 - placenta. (Trognitz,1991).
Fig. 29: Diferentes vistas del crecimiento del tubo polínico en el pistilo y ovario después de
ser coloreado con el colorante fluorescente azul de anilina que reacciona con la callosa.
o
Capítulo 5. Cultivo in vitro de embriones inmaduros
La utilización de las técnicas de rescate de embriones ha sido muy importante para la
obtención de híbridos ínter específicos e ínter genéricos.
La reproducción de plantas se realiza mediante hibridación y selección. El cruzamiento de
plantas permite al mejorador recombinar características deseables en nuevos genotipos y a
través de la selección obtener mejores productos. Este proceso depende totalmente de la
producción de descendencia; en otras palabras, de la formación de semillas viables.
El cultivo in vitro de embriones permite que embriones que se pierden o no progresan
normalmente debido a su condición de inmaduros, lleguen a progresar y desarrollar una
plantula si son colocados en un medio adecuado superando con éxito la falta de viabilidad
de las semillas procedentes de cruzamientos especialmente difíciles, además de reducir el
tiempo que dura el mejoramiento en muchas plantas (Brown & Torpe, 1995; RodriguesOtubo et al, 2000).
El éxito del cultivo in vitro de embriones inmaduros está influenciado por la composición
química del medio de crecimiento, el cual debe ser capaz de inducir el desarrollo exitoso de
embriones híbridos, también debe establecerse de acuerdo a los principales requerimientos
nutricionales de la especie (Pellegrineschi et al., 1997).
Procedimiento
Después de realizados los cruzamientos las bayas se colectan dentro del lapso de 19-27
D.D.P, se efectúa una desinfección previa usando una solución que contiene los acaricidas
Azociclotin (Peropal 50 SC): Imidacloprid (Confidor 35 SC) al 1 ‰, adicionándole 6 gotas de
Tween 20, colocando las bayas en esta solución por aproximadamente 10 minutos, seguido
de una desinfección con alcohol 70% por 30 segundos, y finalmente se lavan 2 veces con
agua destilada, proceso que se realiza en un área destinada para este propósito; por último
se esteriliza superficialmente con una solución de Hipoclorito de Calcio al 2.5% por 10
minutos y finalmente se enjuaga con agua destilada estéril, proceso que se realiza en la
cámara de flujo laminar. En este punto las bayas están listas para ser cortadas.
Siembra de embriones inmaduros
Medio modificado de Singsit y Hanneman (1991).
Todo éste proceso se realiza dentro de la cámara de flujo laminar en las mayores
condiciones de asepsia. Se cortan las bayas para obtener las semillas inmaduras, éstas se
abren a lo largo de su eje longitudinal, usando un escalpelo y una hoja para escalpelo No
11, todo este proceso se realiza con la ayuda de un estereoscópico. Los embriones son
separados cuidadosamente de la cubierta de la semilla y sembrados directamente en las
placas Petri de 60 x 15 mm. conteniendo el medio de cultivo, que consiste de 4.6 g/L del
medio basal Murashige y Skoog (Sigma), fortificado con 4 % de sucrosa, 100 mg/L de mioinositol, 0.001 mg/L de adenina, 2.0 mg/L de glicina, 1 g/L de caseína hidrolizada, 0.1mg/L
tiamina-HCl, 1mg/L de ácido nicotínico, 0.5 mg/L de piridoxina-HCl, 100 mg/L de ácido
málico; 0.7 % de agar, adicionado con 1g/L de carbón activado. El pH del medio se ajusta a
pH 5.6 antes de autoclavarlo a 120 º C por 20 minutos y se agrega 0.1 mg/L IAA (ácido 3indol-acético) y se agrega 0.001 mg/L de kinetina al medio de cultivo por filtración antes de
19
dispensarlo a las placas Petri. Finalmente las placas Petri se colocaran en la cámara de
crecimiento en un rango de temperatura de 18 a 22 º C, 16 horas de fotoperíodo y 3000 lux
de intensidad lumínica hasta su germinación.
Una vez ha desarrollada la plantita se procede al transplante a tubos con el medio de
propagación MSA que consiste de 4.6 g/L del medio basal Murashige y Skoog (Sigma),
fortificado con 25 g/L de sucrosa, 2.9 g/L de Phytagel y 5 mL del Stock de Vitaminas (0.025
g de GA3 (ácido giberélico), 0.5 g de glicina y 0.125 g de ácido nicotínico) y a pH 5.6. Fig.
30.
Cultivo in vitro de embriones inmaduros
Torpedo
Apertura de bayas
Polinización
Bayas listas para ser
cosechadas
in vitro
(19-27 DDP)
Globular Corazón
Descarte de
embriones con
marcador
Pro-embriones
creciendo en medio
de
Plantas de in vitro
creciendo en invernadero
Propagación
in vitro
Rescate de pro
embriones en
diferentes estadíos
cultivo in vitro
Híbrido
rescatado
Fig. 30: Procedimiento para el cultivo in vitro de embriones inmaduros.
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