Análisis de agentes tireostátiws en productos cárnicos 69 ANALISIS DE AGENTES TIREOSTATICOS EN PRODUCTOS CARNICOS Departamento de Bromatología, Toxicología y Análisis Químico -4plicado. Facultad de Farmacia Universidad de Barcelona RESUM Es fa una revisió bibliogrAfica sobre que utilitza una CCF per a la detecció la utilització del Metiltiouracil (MTU) final, en l'anhlisi de 36 mostres de tiroicom a finalitzador, de les seves implica- des procedents de bestiar' boví i porcí. cions i de les diferents tkcniques per a la seva detecció. Se n'aplica una, proParauies ciau: Metiltiouracil, an8isi. posada per De Brabander i Verbeke, SUMMARY After a bibliographical review about the employ and problems of the methyltiouracile (MTU) as meat fmalizer and its usual analytical procedures, it has ben applied the proposed method by De Brabander and Verbeke, which uses the TLC for the final detection. It has been analyzed 36 samples of bovine and swine thyroids. Key words: Methyltiouracile, detection of. A R X l U S d e I'Esc. d ' A g r i c de Barcelona 70 INTRODUCCION Durante el año 1980, los medios de información se hicieron eco de la problemática del empleo de finalizadores en la alimentación del ganado vacuno y su presencia en los derivados cámicos Se presentaba un problema con doble vertiente. En primer lugar, su presencia en alimentos significaba un peligro para la salud pública (especialmente los estrógenos de síntesis) (1 ). Por otra parte, y para el caso concreto de los agentes tireoestáticos, es indudable que la utilización de los mismos supone un fraude para el consumidor, ya que la ganancia de peso obtenida en reses y añojos no es debida a un aument o en la producción de carne sino que tiene su origen en una retención hídnca (2). Esto se traduce, en la mayoría de los casos, en un sobrepeso de un 10-15 % aproximadamente (1 ). El empleo de antitiroideos en la alimentación animal es relativamente reciente. El descubrimiento de los tiouracilos sintéticos se debe a Kennedy (1942) (3). Este autor observó en estos compuestos propiedades bociógenas. Posteriormente, en 1948, Venero obtuvo resultados positivos en la ganancia de peso en cerdos alimentados con dietas que contenían tiouracilos (4). Anteriormente, ya se conocía el hecho de que algunas plantas utilizadas en la alimentación del ganado tenían propiedades antitiroideas; este es el caso de ciertas cruciferas como el trébol blanco, coles, nabos, algunas gramíneas, etc.(5). Esto dio pie al uso masivo de este tipo de sustancias para completar la última fase del cebo, ya que según algunos au- tores, además de los efectos positivos sobre la ganancia de peso, se observaba una mejora en el índice de conversión del pienso (1). El Metiltiouracilo (MTU) se ha hecho muy popular en el mundo ganadero durante la última época, dado que su uso como finalizador ha ido reportando amplios beneficios, es un producto relativamente barato, de fácil administración y de resultados rápidos (40 dias) (1). Este agente actúa a nivel glandular inhibiendo la formación de hormonas tiorideas (figura 3), provocando, com o consecuencia, un estado hipotiroideo en el animal, con una hipertrofia e hiperplasia glandular o bocio. Dato particularmente interesante, pues ya el tamaño y el peso de la tiroides son orientativossobre el posible tratamiento del animal con las citadas sustancias (figuras 1 y 2). Otros efectos paralelos se traducen en una retención hídrica en el tramo gastrointestinal y en el tejido conectivo. Hay un descenso del metaboIismo basa1 y un aumento en el contenido de grasas. Asimismo, al inicio del tratamiento se observa una cierta acción anabolizante. Otra ventaja aparente que ofrecía el uso de tireostáticos era el de producir carnes más blancas. Frente a estas ventajas económicas para el ganadero, ya sea a nivel cualitativo o cuantitativo, surgían una serie de riesgos, especialmente el peligro de sobredosificación o bien por prolongación del tratamiento. Así, por ejemplo, se producían una serie de trastornos relacionados con la retención hídnca, 1 Análisis de agentes tireostáticos en p r o d u c t o s cárnicos FIGURA 1 - Muestra núm. 36. Tiroides de peso normal. Animal no tratado. FIGURA 2 - Muestra núm. 32. Hipertrofia tiroidea. Animal tratado con MTU. 71 72 que originaban un encharcamiento general, localizándose edemas subcutáneos duros, principalmente en el bajo vientre y en las extremidades. Hay pérdida de apetito, anemia, timpanizaciones, pudiendo incluso provocar la muerte del animal (6). Estos agentes se metabolizan parcialmente formando el glucurónido correspondiente (del cual n o se conoce bien la estructura) y se excreta junto con la fracción de droga libre por la orina y por la bilis. Estos procesos son muy rápidos, y por esto, desde el punto de vista sanitario, su utilización n o constituye un riesgo elevado para la salud del consumidor, ya que los residuos hallados en carnes son insignificantes (7). En cuanto al posible riesgo carcinogenético, aunque Doniach (8) y Christov (9) realizaron distintos estudios experimetales con antitiroideos, Vaderhaan y Sonie no encontraron pruebas concluyentes que demuestren un efecto cancerígeno directo en el hombre, aún recibiendo los individuos tratados dosis terapéuticas de tireostático (1 0). Por otra parte, un problema adicional que se podría presentar es el de que las carnes hidrohémicas (con un contenido de agua mayor de lo normal) sean más suceptibles de una contaminación bacteriana, con los consiguientes pe rjuicios que de ello deriven (1 1). Así, pues, parece ser que, por el m o mento, la utilización de los citados tireostáticos no supone u n elevado riesgo sanitario, sino más bien un hecho fraudulento para el consumidor. La legislación internacional no ha permanecido impasible, y en sus diferentes años se ha ido prohibiendo su A R X l U S de I ' E x . d'Agric. de Barcelona empleo como promotor del engorde de animales de abasto. En España, la n ~ r m a t i v asobre finalizadores data ya del año 1963, en que se prohibió el uso de estrógenos de síntesis en el engorde de pollos. Sin embargo estaba permitido su uso junto con el de los antitiroideos en otros animales (6). En 1975, a instancias del Ministerio de Gobernación, el Ministerio de Agricultura adoptó medidas más concretas. con la promulgación de un Decreto, el 20 de marzo, en el que se establecía una lista positiva de aditivos que se podían emplear en la alimentación animal. Ni el Dietilestilbestrol (DES) (estrógeno de síntesis) ni los antitiroideos quedaban incluídos (1 1 y 12). En 1977, el Ministerio de Agricultura reforzó esta legislación con dos nuevas resoluciones: una para estrógenos de síntesis y otra para tireoestáticos. Sólo quedaban autorizados aquellos productos destinados estrictamente a uso veterinario, para combatir enfermedades y trastornos. Todo esto quedó recopilado en la Resolución de la Dirección General de Producción Agraria del 3 de marzo, publicada en el B.O.E. del 12 de marzo (1 3). Con el objeto de unificar criterios en el cumplimiento de la citada normativa, se publicó una Circular dependiente del Ministerio de Sanidad y Seguridad Social, Subsecretaría de la Salud, en julio de 1979. En ella se regulan la colocación de avisos, toma y conservación de muestras, peso límite de las glándulas y levantamiento de actas, entre otros temas (14). l I ! l Analisis d e agentes tireonáticos en productos cárnicos 73 Como base de la legislación europea, Diario Oficial una Directiva prohibíenhemos tomado la normativa del C.E.E. do el uso de sustancias con carácter que, en julio de 198 1, publicó en su hormonal y tiroestático ( 15). loduro por tiroides Peroxidasa lodo libre , Bloqueado por N? I NH2 + a entima m i n t o HoH~cH2~co{~+H;QcH2-;-co$ H 1 L -- Monoiodotirosina L- Düodotirosina H n6 1 NH2 , H o 0 o o H 2 - c - c o t 1 i ' o E 1 I L Trüodotirosina (T3) tiouracilos 1 NH2 1 I I H01@cH2-7--{n 1 NHz + H 4 3 H 2 - ; - - $ H L -- Diiodotirosina 1 1 enzima 1 NH2 l Ho@@cH2--co$ H 1 L - Diiodotirosina 1 H L - Tiroxina (Te) FIGURA 3 - Mecanismo de acción del metil-tiouracilo. PARTE EXPERIMENTAL El interés práctico de este trabajo radica, precisamente, en la necesidad de disponer lo más rápido posible de un resultado cualitativo. Por ello, .hasta cierto punto, puede sacrificarse la precisión del mismo con el fin de ganar en rapidez y sencillez del método. En el mismo sentido, hay que sefíalar qve la aplicación de estas determinaciones posee interés en el control de las reses que llegan a los mataderos, y es aquí donde deben practicarse, por lo que en 74 A R X I U S de I'Ecc. d'Agric. de Barcelona la actualidad no puede pensarse en la Es, precisamente, con estos criterios aplicación de sofisticadas técnicas ins- que se han elegido y estudiado las sitrumentales para este tipo de control. guientes técnicas: 1 .- TECNICAS CROMATOGRAFICAS ,, Como eluyente se emplea l . 1.- Metodo descrito por Saldaña, Cap cagel F, y Alonso ( 1 6) una mezcla de cloroformo/metanol bonell (90: 10). La placa, una vez seca, se obSe basa en la visualización de 10s di- se,a bajo luz ultravioleta a 254 nm y ferentes tiouracilos (2-tiouraciio, 4-me- aparecen l q i manchas til-2-tiouracil0 y el 4-propd-2-tiouraci- a los tiourac;13s. Para visualizar las manlo), previa separación por cromatografía chas de modo permanente, puede pulen capa fina, revelando con el reactivo verizarse con la placa una solución de dicloroquinona-clorimida O bien utili- dicloroquinona-clo~mida en isopropazando luz UV a 254 nm. no1 (0,4 % ), obteniendo una coloración amarilla por formación de un comMétodo plejo formado entre el reactivo y los Se someten 25 g de tiroides tritura- tiOuracilos. dos a un desengrasado en Soxhlet con Comentario éter de petróleo durante unas 15 horas. Es una técnica sencilla y asequible a La muestra desengiasada se macera en cualquier laboratorio por escasos que 10 m1 de metanol, manteniéndose en sean sus medios. agitación durante 20 minutos, se filtra Como inconvenientes principales cay se evapora la fase metazólica a sequebria señalar, en primer lugar, la duradad en rotavapor a 4 0 C. El residuo ción del proceso, puesto que el desenseco se recoge en 3 0 m1 de una mezcla. grasado de la muestra requiere un míde cloroformo/metanol ( 1: 1). nimo de 15 horas. Por otra parte, en las La purificación se realiza por cromaextracciones se producen pérdidas notatografía en columna de óxido de alumibles, lo cual, junto con la presencia de nio (grado de actividad 1) eluyendo con numerosas impurezas en el extracto mezclas de polaridad creciente. Se desfinal, hace que la detección cromátoprecian los 8 primeros milílitros, y los gráfica sea problemática. restantes eluatos se evaporan a sequedad y se disuelven de nuevo en 25 m1 1.2.- Método descrito por De Brabande metanol. der y Verbeke La separación se lleva a cabo por cromatografía en capa fina, sembrando Se basa en la separación de varios cantidades de 5 p1 en una placa de sili- antitiroideos (tiouracilo y sus derivados Análisis de agentes tireostáticus en productos cárnicos metil, propil y fenil, junto con el metilmercAptoimidazo1) por cromatografía' en capa fina. Previamente se obtiene un complejo formado por el tiroestático Y el 7-C1-Nitrobenzofurazano, que, una vez revelado con cisteína en solución alcohólica, da fluorescencia al UV a 366 nm. La identificación se realiza por comparación de Rf con los patrones. 75 sin indicador de fluorescencia. La placa se activa a 1 10°C, una hora, y se siembran porciones de 50 pl. El eluyente empleado es una mezcla de clorofomo/ metanol (95:s). El revelador empleado se compone de cisteína en soliición alcohólica, y bajo luz UV a 366 nm se aprecia una coloración amarillo-verdosa que ,permite una mejor visualización de las manchas. El exceso d e reactivo Método avanza con el frente del disolvente. El tiroestático se identifica por compaEn el procedimiento de extracción ración de Rf con el patrón. hemos introducido algunas modificacioEsta técnica permite detectar connes que nos han permitido una mayor centraciones de 20 ppb, aunque los comodidad en el trabajo. autores señalan el límite de detección Se maceran 20 g de muestra trituen 10 ppb. rada con 100 m1 de metanol durante 20 minutos. Luego se centrifuga el extrac- Comentario t o a 2.000 g durante 3 minutos. Pasar aproximadamente la décima parte del Es una técnica sencilla, aunque un sobrenadante a un tubo de extracción y tanto laboriosa, pero dada la escasa acidificar con 1 m1 de ácido clorhídrico complejidad del material utilizado per1N. La grasa se elimina por extraccio- mite analizar distintas muestras al misnes sucesivas con éter de petróleo y éter m o tiempo. etílico para eliminar los lípidos más poPor 'otra parte, la obtención de un lares. derivado con un reactivo específico permite aumentar la sensibilidad del méLa purificación se realiza por co- todo. lumna de resinas intercambiadoras de Hemos estudiado una variante del aniones DOWEX 50W-X8 eluyendo con mismo, aplicando la cromatografía 1ímetanol al 75 %.El extracto percolado quida de alta presión como método de se concentra en rotavapor hasta 1 ml. separación y cuan tificación. Para ello, Luego se diluye con 5 m1 de solución unavez extraído el derivado en solución reguladora de fosfatos (pH 8). etérea, concentramos e inyectamos diLa obtención del derivado se realiza rectamente en el cromatógrafo bajo las en baño de agua a 40°C durante 1 hora, siguientes condiciones: añadiendo 0,l m1 del reactivo en solución = ODS-18 Columna acetónica. Al finalizar, acidificar con Fase móvil = metan01 ácido clorhídrico y extraer el derivado = lml/min Flujo con éter etílico. Se concentra hasta 0 , s Longitud de onda Ó 0,2 m1 y proceder a cromatografiar en del detector = 278nm capa fina. Se utilizan placas de silicagel 76 A R X I U S de I'Esc. d'Agric. de Barcelona Esta variante permite, además, reali- tivo y cuantitativo. zar de forma rápida un- análisis cualita 2.- TECNICA COLORIMETIUCA 2.1.- Método descrito por Van Waes (18) ridad creciente (clorofonno/metanol a 1: 1, metanol, metanol al 75 % y por Se basa en la determinación de metilmetanol). tiouracilo por colorimetría, previa for~~~~~~~i~~los 8 primeros ml y evamación de un complejo coloreado con porar el extracto a sequedad. la dicloroq~inona-clorimida que se lee Para dez,trrollar la coloración se redien es~ectrofotómetroa 435 nm- (Gra- suelve el extracto seco en 21 m1 de solufic 1) ción reguladora pH 7,6, se añade un m1 Método de solución de dicloroquinona-clorimida, se agita y se deja reposar durante Se maceran 20 g de muestra triturada 20 minutos. en 10 m1 de metanol, agitando mecániEl complejo coloreado se extrae con camente durante 30 minutos. cloroformo y se procede a la lectura Una vez filtrado, se concentra el bajo la luz UV a 435 nm. Los resultasobrenadante hasta tener un volumen dos pueden cuantificarse estableciendo final de 25 ml. El concentrado se tras- previamente una curva de calibrado con lada a un embudo de decantación y se concentraciones conocidas de patrón. añaden 25 m1 de agua y 6 0 m1 de éter etílico. Una vez separadas las fases, se Comentario lava la capa etérea con 12,5 m1 de agua, se recogen junto con la fracción acuosa Es una técnica relativamente sencilla anterior y se evaporan a sequedad. y posiblemente más rápida que la anteEl residuo seco se redisuelve en 30 m1 rior. Ofrece buena recuperación y su de una mezcla de~cloroformo/metanol sensibilidad, si bien n o es tan elevada, es (1: 1). aceptable para este tipo de determinaLa purificación se realiza percolando ciones. Sin embargo, presenta, a nuesla solución obtenida por una columna tro juicio, el problema de la presencia de óxido de aluminio (grado de activi- de posibles interferencias al efectuar la dad I), utilizando disolventes de pola- lectura en el colorímetro. Análisis de agentes tireostáticos en productos cárnicos 77 CRAFICA 1 - Espectro al visible de soluciones de MTU de concentraciones 0,02;0,04 y 0,06 mg/ml(l8) RESULTADOS Los resultados analíticos han sido obtenidos segíin el método cromatográfico en capa fina descrito por Brabander y Verbeke (17), pues, a nuestro juicio, ofrece ventajas en relación con los otros métodos estudiados. Las muestras analizadas corresponden a tiroides de bóvidos procedentes del Matadero de Mercabarna y tiroides de cerdo suministrados por el Servei d'Higiene Alimentaha de la Consellena de Sanitat i Seguretat Social de la Gene- 78 A R X I U S de I'Ecc. d'Agric de Barcelona ralitat de Catalunya Hemos de destacar que en el caso de tiroides de terneros (animales en los que el fraude se hace más evidente) la mayoría de las muestras eran escogidas entre las que sobrepasaban los 70 g de peso (límite establecido por la legislación española para una tiroides normal de bóvidos) (8) (Figuras 1 y 2). Las glándulas se recibieron y conser- varon congeladas hasta el mismo momento del análisis, ya que, de no ser así, se habría producido una merma considerable en la concentración de tireostático debido a su rápido metabolismo. A continuación exponemos detalladamente los resultados obtenidos para cada tipo de muestra en las Tablas 1 y II. TIROIDES DE TERNERA Muestra núm. Peso (g) Fecha Lectura Agente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1O 11 12 13 24 31 32 33 34 35 36 60 67 168 175 134 119 157 214 148 177 162 190 182 3 20 179 370 258 110 146 59 3-3-81 11-3-81 16-3-81 18-3-81 18-3-81 23-3-81 26-3-81 2-4-8 1 6-4-8 1 6-4-8 1 6-4-8 1 28-4-81 28-4-81 19-5-81 16-6-8 1 16-6-81 25-6-81 18-9-81 20-9-81 25-1-82 - --- TABLA 1 T + + + + + t - ' MTU MTU MTU MTU MTU MTU MTU -- - -- + + + + + + + + MTU MTU MTU MTU MTU MTU MTU MTU - -- 79 Análisis de agentes tireostáticos en productos carnicos TIROIDES D E CERDO 1 Muestra núm. 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 28 29 3O Fecha peso (g) 4-5-8 1 4-5-81 4-5-8 1 12-5-81 12-5-8 1 12-5-8 1 12-5-81 19-5-8 1 19-5-81 25-5-8 1 28-5-81 3-6-8 1 3-6-81 3-6-8 1 3-6-8 1 40 46 44 41 40 38 43 39 32 41 35 43 37 60 29 Lectura Agente + + + Dudoso Dudoso Dudoso - --- t MTU - --- - - -- - ----- + MTU - - -- TABLA 11' COMENTARIOS 1.- De la revisión bibliográfica realizada, se deduce que el uso de antitiroideos como agentes finalizadores en el engorde del ganado vacuno y porcino, si bien no supone un elevado riesgo para la salud -debido a los bajos niveles residuales hallados- es evidente que representan un peligro potencial, y en cualquier caso un fraude para el consumidor. Precisamente, por estos motivos, está prohibida su utilización. ventajas es la propuesta por De Brabander y Verbeke, debido a su sencillez, buena recuperación, sensibilidad y a que no precisa un instrumental complejo, ya que una simple cromatografía en capa fina es capaz de detectar concentraciones del orden de 20 ppb (referidas a tiroides). 3.- En los resultados obtenidos hemos conseguido una buena correlación entre el peso del tiroides y la presencia 2.- Por lo que a las técnicas analíti- de agente tireostático. Si bien algunas cas se refiere, la que presenta mayores muestras, glándulas de peso elevado, A R X I U S de I'Esc. d'Agric. de Barcelona 80 han dado u n resultado negativo debido al rápido metabolismo de estas sustancias. 4.- La frecuencia de positivos es considerable, aunque, lógicamente, n o es representativa de la situación real, ya que se tomaron muestras sospechosas en la mayoría de los casos. 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