Reacciones enzimáticas
Anuncio
Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Reacciones enzimáticas Sergio Huerta Ochoa UAM-Iztapalapa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Síntesis de compuestos orgánicos aturaleza Industria química Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología La naturaleza de las enzimas 1) La reacción química se lleva a cabo bajo condiciones suaves 2) Acción específica de acuerdo a la clase de enzima 3) Tasas de reacción muy rápidas 4) Numerosas enzimas para diferentes objetivos Enzymes at work (www.novozymes.com) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Enzimas típicas usadas en procesos industriales Clase Enzimas Industriales 1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa oxidasas, lacasas 2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosiltransferasas 3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas, pectinasas, proteasas, pululanasas 4. Liasas Pectato-liasas, α-acetolactato decarboxilasas 5. Isomerasas Glucosa isomerasa 6. Ligasas o son usadas actualmente Enzymes at work (www.novozymes.com) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Mercado mundial de enzimas industriales ($1,500,000 USD en el año 2000) (McCoy, 2000) 10 % 25 % 65 % Enzimas técnicas (Industrias: Detergentes, almidón, textil, curtidos, pulpa y papel, y cosméticos Enzimas en la industria alimentaria: láctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y aceites, y panificación. Enzimas en alimentación animal Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Puntos principales de la aplicación comercial de un catalizador enzimático • Velocidad de reacción (actividad catalítica) • Extensión de la reacción (constante de equilibrio) • Duración de la actividad (estabilidad) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Energía de activación Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Diseño de biorreactores Balance de materia F (S i − S o ) = v r V reactor F, S0 F, Si donde: νr = velocidad de reacción Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Leyes fundamentales de la cinética • Velocidad de la reacción [P] [A]0 v0 t • Orden de la reacción d[P] ---- = v dt =k Orden cero A P d[P] ---- = v dt = k CA Orden uno A P d[P] ---- = v dt = k CA CB Orden dos A+ B P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Consideraciones al definir el orden de una reacción • No se puede decir que todas las reacciones poseen un cierto orden (Reacciones complejas) • No se debe intentar deducir el orden de una reacción de su ecuación estequiométrica (Depende del mecanismo de la reacción) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato Efecto de proximidad y efecto de orientación Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Modelo de ajuste inducido Hexoquinasa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Modelo llave-cerradura S P k1 k cat ES E EE k -1 k1 E+S k cat ES k -1 E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Los experimentos cinéticos revelan propiedades enzimáticas Cinética química • Los experimentos examinan la cantidad de producto (P) formado por unidad de tiempo (∆ ∆[P] / ∆t) • Velocidad (v) – la tasa de una reacción (varía con la concentración de reactante) • Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o eficiencia de una reacción Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Cinética enzimática • Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la enzima E + S ES E+P • Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de substrato (la enzima esta saturada con el substrato) • Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E], y la reacción es pseudo-primer orden Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Velocidad inicial (vo) • La velocidad al inicio de una reacción catalizada enzimáticamente es vo (velocidad inicial) • k1 y k-1 representan una rápida asociación /disociación no covalente de substrato del sitio activo de la enzima • kcat = constante de la tasa para formación de producto de ES E+S k1 k-1 kcat ES E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Curva de progreso para una reacción catalizada enzimáticamente • La velocidad inicial (vo) es la pendiente de la porción lineal inicial de la curva • La tasa de la reacción se duplica cuando se usa el doble de enzima Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Leonor Michaelis 1875-1949 Maud Menten 1879-1960 Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Consideraciones de equilibrio rápido (Ecuación de Henri-Michaelis-Menten) 1. Reacciones involucradas k1 E+S k -1 ES 2. Balance de masa [E ]t = [E ] + [ES ] 3. Velocidad limitante v = kcat [ES ] 4. Dividir por [E]t k [ES ] v = cat [E]t [E] + [ES] 5. Expresión de equilibrio KS = [E ][S ] ,∴ [ES ] = [S ] [E ] [ES ] KS [S ] [E] k cat 6. Sustituir en términos de [E] KS v = [E]t [E] + [S ] [E] KS v 7. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax k cat = [S ] K S + [S ] E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Briggs JBS Haldane Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Consideraciones de estado estacionario (Ecuación de Briggs-Haldane) k1 k cat E+P 1. Reacciones involucradas E+S ES k -1 d [ES ] 2. Balance de masa = k1 [E ]⋅ [S ] − (k −1 + kcat ) ⋅ [ES ] dt 3. En estado estacionario 4. Constante de Michaelis d [ES ] =0 dt [E ]⋅ [S ] = k−1 + kcat [ES ] k1 5. Velocidad limitante v = k cat [ES ] 6. Dividir por [E]t k [ES ] v = cat [E ]t [E ] + [ES ] 7. Sustituyendo [ES] [S ] [E ] v KM = kcat [E ]t [E ] + [S ] [E ] KM v 8. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax = [S ] K M + [S ] = KM Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Cinética de Michaelis-Menten ν Vmax ν = Vmax [S] KM + [S] Vmax 2 KM [S] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología La ecuación de Michaelis-Menten • La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está saturada con el substrato (alta [S]) • A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden cero con respecto a S) • A bajas [S] la reacción es de primer orden con respecto a S • La forma de una curva vo versus [S] es una hipérbola rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima conforme [S] se incrementa Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S] (a) Cada punto vo vs [S] se obtiene de un experimento cinético (b) La constante de Michaelis (KM) iguala la concentración de substrato necesario para alcanzar ½ de la velocidad máxima Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología El significado de KM • KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax • KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1 • Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado será el enlace del substrato • KM puede ser una medida de la afinidad de E for S Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología KM y concentraciones de substrato fisiológicas • Los valores de KM para las enzimas son típicamente arriba de [S], tal que las tasas enzimáticas son sensibles a pequeños cambios en [S] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Las constantes cinéticas indican la actividad enzimática y la especificidad • La constante catalítica (kcat) – constante de la tasa de orden uno para la conversión de complejo ES a E + P • kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con S • La relación kcat /KM , llamada también coeficiente de especificidad, es una constante de segundo orden para E+S a bajas concentraciones de [S] E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Significados de kcat y kcat/KM Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Ejemplos de constantes catalíticas Enzyme kcat(s-1) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Valores of kcat/KM • kcat/KM puede aproximar la tasa de encuentro de dos moléculas no cargadas en solución (108 to 109 M-1s-1) • kcat/KM es también una medida de la especificidad de la enzima por diferentes substratos (constante de especificidad) • Aceleración de la tasa = kcat/KM Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Cálculo de KM y Vmax La gráfica doblerecíproca Lineweaver-Burk es una transformación lineal de la gráfica de Michaelis-Menten (1/vo versus 1/[S]) Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Reacciones reversibles k1 E+S k2 ES k -1 E+P k -2 Consideración de estado estacionario V max d v neta = [S ] K ms 1+ − V maxr [S ] K ms + [P ] [P ] K mp K mp Donde: V maxd = k 2 [E ]t K ms k + k −1 = 2 k1 V maxr = k −1 [E ]t K mp = k 2 + k −1 k −2 Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Inhibición por substrato (Consideración de equilibrio rápido) KS E+S 1. Reacciones involucradas k cat ES + S E+P KI ES2 2. Balance de masa [E ] t = [E ] + [ES ]+[ΕS2] 3. Velocidad limitante v = k cat [ES ] 4. Dividir por [E]t 5. Expresiones de equilibrio v = k cat [ES ] [E ] t [E ] + [ES ] + [ES2] [E ][S ] , KS = [ES ] k cat 6. Sustituir en términos de [E] 7. Donde Vmax = kcat [E]t [ES ][S KI = [ ES2 ] ] [S] [E ] KS v = [E ] t [E ] + [S ] [E ] + [S ]2 [E ] KS K S KI v V max = KS [S ] + [S ] + [S ]2 KI Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Vmax [S ] v= K M + [S ] + 1 KM 1 1 1 [S ] = + + v Vmax [S ] Vmax Vmax K I [S ] 2 Ki 0.25 25.0000 0.2 20.0000 0.15 1/v V nmol/l*min Inhibición por substrato 15.0000 0.1 10.0000 5.0000 0.05 [S]max 0 0.00E+00 0.0000 0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05 1/[S] [S] nM 1/V 1 KM 1 1 = + v Vmax [S ] Vmax KI se calcula de: [S ]max = K M Ki 1/Vmax -1/KM KM/Vmax 1/[S] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Inhibición enzimática Los inhibidores de enzimas son importantes por varias razones 1) Pueden ser usados para obtener información acerca de la forma del sitio activo de la enzima y los residuos de amino ácidos en el sitio activo 2) Pueden ser usados para obtener información acerca del mecanismo químico 3) Pueden ser usados para obtener información acerca de la regulación o control de una vía metabólica 4) Pueden ser muy importantes en el diseño de medicamentos Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sistemas de inhibición simple • Inhibición competitiva • inhibición no competitiva • Inhibición acompetitiva Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Modelo de inhibición competitiva I P S KS kp ES E E KS Ki E+S + I Ki EI EI kp ES E+P Consideración de equilibrio rápido v Vmax = [S ] [ I] 1 + + [S ] KS K i Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Inhibición competitiva 1/v0 Incremento de [I] KM aumenta Vmax no cambia 1/Vmax -1/KM 1/[S] Pend. -KI [I] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Modelo de inhibición no competitiva S KS E ES E+P I Ki Ki KS EI ESI KS E + S + I Ki KS EI + S E+P ES + I Consideración de equilibrio rápido v V max Ki ESI [I ] 1 + K i [ S] = K S + [S ] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Inhibición no competitiva 1/v0 Incremento de [I] KM no cambia Vmax disminuye 1/Vmax -1/KM 1/[S] Inter. -KI [I] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Modelo de inhibición acompetitiva + S E ES kcat E+P KS + I Ki ESI KS E+S ES kcat Ki ESI E+P Consideración de equilibrio rápido [S ] v = Vmax Km + [S ] [I ] 1 + [I ] 1 + K i K i Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Inhibición acompetitiva 1/v0 Incremento de [I] KM disminuye Vmax disminuye 1/Vmax 1/[S] -1/KM Inter. -KI [I] Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Equilibrio rápido en sistemas bi y tri-reactantes E +A+B EAB E+P donde: B = Sustrato A = Cosustrato, coenzima o coactivador E = Enzima otas: 1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida para los sistemas de enlace aleatorio 2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sistemas bi-reactantes aleatorios KB EB + A E+B + A α KA KA α KB EA + B kp EAB Consideración de equilibrio rápido [A ] ⋅ [B ] v V max α ⋅ K AK B = 1+ [A ] + [B ] + [A ] ⋅ [B ] KA KB α ⋅ K AK B E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sistemas bi-reactantes ordenados EA + B E +A EAB Consideración de equilibrio rápido [A ] ⋅ [B ] v V max K AK B = [ A ] [A ] ⋅ [B ] 1+ + KA K AK B E+P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sistemas tri-reactantes aleatorios EAB +C α β KC EABC +C EA β KC EAC E+P+ Q+R EB +C EBC α KC E v Vmax +C KC EC Consideración de equilibrio rápido [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ] α ⋅ β ⋅ γ ⋅ K AK B KC = [A ] + [B ] + [C ] + [A ] ⋅ [B ] + [A ] ⋅ [C ] + [B ] ⋅ [C ] + [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ] 1+ K A K B KC γ ⋅ K AK B β ⋅ K AKC α ⋅ K B KC α ⋅ β ⋅ γ ⋅ K AK B KC Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Sistemas tri-reactantes ordenados Sistema Ter Ter ordenado KP KA KB E EA EAB KC kp (EABC EPQR) EQR Consideración de equilibrio rápido [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ] v V max K AK B KC = [A ] + [A ] ⋅ [B ] + [A ] ⋅ [B ] ⋅ [C ] 1+ KA K AK B K AK B KC KQ KR ER E Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Multisitios de enlace de sustrato Sitios de enlace no cooperativos v V max [S ] 1 + [S ] n −1 K S K S = n [ S] 1 + KS v V max [ S] = K S + [S ] Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzina de un sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una molécula de n sitios de enlace Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Enzimas alostéricas 1.0 0.9 (a) 0.8 0.7 0.6 v 0.5 (b) 0.4 0.3 Enzima alostérica 0.2 0.1 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 [S] Comparación de curvas de velocidad. (a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Enzimas alostéricas Sitios de enlace cooperativos (Modelo de interacción simple: Adair Pauling) Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace KS E+S + S ES + S P+ E α KS SE + S E+P α KS KS kp kp SES kp ES + P SE + P Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Enzimas alostéricas Sitios de enlace cooperativos (Modelo de interacción simple: Adair Pauling) Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace Consideración de equilibrio rápido v V max [S ] + 3[S ]2 = KS aK S2 [S ] 3[S ] + 2 + a bK S3 a 3b 2cK S4 3 4 S] 4[S ] 6[S ] 4[S ] [ + + 2 + 3 2 4 1+ 2 3 KS aK S a bK S a b cK S 2 donde: 3 Vmax = 4 kp [E]t 4 Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnología Enzimas alostéricas Ecuación simplificada para enzimas alostéricas (Ecuación de Hill) Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato es muy marcada v V max [ S] = n K '+[S ] n Donde: n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima K’ = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante de disociación intínseca
