Laboratorio de Introducción a la Microbiología Practico N° 3

Universidad Técnica Federico Santa María
Departamento de Ingeniería Química y Ambiental
Laboratorio de Introducción a la Microbiología
Practico N° 3
“RECUENTO BACTERIANO Y ANÁLISIS DE AGUA”
CRECIMIENTO BACTERIANO
Introducción
Crecimiento es el incremento ordenado de todos los componentes de un
organismo. La multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento. En organismos
unicelulares la multiplicación conduce a un aumento en el número de individuos dando
lugar a una población o aun cultivo.
El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular
(número de células por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de
las células por unidad de volumen de cultivo). Estos dos parámetros no siempre son
equivalentes, debido a que el promedio de peso seco de la célula varía en las distintas
etapas de la historia del cultivo.
Cinética exponencial
Durante la fase exponencial de crecimiento, la tasa de incremento de la masa
bacteriana en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente:
dB/dt = B
(1)
donde B es la masa bacteriana, t el tiempo y  la tasa constante de crecimiento
instantáneo para cada cultivo concreto ( es decir el aumento relativo por unidad de
tiempo) Por tanto:
dB/B = dt (o d ln B = dt)
(2)
Bt = Bo et; e integrando: (3)
lnBt/Bo = t, o ln Bt = ln Bo + t
(4)
Por tanto, durante esta fase, la representación gráfica del logaritmo de B frente al
tiempo da lugar a una línea recta. Esta gráfica semilogaritmica suele ser la que se emplea
para representar curvas de crecimiento bacteriano. Suele ser útil expresar la tasa de
crecimiento como tiempo de duplicación (tD), denominado también tiempo medio de
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generación (TMG). Este valor se obtiene asignando a Bt el valor 2Bo en la ecuación 4 (
es decir, el doble):
ln Bt/Bo = ln2 = tD
tD = (1/) ln 2 = 0,69 (1/)
1/tD =  = 1,45
El valor recíproco del TMC,  (= 1/tD), es la tasa constante de crecimiento
exponencial, expresada en generaciones por hora. Su valor es 1,45 veces mayor que la
tasa constante de crecimiento instantáneo , ya que el valor de B, y, por tanto, de B,
aumenta continuamente durante el crecimiento exponencial, y cuando se duplica la masa
bacteriana, la tasa de síntesis celular se duplica con respecto al instante inicial (ver
Figura de gráfica).
RECUENTO DE MICROORGANISMOS
El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de
microorganismos que hay en una muestra. Para este propósito, existen diferentes
métodos mediante los cuales se pueden contar microorganismos vivos (recuento de
viables), o bien vivos y muertos (recuento de totales). A su vez todos los tipos de
recuento, se pueden clasificar en directos e indirectos. Un recuento directo es aquel en el
que se cuentan las células por observación directa al microscopio, y el recuento indirecto
es aquel en el que se determina el número por crecimiento o alguna propiedad de los
microorganismos.
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1.- Recuento de Totales
a) Recuento de Breed
Es un método que entrega recuento de totales. Se utiliza para recuento de
microorganismos en la leche.
Para realizar este método usted, sobre un porta objetos limpio y desengrasado
dibuje con un lápiz un cuadrado de un centímetro cuadrado.
Homogenice la muestra problema y con una pipeta Pasteur coloque una gota de
la muestra (aproximadamente 0,01 ml) sobre el cuadrado y extiéndala bien sin salirse de
él.
Seque y fije al calor suavemente, luego cubra la extensión con cristal violeta
durante un minuto. Lave con agua y seque.
Observe al microscopio con aceite de inmersión.
Cuente el número de microorganismos en varios campos, no menos de 5. Luego
calcule el promedio de microorganismos contados y multiplique por 3000 (área del
campo del microscopio) y por 100 (inverso del inoculo colocado en el cuadrado).
Nº de células/ml = X de células por campo x 3000 x 100
3000, corresponde al área del campo del microscopio y debe ser calculado para
cada uno, o referirse al fabricante.
100, corresponde al inverso del inoculo depositado en el portaobjeto.
b) Recuento con cámara de Petroff-Hauser o Hemocitómetro.
Este método consiste en colocar una diminuta gota de cultivo en un portaobjetos
especial llamado Hemocitómetro (porque fue ideado originalmente para el recuento de
glóbulos rojos). La muestra queda depositada en un espacio de 0,02 mm entre el porta
y el cubreobjeto. La excavación completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16
cuadrados más pequeños. Para calcular el número de células por ml de muestra, se debe
hacer la siguiente operación:
-
Contar las células presentes en varios cuadrados grandes y sacar un
promedio.
Multiplicar el promedio por 25 (con esto se obtiene el Nº de células en un
mm2).
Multiplicar por 50 (esto entrega el número de células en un mm3).
Multiplicar por 1000, para transformar todo a cm3.
Nº cel/ml = X cel x 25 x 50 x 1000
Este recuento representa la cantidad de células vivas y muertas. El método es
aplicable a cualquier suspensión de partículas microscópicas.
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c) Recuento con sales de tetrasolium.
Las sales de tetrasolium son un compuesto que se agrega a la preparación, el cual
se reduce como producto del metabolismo y las células se tiñen de color rojo. Las células
muertas quedan sin teñir (el compuesto no es utilizado y queda insoluble).
d) Recuento por Microscopia de Fluorescencia.
Las bacterias se tiñen con naranja de acridina, compuesto que es capaz de
integrarse al DNA bacteriano por lo que las células vivas quedaran fluorescentes. Éste
método es también un método de recuento de viables y no de totales y directo.
2.- Recuento de células viables.
En muchos casos queremos contar sólo las células vivas. Una célula viva se
define como aquella capaz de dividirse, y un conteo de la viabilidad celular generalmente
se efectúa determinando la cantidad de células de una población que son capaces de
dividirse y formar colonias. El método de conteo en placas es el más ampliamente usado
y dos son las versiones de esta técnica: la placa vertida y la placa extendida.
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a) Método de la placa extendida
En el método de la placa extendida, una muestra generalmente pequeña de 0,1 ml se
extiende asépticamente sobre la superficie de una placa de cultivo con el medio adecuado
y bien seco y se incuba hasta que las colonias son visibles a simple vista.
Se entiende que cada colonia se originan de una sola célula por lo tanto contando el
número de colonias se puede calcular la cantidad de células viables de la muestra.
b) Método de la placa vertida
Con el procedimiento de la placa vertida, la muestra se mezcla con el agar el cual
debe encontrarse a una temperatura de 45 a 50ºC colocándose posteriormente sobre la
placa de Petri estéril. Los microorganismos quedan entonces fijos dentro del agar y
forman colonias. Con las placas servidas se pueden emplear volúmenes de muestra de 1,0
ml o más, siendo posible el recuento de lodos o suspensiones como las que se obtienen
de alimentos o medios homogeneizados. Una desventaja importante de esta técnica es
que los microorganismos dañados por el breve calentamiento del agar fundido no pueden
contarse.
El recuento en placa es muy sensible debido a que, en principio, cualquier célula
viable, si se pone en medio de cultivo adecuado, dará lugar a una colonia. Además de su
sensibilidad, el recuento en placa permite también la identificación positiva del organismo
que se va a contar, en vista de que la colonia formada puede servir como inoculo para un
cultivo puro puede a su vez ser identificado taxonómicamente. Más aun, puesto que
organismos diferentes frecuentemente producen colonias diferentes en forma, textura,
tamaño y color, diferentes tipos de organismos pueden contarse en una mezcla. Una de
las principales suposiciones en los procedimientos para el recuento en placa es que cada
colonia se origina de una sola célula, pero sin por el azar dos células quedan dispuestas
muy cerca de una de la otra, durante la incubación, pueden dar origen a una sola colonia
fusionada, que no puede diferenciarse de la que se originó de una sola célula.
La experiencia práctica ha determinado que debe haber menos de 300 colonias
por cada placa de cultivo para minimizar el problema.
c) Método de las diluciones y plaqueo (viables).
Se toma 0,1 ml de un cultivo problema bien homogeneizado con una pipeta
estéril y se diluye progresivamente en tubos con 9 ml de solución salina estéril al 0,8% de
NaCl.
En lo posible se recomienda hacer cada dilución con una pipeta nueva
homogeneizando bien la suspensión en cada paso.
Se obtienen así las siguientes diluciones:
10-1 , 10-2 , 10-3 .................................... 10-8 , 10-9, 10-10
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De las tres últimas se toma 0,1 ml y se siembra en la superficie de una placa de
Petri con agar nutritivo bien seco y posteriormente con un asa de Drigalsky se
homogeniza la siembra por todo el medio el cual debe estar bien seco.
Incubar las placas a la temperatura adecuada de crecimiento durante 24-48 horas.
Una vez incubadas las placas, cuente el número de colonias que aparecen en cada
una de ellas y saque un promedio. Tome en cuenta las placas que contengan entre 30 y
300 colonias solamente.
Luego el valor promedio del número de colonias multiplicado por el valor
recíproco de la dilución correspondiente y por 10 (colocamos 0,1 ml de inoculo) nos da
el número de microorganismos por ml de la muestra problema.
Nº cel/ml = X colonias x factor de dilución x 10
Ejercicio: Si en la placa correspondiente a la dilución 10-8 aparecen 38 colonias,
el número de microorganismos viables por ml de muestra inicial será?
d) Método Turbidimétrico.
Un medio de cultivo estéril, que ha sido inoculado va presentando turbidez a
medida que la población celular va en aumento. Este fenómeno puede ser medido en un
espectrofotómetro.
Se coloca un volumen medido de cultivo, en un tubo especial de vidrio
transparente de diámetro conocido. Este es interpuesto entre una unidad de foco
luminoso, y otra unidad fotoeléctrica, la cual está acoplada a un galvanómetro o disco de
lectura, el cual registra el porcentaje de la luz transmitida a través de la suspensión de
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células. El porcentaje de tramitancia de la luz a través del tubo se relacionará de manera
inversa con la turbidez del tubo.
Este método es rápido, sencillo y puede determinarse el número de células
correspondiente a cada lectura por recuento en placa. Con él se puede confeccionar la
curva de crecimiento de un cultivo bacteriano, información necesaria cuando se desea
trabajar con cultivos en fase exponencial.
Figura El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la
cantidad de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La
célula bacteriana dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a
la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene células bacterianas y está transparente. El de la
derecha contiene alrededor de mil millones (109) de células por mililitro y, por lo tanto,
está turbio. (c) La curva patrón relaciona la absorbancia con el número de células
bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir
cualquier medida de absorbancia en número de células. Por ejemplo, a partir de esta
curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100
millones (108) de células por mililitro
e) Número más probables de microorganismos.
Es posible hacer determinaciones de conteo de viabilidad empleando sólo cultivos
líquidos, con la técnica del Número Más Probable (NMP). En esta técnica, la muestra
que va a ser contada se diluye hasta que la densidad celular sea de menos de 1 célula por
ml. En estas condiciones ya no es apropiado hablar de concentraciones de células, sino
más bien de la probabilidad de encontrar una célula. Por ejemplo, si existen 5 células en
10 ml, la concentración puede expresarse como 5 x 10-1 células por ml. Sin embargo, las
células viables son desde luego individuales, por lo tanto, decimos que en
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este ejemplo existe una probabilidad de 0,5 por cada ml del tubo de que contenga una
célula viable. Si el tubo se vaciara tomando 10 muestras de 1 ml cada una, 5 de ellas se
esperaría que contuvieran una célula y 5 que carecieran de ella. Este concepto es la base
del procedimiento del NMP. Se toma una cantidad de muestra pequeña por duplicado
(generalmente 1 ml), de una muestra diluida, y cada una de ellas es inoculada en un tubo
separado de medio fresco de crecimiento, que posteriormente es incubado para permitir
la proliferación del microorganismo. Los tubos que reciben una célula mostrarán
crecimiento (proliferación) y los que no la tienen no mostrarán crecimiento. La
proporción de tubos inoculados que muestran crecimiento es una medida de la
probabilidad que se acaba de mencionar. Esta probabilidad puede convertirse
nuevamente a concentración celular en la muestra, considerando el número de diluciones
y el empleo de las tablas del NMP. Las tablas del NMP son una derivación estadística del
número más esperado o más probables de células que producirá el patrón de crecimiento
observado. Para que llegue a ser útil es procedimiento del NMP, la muestra debe diluirse
lo suficiente, sino se hace esto, todas las muestras contendrán células viables y todos los
tubos inoculados mostrarán crecimiento cuando se incube. Por el contrario, si la muestra
ha sido muy diluida, ninguno de los tubos inoculados mostrará crecimiento.
El método está diseñado para trabajar con series de 3, 5 y 10 tubos por cada
dilución. Cuando mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor será la precisión del
método.
El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al
aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen
sólo un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos
que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede
determinarse el número más probable de células. Este valor, multiplicado por el factor de
dilución nos proporciona el número de células viables de la muestra.
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El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar
en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo
mixto que pueden crecer en un medio líquido determinado. Por ejemplo, puede
emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número
de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias
probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la
presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.
f) Recuento en filtro de membrana.
f.1) Introducción
En 1955 la décima edición de los Standar Methods for Examinacion of Water, incluía
como método tentativo en la determinación de coliformes la técnica de filtración por
membrana.
En las ediciones siguientes de esta publicación, éste método se hizo oficial para la
determinación de coliformes. Actualmente, está siendo utilizada como un método
normalizado. Cada laboratorio deber realizar pruebas comparativas con la técnica de los
tubos múltiples con la finalidad de poder aplicarla mejor.
Esta técnica permite examinar volúmenes muy variables de agua y ofrece
resultados directos de la concentración de bacterias coliformes en lugar de un estimado
estadístico, como es el caso de la técnica de los tubos múltiples. Ciertos tipos de
muestras no pueden ser filtradas debido a la presencia de turbiedad, poblaciones
excesivamente altas de bacterias no coliformes, o metales pesados. Estas dificultades
pueden encontrarse al examinar muestras de algunas aguas de pozos, lagos pequeños o
efluentes industriales.
f.2) Resumen del método
El procedimiento de filtración consiste en pasar con ayuda del vacío la muestra de
agua a través de una membrana de celulosa de 0,45 micrones. La limitación con los
volúmenes depende también de la presencia de turbiedad. Cuando se trata de aguas
contaminadas es necesario diluir previamente las muestras. Para efectuar la dilución se
debe tener en consideración que el número ideal de colonias en el filtro de membrana
está entre 20 y 60. La muestra se filtrará a través del filtro de membrana
convenientemente colocado en el soporte de filtración.
El filtro es colocado en una placa de petri conteniendo un medio con agar adecuado:
M-FC para coliformes fecales, temperatura de incubación 44,5ºC por 24 horas
M-Endo para coliformes totales, temperatura de incubación 37ºC por 24 horas.
El tiempo transcurrido desde la filtración hasta la incubación no debe exceder a los 30
minutos.
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Ventajas
 Los resultados son obtenidos más rápidamente, principalmente para bacterias
del grupo coliformes.
 Volúmenes mayores de muestra pueden ser examinadas
 Los resultados son más precisos que los esperados por la técnica de los tubos
múltiples
 Los equipos y materiales necesarios ocupan menor espacio con relación a la
técnica de los tubos múltiples.
Limitaciones
 En las muestras con bajo recuento de coliformes y relativamente gran
cantidad de sólidos en suspensión, el crecimiento bacteriano se puede
constituir a veces en una película continua sobre la superficie de la membrana,
imposibilitando el recuento.
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Ejercicios
1.- En el estudio de una curva de crecimiento a las 4 horas se determinó el número de
microorganismos por el método de Breed, obteniéndose al contar 3 campos 11, 8 y 10
MO. A las 16 horas por el método de diluciones y plaqueo, tres placas presentaron 150,
215, 180 UFC, con un inoculo de 0,01 en la dilución 10-8. Calcule:
a) Tiempo generacional
b) K
2.- Una muestra se diluyo a la tercera parte de su volumen, posteriormente se realizaron
5 diluciones decimales y tres centesimales. A partir de la serie de diluciones centesimales,
se siembran 3 series de 5 tubos por dilución, mediante NMP. Después de la incubación se
obtuvieron los siguientes resultados: 534
Calcule el NMP/ml
3.- Se toma 1 litro de agua de pozo para ser analizado mediante la técnica de los tubos
múltiples: de esta forma se tomaron 10 ml y se diluyeron en 90 ml de solución salina,
luego se realizaron diluciones sembrándose 3 alicuotas de 1 ml de cada dilución hasta la
dilución 10-3. Se obtuvieron los siguientes resultados: 532.
Calcule el Nº de NMP/l.
4.- En el estudio de una curva de crecimiento a las 4 horas se determinó el número de
microorganismos por el método de Breed, obteniéndose al contar 5 campos 13, 9, 7, 9 y
12 MO. A las 16 horas por el método de dilución y plaqueo, se toman 800 [mL] y de
estos 10 [mL] se diluyen en 90 [mL]. Luego se hacen 7 diluciones decimales. AL
sembrar en placas de la última dilución se obtienen: 310, 470, 301 UFC. A continuación
se realizan 8 diluciones decimales, 2 centesimales y 7 milesimales, sembrando de la
penúltima dilución en una serie de placas obteniendo como resultado: 310, 250, 130, 70,
28, 13. Calcule:
a) Tiempo generacional
b) K
5.- De una muestra de leche, se realizó el recuento de Breed en 6 campos distintos,
contando 6, 7, 15, 4 y 8 microorganismos a las 5 horas. Luego, de 50 [mL] de leche, se
tomaron 25 y se diluyen en 225 [mL] de caldo peptonado, de esa dilución, se realizaron
6 diluciones decimales, 5 centecimales y 4 milidecimales, del último tubo, se sembró en
placas, obteniendo 500, 298, 150, 420, 49, 63 y 301 UFC a las 10 horas. Calcular:
a) Nº microorganismos/mL
b) Nº microorganismos/mL de la muestra inicial
c) Constante k
d) Tiempo Generacional
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6.- Se desea conocer el número de microorganismos presente en una muestra de agua y
su tiempo de duplicación. Se entrega las curvas de crecimiento y absorbancia y además
se recomienda para obtener un buen resultado realizar 7 diluciones de 1 en 9. De la
última dilución se mide la absorbancia obteniéndose 1.68.
Absorbancia vs tiempo
Curva de Crecim iento
2,5
1500000
MOml
Absorbancia
2
1,5
1
1000000
500000
0,5
0
0
0
0
20
40
Tiem po [m in]
60
80
20
40
60
80
100
Tiem po [m in]
7.- Usted debe analizar una muestra de 400 [ml] de leche de cabra comprada en el
mercado de Valparaíso, a continuación realiza dos procedimientos paralelos para
determinar la presencia de coliformes:
Procedimiento A: Se realizan 3 diluciones milesimales y se siembra 3 series de tubos por
dilución, mediante NMP, con un inóculo de 0,1 [ml] en caldo BRILA. Después de la
incubación, se obtuvieron los siguientes resultados: 552.
Procedimiento B: Se realiza 2 diluciones decimales y 2 centesimales, de la última dilución
se toma 1 [ml] y lo lleva a 99 [ml]. De esta última dilución se filtra en triplicado para
M-ENDO y en triplicado para M-FC. El volumen filtrado cada vez fue de 1 [l]. Luego de
incubar a condiciones que cada medio requiere, se obtuvieron 110, 70 y 55 UFC en MENDO; mientras que para M-FC se contaron 20,60 y 40 UFC.
Calcule:
a) Nº de coliformes totales en la muestra original determinado por NMP.
b) Nº de coliformes fecales por [ml] de muestra por método de filtración
c) Nº de coliformes totales por [ml] de muestra por método de filtración
8.- Se desea saber el grado de contaminación de un río. Se toman 400 [L] de los cuales
se sacan 10 [mL] y se diluyen en 90 [mL]. Luego se diluye hasta la dilución 10-7. A
partir de esta se realizan una siembra en 4 placas con la técnica de placa extendida,
obteniendo 301, 420 y 450 UFC. Más tarde se hacen 10 diluciones más: 3 decimales, 5
centesimales y 2 milesimales, tomando de la penúltima dilución y sembrando por técnica
de placa extendida en 7 placas obteniendo 380, 280, 140, 32, 29, 75 y 83 Calcular el Nº
de microorganismo en la muestra original.
100