Saccharomyces cerevisiae 4-6 μm La levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo y herramienta para el estudio de enfermedades genéticas humanas Dr. Pascual Sanz 3º Curso de Genética Humana, Valencia, Enero 2008 1 Saccharomyces cerevisiae: bases de datos www.yeastgenome.org Saccharomyces cerevisiae: genética Segregación mendeliana de caracteres a b c d 1 2 Mayo-1997 3 1 2 3 EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for Functional analysis 2 Facilidad de introducción de plásmidos y de expresión de proteinas heterólogas URA3, TRP1, HIS3, LEU2 -Integrativos -Centromericos (CEN) -Episomales (2μm) -Supresión por sobrexpresión Métodos genéticos -Supresores extragénicos. -Letales sintéticos. Expresión constitutiva (ADH1p) Expresión regulable (GAL1p) 3 3.1.- Supresión por sobrexpresión 3.2.- Supresores extragénicos -Transformación con librería. -Selección de transformantes. Rescate del plasmido. -Comprobación de supresión. -Identificación de gen supresor en multicopia. En el caso de fragmentos grandes, acotar el gen responsable de la supresión. 4 Saccharomyces cerevisiae: modelo estudio de rutas de señalización 3.3.- Synthetic letal effects La combinación de dos mutaciones, viables cada una de ellas por separado, conduce a una perdida de la viabilidad. Cruce con colección de mutantes 5 Glucose Hxts Glucose Metabolismo Glucosa Hxk2 Reg1/Glc7 Expresión génica Snf1-P Snf1 Crecimiento Mig1 Cat8 SUC2 FBP1 Sanz et al., (2000) Mol. Cell. Biol. 20:1321 6 Elements involved in glucose repression Component Yeast Pancreatic β-cell Low-affinity glucose transporter Hxt1 Glut2 Glucose phosphorylating enzyme (sensor) Hxk2 GlkB Protein kinase Snf1 AMPK Reg1/Glc7 PP1? Protein phosphatase Glucose Insulin Glucose transporter Glucose Glucokinase Glucose 6-P Metabolism ATP:ADP K+ (-) After Efrat et al., 1994. TIBS 19: 535 +2 Ca ΔΨ (+) Sensor de glucosa F. M. Matschinsky (1990) Diabetes 39: 647 7 . HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 ...........MLDDRARMEAAKKEKVEQILAEFQLQEEDLKKVMRRMQKEMDRGLRLET 49 MVHLGPKKPQARKGSMADVPKELMDEIHQLEDMFTVDSETLRKVVKHFIDELNKGL...T 57 MVHLGPKKPQARKGSMADVPKELMQQIENFEKIFTVPTETLQAVTKHFISELEKGL...S 57 :::.:: * : * *: * ::: .*:::** : HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 HEEASVKMLPTYVRSTPEGSEVGDFLSLDLGGTNFRVMLVKVGEGEEGQWSVKTKHQMYS 109 KKGGNIPMIPGWVMEFPTGKESGNYLAIDLGGTNLRVVLVKLS....GNHTFDTTQSKYK 113 KKGGNIPMIPGWVMDFPTGKESGDFLAIDLGGTNLRVVLVKLG....GDRTFDTTQSKYR 113 :: ..: *:* :* . * *.* *::*::******:**:***:. *: :..*.:. * HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 IPEDAMTG.TAEMLFDYISECISDFLDKHQMK..HKKLPLGFTFSFPVRHEDIDKGILLN 166 LPHDMRTTKHQEELWSFIADSLKDFMVEQELLNTKDTLPLGFTFSYPASQNKINEGILQR 173 LPDAMRTTQNPDELWEFIADSLKAFIDEQFPQGISEPIPLGFTFSFPASQNKINEGILQR 173 :*. * : *:.:*::.:. *: :: . :*******:*. ::.*::*** . HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 WTKGIKASGAEGNNVVGLLRDAIKRRGDFEMDVVAMVNDTVATMISCYYEDHQCEVGMIV 226 WTKGFDIPNVEGHDVVPLLQNEISKR.ELPIEIVALINDTVGTLIASYYTDPETKMGVIF 232 WTKGFDIPNIENHDVVPMLQKQITKR.NIPIEVVALINDTTGTLVASYYTDPETKMGVIF 232 ****:. .. *.::** :*:. *.:* :: :::**::***..*:::.** * : ::*:*. HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 GTGCNACYMEEMQNVELVEG...DEGR....MCVNTEWGAFGDSGELDEFLLEYDRLVDE 279 GTGVNGAFYDVVSDIEKLEGKLADDIPSNSPMAINCEYGSFDN.EHLVLPRTKYDVAVDE 291 GTGVNGAYYDVCSDIEKLQGKLSDDIPPSAPMAINCEYGSFDN.EHVVLPRTKYDITIDE 291 *** *..: : .::* ::* *.:* *:*:*.: .: :** :** HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 SSANPGQQLYEKLIGGKYMGELVRLVLLRLVDENLLFHGEASEQLRTRGAFETRFVSQVE 339 QSPRPGQQAFEKMTSGYYLGELLRLVLLELNEKGLMLKDQDLSKLKQPYIMDTSYPARIE 351 ESPRPGQQTFEKMSSGYYLGEILRLALMDMYKQGFIFKNQDLSKFDKPFVMDTSYPARIE 351 .*..**** :**: .* *:**::**.*: : .:.::::.: .:: ::* : :::* HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 SDTGDRKQIYN..ILSTLGLRPSTTDCDIVRRACESVSTRAAHMCSAGLAGVINRMRESR 397 DDPFVFLEDTDDIFQKDFGVKTTLPERKLIRRLCELTGTRAARLAVCGIAAICQKRG... 411 EDPFENLEDTDDLFQNEFGINTTVQERKLIRRLSELIGARAARLSVCGIAAICQKRG... 411 .*. : : : . :*:..: : .::** .* .:***::. .*:*.: :: HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 SEDVMRITVGVDGSVYKLHPSFKERFHASVRRLTPS.......CEITFIESEEGSGRGAA 450 ...YKTGHIAADGSVYNKYPGFKEAAAKGLRDIYGWTGDASKD.PITIVPAEDGSGAGAA 464 ...YKTGHIAADGSVYNRYPGFKEKAANALKDIYGWTQTSLDDYPIKIVPAEDGSGAGAA 465 :..*****: :*.*** .:: : *.:: :*:*** *** HuGlkB ScHxk1 ScHxk2 LVSAVACKKACMLGQ...... 465 VIAALSEKRIAEGKSLGIIGA 485 VIAALAQKRIAEGKSVGIIGA 486 :::*:: *: . . Phosphate 1 hxk2 Sugar binding + GlkB Connect 1 Phosphate 2 Adenosine Connect 2 - La glucokinasa pancreá pancreática humana complementa la funció función fosforiladora de glucosa Hxk2 (PDB: 2nzt); Kuser et al (2000) - La glucokinasa pancreá pancreática humana complementa la funció función reguladora de Hxk2 Hxk2 GlkB Identities 33% Similarities 54% (Mayordomo et al., 2001) 8 GlkB mutations isolated in MODY2 and hyperinsulinemic patients T168P: Formas mutantes de GKB aisladas de pacientes con MODY2 identificadas como perdida de actividad , no muestran ni actividad catalítica ni funcionalidad en el proceso de señalización por glucosa en levaduras. Y214C A456V Matschinsky, (2002), Diabetes 51: S394 1.1.- No glucokinase is present in cells or if present is inactive (MODY2). 2.2.- Glucokinase is present and it is as active as regular enzyme (MODY2). A53S y V367M: Formas mutantes aisladas de pacientes con MODY2 con propiedades cinéticas similares a la silvestre, muestran buena funcionalidad en el proceso de señalización por glucosa en levaduras. Y214C y V455M: Formas mutantes aisladas de pacientes con hiperinsulinismo, hiperinsulinismo muestran una mayor afinidad por la glucosa y una buena funcionalidad en el proceso de señalización por glucosa en levaduras. 3.3.- Glucokinase is present and it is hyperactive (hyperinsulinism). hyperinsulinism). 9 Elements involved in glucose signaling Component Yeast Pancreatic β-cell Low-affinity glucose transporter Hxt1 Glut2 Glucose phosphorylating enzyme (sensor) Hxk2 GlkB Protein kinase Snf1 AMPK Reg1/Glc7 PP1? Protein phosphatase Hxk2 (PDB: 2nzt); Kuser et al (2000) GlkB (PDB: 1v4s); Kamata et al (2004) 10 AMP-activated protein kinase, AMPK [AMP]:[ATP] e.g. anoxia Otras señ señales e.g. estré estrés hiperosmó hiperosmótico Nutrientes Ejercicio Estrés AMP ATP Corazón AMPK-P Adipocitos Lipogénesis y lipólisis ACC, FAS, L-PK Fosfofructoquinasa-2 Translocación GLUT4 Glucólisis Lipasa sensible a hormonas AMPK Glucógeno fosforilasa Anabolismo HMG-CoA Reductasa Catabolismo Glucógeno sintasa Acetil-CoA Carboxilasa Translocación GLUT4 Efectos a largo plazo: Regulació Regulación de la expresió expresión gé génica GLUT4, Hexoquinasa II ACC, FAS, L-PK PPI PEPCK, G6Pasa Enzimas mitocondriales Músculo esquelético Gasto energé energético Hígado Páncreas Aporte energé energético Oxidación ácidos grasos Cetogénesis Lipogénesis, síntesis de colesterol y triacilgliceroles Oxidación ácidos grasos Captación de glucosa Secreción de insulina Gluconeogénesis 11 AMPK, diabetes y obesidad High glucose 1) El efecto neto de la activació activación de AMPK por ejercicio o mediante activadores farmacoló farmacológicos podrí podría ser efectiva para corregir la resistencia a insulina en pacientes con alteraciones de la tolerancia tolerancia a Snf4 Low glucose Pak1, Elm1, Tos3 glucosa y diabetes tipo 2. Reg1/Glc7 2) La metformina y la rosiglitazona (antidiabé (antidiabéticos orales) son capaces de activar AMPK in vivo. α1, α2 β1, β2 γ1, γ2, γ3 P T210 Snf1 Sip1/Sip2/ Gal83 Inactive Non-stress Active AMPK γ AMPK 3) AMPK juega un papel en la regulació regulación de la toma de alimentos, alimentos, por acció acción sobre las neuronas del hipotá hipotálamo. lamo. Stress LKB1 CaMKKβ CaMKKβ P SNF1 T172 AMPK α AMPK Ppase? AMPK β Inactive Active 12 AMPK e Hipertrofia del mú músculo esquelé esquelético y cardí cardíaco. Glucogenosis. Glucogenosis. En 2000, se describe en cerdos una mutació mutación en la subunidad AMPK γ3 (R200Q) como la responsable de elevados contenidos en glucó glucógeno en mú músculo esquelé esquelético (Milan (Milan et al., 2000). La función nuclear de la protein fosfatasa de tipo 1 (PP1) - PP1 es esencial para una correcta progresión del ciclo celular - PP1 no tiene NLS, pero alcanza el núcleo por unión a proteinas reguladoras En humanos, mutaciones halladas en subunidades gamma de AMPK abundantes en corazó corazón (AMPK (AMPK γ2) está están relacionadas con la cardiopatí í a familiar cardiopat hipertró hipertrófica (HCM) y con el síndrome de WolffWolff-ParkinsonParkinson-White (WPW) Introducció Introducción de formas AMPKγ AMPKγ en snf4, snf4, actividad constitutiva 13 Yeast vs Humans Yeast Yeast Sds22-Glc7-Ypi1 form a ternary complex Yeast Humans Humans Inh3 Ypi1 Glc7 PP1 PPP1R11 21% 90 % Sds22 Ypi1 Glc7 Sds22 hSds22 Inh3 PP1 hSds22 PPP1R7 46 % In humans hSds22-PP1-Inh3 also form a heterotrimeric complex No direct interaction between Inh3 and hSds22 Lesage et al. Biochem (2007) 14 Ypi1 functional studies Construction of a ypi1 conditional mutant W303ypi1 Δ::KANMX4 (pGAL1- HA-Ypi1) 8 100 7 Glucose 4% Galactose 2% 4 G2 DNA replication 0 0 HA GALACTOSE YPI1 ON 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 S 24 GLUCOSE Bud formation Glucose 4% OFF 0 2 3 4 6 M G1 Time (h) Ypi1 8 24 hours ON OFF 70 2 1 80 Chromosomal segregation Percentage OD600 5 Nuclear migration 3 pGAL1 Galactose YPI1 Glucose YPI1 90 Spindle formation 6 KANMX4 60 50 40 30 20 10 START Growth 0 35 G1 30 S-phase Metaphase/Anaphase Telophase KDa Western anti-HA Depletion of Ypi1 causes cell growth arrest Ypi1 is necessary for the progression from metaphase to anaphase Similar results have been reported in a sds22 mutant MacKelvie et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 3777-3785 15 Summary of Ypi1 and Sds22 functional studies Complementation of yeast mutants with mammalian orthologues W303 ypi1 Δ::KANMX4 Glc7 Glc7 Ypi1 Sds22 Ypi1 Inh3 + hSds22 (pGAL1- HA-Ypi1) Inh3 does NOT complement a ypi1 mutant Sds22 Inh3 interacts physically with yeast Glc7 but NOT with ySds22 KANMX4 Ypi1 (NLS) nucleus EGFP-PP1γ F257A FLAG-hSds22 EGFP EGFP-PP1γ Galactosa (ON) Glucosa (OFF) pWS-Inh3 Lex A pWS-Inh3 Lex A Lesage et al (2004) JBC 279: 55978 pWS93 Lex A pWS-Ypi1 Lex A pWS 93 Lex A pWS-Ypi1 Lex A COS1 cells pWS-Inh3 LexA hSds22 pWS-Inh3 LexA hSds22 EGFP-PP1γ F257A GST-Inh3 pWS93 LexA hSds22 pWS93 LexA hSds22 Lesage et al. unpublished The co-expression of Inh3 plus hSds22 complements ypi1 deficiency 16 Epileps y + Saccharomyces cerevisiae: herramienta de estudio Sistema de doble híbrido Neurod egener ation (Fields and Song, 1989. Nature 340: 245) AD BD lacZ - Interacción in vivo. - Deben de alcanzar el núcleo - Proteínas solubles, estables lacZ lacZ n i r o f la LAFORA DISEASE Malin en g o c y Gl 17 SECOND GENE RELATED TO LAFORA DISEASE EPM2A, 6q24: LAFORIN G279S 53/90 (59%)/ 47 mut * C266S W32G T194I R241X R108C F84L 17/90 (19%)/ 51 mut EPM2B, 6p22.3: MALIN Q293L Y294N G240S Malin has E3-Ubiquitin ligase activity P301L NH 2 116 156 COOH DSPD Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 (1-101) (102-160) (161-240) (241-331) Consensus PTPase Laforina DUS5 (H. sapiens) F28C6.8 (C. elegans) YVH1 (S. pombe) PTP3 (C. eugametos) Q302P Q226X C68Y F33S 320 CBD P264H E280K D146N E67Q 1 Malin L87P C26S P69A 22 73 395 1 NH2 RING finger 2 3 4 5 6 COOH NHL I T VHC-AG--RSG EKGHIVYVHCNAG VGRSTAAVCGWLQ EKGGKVLVHCEAG ISRSPTICMAYLM SKG KTVYVHCKAG RTRSATVATCYLM SKNAKVLVHCFAG ISRSVTLVAAYLM ASGGVCL VHCLAG ISRSASVVIAYLM C266S 18 Importance of the Laforin- Malin interaction (I) Malin L87P C26S P264H E280K P69A E67Q D146N Q302P Q226X C68Y F33S 22 ? Laforin 73 395 1 NH2 2 RING finger Malin 3 4 5 6 COOH NHL Yeast T-H: LexA-Malina mut + GAD-Laforina (E3-Ubiquitin ligase) LD Polyglucosan accumulation β-Galacotosidase (Units) 50 (DS-phosphatase) 40 30 20 10 0 WT+GAD E3 Ubiq ligase WT + C26S - P69A D146N - + Q226X E280K nd nd Interaction of malin with laforin is crucial for function 19 The Laforin-Malin interaction is a regulated process Importance of the Laforin- Malin interaction (II) G279S Q293L W32G T194I R108C F84L 1 116 R241X G240S Interaction between laforin and malin is increased at low-glucose conditions Yeast Two-hybrid Y294N 320 Yeast two-hybrid: LexA-Laforin + GAD-Malin pGBT9-laforin mut + pACT2-malin P301L 156 140 COOH 120 Some LD-laforin mutations abolished the interaction with malin A) CTY10.5d 100 80 60 40 - P301L - C266S + Q293L - Y294N - R241X T194I G240S - - G279S F84L + R108C - W32G WT Phosphatase activity none 20 The phosphatase activity of laforin is crucial for function - - - - Binding to glycogen - + - nd - nd + nd - - - - + Binding to R5/PTG - + - - - nd - - - - ++ The interaction with R5/PTG is crucial for function - - 20 B) 4% glucose 0.05% glucose 15 10 5 LexA-Laforin LexA-Laforin + + GAD-Malin GAD Activation of Snf1/AMPK kinase 4% glucose 0.05% glucose 400 β-Galactosidase (Units) DSPD Relative Interaction CBD β-Galactosidase (Units) NH2 300 200 100 Wild type snf1Δ Snf1/AMPK improves binding of laforin to malin 20 Conclusiones Unidad de Señalización por Nutrientes SAF2005-00852 - Saccharomyces cerevisiae es un modelo de estudio ideal para procesos fisiológicos conservados. Aporta información sobre la posible función de genes conservados, así como permite el estudio de las alteraciones asociadas a patología humana. - Saccharomyces cerevisiae es una herramienta potente para el estudio de procesos fisiológicos no conservados. LSHM-CT-2004-005272 Exp. 061932 Miguel, Leda, MC, Tere, Dani, Santi, Ada, Luisa y Elena INTRA/07/738.1 CIBERER U-742 21 Colaboraciones - GlkB - Alberto Marina, IBV. - Antonio Cuesta Muñ Muñoz, Hospital Carlos Haya, Má Málaga. - Luis Castañ Castaño, Hospital de Cruces, Barakaldo. Barakaldo. - AMPK - Grahame Hardie, Hardie, Wellcome Trust Biocentre, Biocentre, Dundee Univ. Dundee. Dundee. - David Carling, Carling, MRC Clinical Sciences Centre, London. London. - Glc7/PP1, Ypi1, Sds22 - Joaquí Joaquín Ariñ Ariño, Dept. Dept. Bioquimica y Biologí Biología Molecular, UAB, Barcelona. - Mathieu Bollen, Dept. Dept. Mol. Mol. Cell Biol. KULeuven. KULeuven. - LaforinaLaforina-malina - Santiago Rodriguez de Có Córdoba, CIBCIB-CSIC, Madrid. - Joan Guinovart, Guinovart, Parc Cientific de Barcelona. - Erwin Knecht, Knecht, Centro Invest. Invest. Principe Felipe, Valencia. - Jose Maria Serratosa, Serratosa, Fundació Fundación Jimenez Diaz, Diaz, Madrid. Madrid. La levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo y herramienta para el estudio de enfermedades genéticas humanas Dr. Pascual Sanz 3º Curso de Genética Humana, Valencia, Enero 2008 22