Tècnicas de histoquimica ,IHQ y utilidad diagnostica en patología

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Técnicas de Histoquímica e Inmunohistoquímica
en Patología Neuromuscular: utilidad
diagnóstica
Soraya Barrera Cabañeros ( TEAP)
Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología. Hospital Meixoeiro
Complexo Hospitalario Universitario de Vigo – CHUVI
Instituto de Investigación Biomédica de Vigo
¿QUÉ SON LAS ENFERMEDADES
NEUROMUSCULARES?
• Son enfermedades crónicas de evolución variable
• La mayoría son de origen genético y algunas adquiridas
• Se caracterizan por debilidad muscular, miotonía,
calambres…
• Afectan al SNC, SNP, unión n-m y fibra muscular
• Pueden afectar a otros órganos
• Su aparición puede ser en cualquier etapa de la vida
SARCÓMERO: Unidad contráctil del músculo
Enfermedades Neuromusculares
Biopsia muscular
+
Historia clínica
Datos paraclínicos
Laboratorio Miopatología
Disección - Orientación
M/E
Inmunogold
Banco de Tejidos
Congelación
Cortes criostato
Histoquímica
Inmunohistoquímica
Microscopía Confocal
DIAGNÓSTICO
Extracción de DNA
Wb
Bioquímica
Banco de DNA
PCR multiplex
RFLP
Secuenciación
Otras
Consejo genético
250-300 biopsias de músculo y nervio/año
(85% de la Comunidad Gallega)
Histoquímica
Morfología
Estudio de proteínas
Estudio genético
Inmunohistoquímica
Microscopía electrónica
Estudio bioquímico
ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS I
TAMAÑO Y FORMA
 Fibras atróficas, anguladas o no
 Fibras hipertróficas
 Fibras hipercontraídas
 Fibras redondeadas
 Figuras de “splitting”
NÚCLEOS
 Múltiples
 Internalizados
 Agregados (“clumps”nucleares)
ALTERACIONES MORFOLÓGICAS BÁSICAS II
CITOPLASMA
 Degeneración – necrosis
 Miofagia
 Vacuolización: lípidos, glucógeno, vacuolas autofágicas
 Invasión parcial
ESPACIO EXTRACELULAR
 Infiltrados inflamatorios
 Fibrosis
 Sustitución adiposa
TRICRÓMICO DE GOMORI
(Modificado por Engel y Cunningham, 1963)
 Patrón intermiofibrilar
 Mitocondrias (RRF)
 Bastones nemalínicos
 Cuerpos citoplásmicos
 Retículo sarcoplásmico
 Vacuolas autofágicas
Fibras(“ragged red fibers”)
Bastones nemalínicos
Vacuolas ribeteadas
TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS
1- Valorar el exceso de un sustrato determinado:
glucógeno, lípidos
2- Mostrar cambios estructurales no visibles con
técnicas histológicas
3- Evaluar los tipos de fibras musculares:
1, 2A, 2B, 2C
4- Ausencia de un enzima determinado
OIl RED
Gotas lipidicas, lipofucsina
PAS
Tipos de fibras
Glucógeno (lisosomal, libre)
HISTOQUÍMICA. PRINCIPIOS BÁSICOS IV
ENZIMAS OXIDATIVAS
• NADH (Nicotinamida adenina
dinucleótido)
– Patrón intermiofibrilar:
• Retículo sarcoplásmico
• Mitocondrias
• SDH (Succino-Deshidrogenasa)
– Mitocondrias
• COX-SDH (Citocromo oxidasa )
– Mitocondrias
NADH
Central core
Targets
Fibras apolilladas
Fibras anulares
Miopatía mitocondrial
HE
SDH
Gomori
COX-SDH
Miopatía por agregados tubulares
HE
TRI
NADH
SDH
ATP-asas
4.6
9.4
4.3
Fibras
tipo 1
Fibras
tipo 2a
Fibras
tipo 2b
Fibras
tipo 2c
ATPasa
9.4
Marrón
claro
Marrón
oscuro
Marrón
oscuro
Marrón
oscuro
ATPasa
4.63
Marrón
oscuro
Blancas
Marrón
claro
Marrón
claro
ATPasa
4.35
Marrón
oscuro
Blancas
Blancas
Marrón
claro
Atrofia por denervación
4.3
Atrofia neurógena
HE
Miofosforilasa
PAS
Miofosforilasa
Mioadenilato Desaminasa
CONTROL (MAD+)
MAD NEGATIVO
Miopatía por déficit de MAD
INMUNOHISTOQUÍMICA
• Permite visualizar y localizar proteínas específicas
 déficit primario
 déficit secundario
• Debe valorarse conjuntamente con las técnicas
histológicas e histoquímicas
Guillaume- Benjamin
Amand Duchenne
(1806-1875)
1868: Paralysie pseudo-hypertrophique,
or myosclerotique, de l’Enfance
(Archives Générales de Médecine)
ANTICUERPOS
• Espectrina
• Merosina
• Distrofina (Dys 1, 2 y 3)
• Alfa2-laminina
• DRP1
• Emerina
• DRP2
• LAMP2
• Alfa-SG
• Caveolina
• Beta-SG
• Miotilina
• Gamma-SG
• Miosina (slow, fast)
• Delta-SG
• Troponina PGP 9.5
• Alfa-DG
• Colágeno VI
• Beta-DG
• Notch 3
• Disferlina
• Serie linfoide, desmina,
• Calpaína 3
marcadores vasculares,
actina, etc
Duchenne
Distrofina
Espectrina
Utrofina (DRP2, Control)
Utrofina
Becker
Dystrophin
DRP
CMD
Merosin
Spectrin
Emery Dreyfuss
Emerin
Emerin, Control
Emery Dreyfuss
Emerina, Control
EDMD
Emerina, Control
EDMD
-DISTROGLICANO
Control
Antibody: clon VIA4 (glycosylated epytope)
INMUNOHISTOQUÍMICA
DIFICULTADES DE INTERPRETACIÓN Y SOLUCIONES
• Interacción de varias proteínas (distrofina-sarcoglicanos;
disferlina-otras)
• Pueden obtenerse falsos resultados si se usa un único
anticuerpo
• La ausencia de una proteína puede dar lugar a la
sobreexpresión de otras (distrofina y dystrophin-related
protein)
• Las proteínas nucleares se expresan en cualquier tipo
de célula (emerina, lamina A/C)
PRINCIPIOS PARA EL MANEJO DE LAS MUESTRAS
•
LA MUESTRA DEBE SERVIR PARA TODOS LOS ESTUDIOS
•
CUALQUIER MUESTRA DEBE PODER RETOMARSE EN EL
FUTURO (Bancos de tejidos y ADN)
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