BACTERIOFAGOS

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BACTERIOFAGOS
50 x 106 bacteriófagos /ml de agua de mar y
cantidad equivalente en suelos
Se estiman 1031 bacteriófagos en la Tierra
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Bacteriófagos con Genoma de DNA dc
• LÍTICOS : T1 ÆT7
– Se multiplican en Bacterias y matan la célula por lisis al final de su
ciclo de vida
• Virión complejo: cabeza icosaédrica, cola y fibras
• DNA dc linear : 40.000 – 170.000 pb
• LISOGÉNICOS (Atemperados)
– Alternativamente pueden multiplicarse vía ciclo lítico o entrar en
un estado quiescente en la célula donde la mayor parte de los
genes no se expresan (lisogénicos)
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Fagos Líticos
Fago T7
• Virión
– cabeza icosaédrica, cola corta
– DNAdc linear 40.000pb
– Genoma 97% codificante
• Expresión génica
– Genes inmediatos tempranos (RNA polimerasa del huésped):
» Proteína inhibitoria del sistema de restricción de la célula huésped
» RNA polimerasa T7
» Inhibición de RNA polimerasa de la célula huésped
– Genes tempranos y tardíos (T7 RNA polimerasa)
» Replicación del genoma (T7 DNA polimerasa)
» Proteínas estructurales y ensamblado
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Fagos Líticos
• Replicación del Fago T7
– Origen de replicación único
– formación de concatémeros
– monómeros Æ endonucleasa específica
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Uso de algunas características del
fago T7 en Biología Molecular
¾ DNA polimerasa T7 Æ Enzima Sequenase (secuenciación de DNA)
¾RNA polimerasa T7 + promotor específicoÆ Vectores de expresión procariota
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Fagos Líticos
FagoT4
Virión Complejo (43 proteínas)
-Cabeza icosaédrica
-vaina
-cuello
-placa basal
-fibras de la cola
-DNAdc linear 170.000pb
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Fagos Líticos
ENTRADA Fago T4
-Adhesión a lipopolisacáridos de superficie
-Inyección del material genético
Infección viral Æ Degradación
masiva del DNA de la célula huesped
(nucleasas)
Protección del DNA viral: base
modificada
5 hidroximetilcitosina , con grupos
hidroxilo glicosilados (DNA resistente a
endonucleasas)
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Fagos Líticos
Infección del fago T4
Expresión génica en 3 fases (RNA pol de célula huésped + proteínas virales)
1er fase Æ RNA pol celular
2nda fase Æ RNA pol celular + proteínas virales
3ra fase Æ RNA pol celular + nuevo factor sigma
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Bacteriófagos con Genoma a RNAsc (+)
•
•
•
•
Icosaédricos
Pequeños 26nm
Infectan células F+ (pili)
Regulación de la expresión por estructura secundaria del RNA
– MS2 (E.coli)Æ Genoma de RNA + : 3500nt
5`
lisis
Prot de maduración cubierta
replicasa
3`
RNA genómico cad+ (RNAm)
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Mapa genético y
proceso de
multiplicación del
virus MS2
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Bacteriófagos Icosaédricos con Genoma a DNA sc
• Fago ϕX174
•
•
•
•
DNA sc circular
5300 nt
1er DNA secuenciado totalmente
25nm Icosaédrico
DNAsc
Enz.celulares
genoma
DNAsc
RF
DNAdc
Replicación
(circulo rodante)
transcripción
traducción
Proteínas
virales
ensamblado
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Fagos Líticos
Terapia con Bacteriófagos
Uso de Bacteriófagos en reemplazo o junto con antibióticos
– Ventajas
• Multiplicación dependiente de la presencia de bacteria blanco
• No tóxicos
• Específicos (rango estrecho de huésped) Æ no causan daño a la
flora normal
• Selección de fagos con receptor involucrado en virulencia
– Desventajas
• EspecíficosÆ hay que conocer previamente el agente infectivo
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Fagos Lisogénicos
•FAGOS LISOGÉNICOS (Atemperados)
– Fago Lambda o lamboides
» Inserción del genoma en sitios específicos del cromosoma del
huésped
– Fago Mu
» Inserción del genoma en cualquier cromosoma del huésped
» Transposición
– Fago P1
» Profago no integrado
» Mantenimiento como plásmido
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Fagos Lisogénicos
Fago lambda
•Cabeza icosaédrica
•Cola
•1 única fibra
•Genoma de ADNdc de 48.000pb
•Extremos del genoma sc complementarios (extremos cos)Æ Circularización del genoma al
ingresar a la célula y señales de empaquetamiento
•Adsorción por unión a receptor: transportador maltosa
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Fagos Lisogénicos
Fago Lambda
Eventos que llevan a la Lisogenia:
-Circularización del genoma
-Recombinación sitio específica (sitios att)
-Represión de la expresión del genoma del fago
Æ Expresión de Proteína represora
Fin Lisogenia (Inducción del
profago):
-Destrucción de Proteína represora
(Señal: condiciones adversas de crecimiento
de las bacterias)
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Fagos Lisogénicos
Establecimiento de la Lisogenia o Ciclo Lítico
Genes inmediatos tempranos = N y Cro
Genes tempranos N, Cro, CII, CIII, CI
Genes tardíos: Replicación, proteínas
estructurales y lisis
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Fagos Lisogénicos
Usos en Biología Molecular del fago Lambda
•
Bibliotecas Genómicas
•
Bibliotecas de Expresión
•
Cósmidos
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Cósmidos
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Fagos Lisogénicos
Genotipo y Fenotipo de Bacterias Lisogénicas
¾ Diversificación genómica (E.coli)
¾ Transmisión horizontal de factores de virulencia
ÆTransformación de cepas no patógenas en patógenas
Factores de virulencia localizados en genomas de bacteriófagos
lisogénicos
Æ codifican Proteínas que proveen a la bacteria mecanismos de:
¾Invasión de células huésped
¾Evitar defensas inmunes del huésped
¾Daño a células del huésped
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Ejemplos de toxinas codificadas en bacteriófagos
lisogénicos
•
Toxina colérica (ctxAB) Æ CTXΦ (Vibrio colera)
•
Toxina diftérica (tox) Æ β-phage (Corynebacterium diphteriae)
•
Shiga toxina (stx1, 2) Æ H-19B (E.coli)
Inducción del profago Æ Multiplicación del virus (ciclo lítico)
¾ Aumento del número de copias del gen
(Replicación)
¾Regulación positiva de la expresión
Aumento de producción
de toxina
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Bacteriófagos Filamentosos
DNA sc
•
M13, f1, fd (E.coli)
•
•
•
•
Simetría helicoidal
DNA sc circular
Infectan células F+
Liberación de la célula sin lísis Æ ensamblado a nivel de membrana citoplasmática
acoplado a transporte
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RF
DNAdc
Replicación
(circulo rodante)
Enz.
celulares
genoma
DNAsc
transcripción
traducción
Proteínas
virales
Copias del
genoma
DNAsc
Ensamblado en la
membrana y
translocación
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Usos en Biología Molecular de los Fagos Filamentosos
•
Vectores de clonado y secuenciación
Producción de DNA simple cadena
Células infectadas mantenidas en cultivo
Espacio intergénico que puede reemplazarse por DNA
exógeno
•
Bibliotecas de Péptidos
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Usos de virus en Biología Molecular
¾ Vectores de clonado
– Secuenciación (M13)
– Bibliotecas (fago lambda, cósmidos)
¾ Bibliotecas
– Genómicas
– Expresión
– Péptidos (Fd)
¾ Vectores de Expresión
– Baculovirus
– Vaccinia
¾ Terapia Génica
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Terapia Génica
• Virus como vectores para transferencia de genes
– Blanco principal Enfermedades monogénicas
Æ reemplazo de genes alterados
» Fibrosis quística (CFTR)
» Factores de coagulación
» Deficiencias en adenosin-desaminasa (inmunoincompetencia)
Aplicación “ex vivo” o “in vivo”
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Virus usados en terapia génica
¾ Retrovirus
–
–
–
–
–
MLV (virus de leucemia murina)Ævirus defectivos incompetentes en replicación
Integración en el genoma de la célula huéspedÆ expresión a largo plazo
Infectividad limitada a células en división
Capacidad para gen exógeno limitada (8 Kb)
Inactivación por complemento
¾ Adenovirus
–
–
–
–
Sin integraciónÆ Expresión transiente
Virus delecionados incompetentes para replicación
Capacidad 7.5 Kb
Receptores ubicuos
¾ Virus asociados a adenovirus
– Integración en sitios específicos del genoma
– Amplio rango de células blanco
– No asociado a enfermedades
¾ Herpesvirus, Vaccinia, Syndbis virus
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