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BIOQUÍMICA DEL BIOFILM CARIOGÉNICO ENFERMEDADES ASOCIADAS A PLACA: CARIOLOGIA Y PERIODONTOLOGIA CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA GENERAL Y BUCAL- FOUBA 2012 Dirección Nacional del Derecho de Autor Expediente Nº 832373 Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 1 INTRODUCCIÓN El desarrollo de la biopelícula o biofilm dental puede considerarse el desencadenante de las enfermedades prevalentes en la cavidad bucal: caries y enfermedad periodontal. La caries dental es una enfermedad de origen bacteriano de etiología multifactorial y que afecta a las estructuras mineralizadas dentales, como el esmalte dental. Cuando alcanza el límite amelodentinario avanza a un ritmo mayor que en el esmalte pudiendo alterar también de esta forma a la dentina y aún al cemento. Por tratarse de estructuras mineralizadas, no pueden ser aplicados los métodos tradicionales para estudiar enfermedades infecciosas. La lesión cariosa es la manifestación clínica de un proceso patológico que viene aconteciendo desde mucho tiempo antes de la aparición de la lesión; por lo tanto, no debe ser confundida con la enfermedad. Si bien esta enfermedad afecta prácticamente a la totalidad de la población mundial portadora de dientes, su incidencia ha disminuido de manera importante en la mayor parte de los países desarrollados en los últimos años, probablemente por las campañas de prevención puestas en marcha. El biofilm, por ser una estructura viviente, no es definido y estable. Constituye un conglomerado dinámico y complejo de bacterias, materia orgánica y sustancias inorgánicas. Su composición varía de una a otra persona, entre distintas localizaciones en la cavidad oral e incluso entre posiciones diferentes dentro de la misma pieza dental. Es innegable la relación existente entre la actividad bacteriana y estos procesos, por lo cual trataremos de explicar los mecanismos de formación de la biopelícula como también las vías metabólicas de los microorganismos involucrados. El adecuado conocimiento de su estructura viable y de las relaciones que tiene con el alimento y los fluidos orales debe dar lugar a técnicas para controlar, inhibir y eliminar el biofilm. Los dientes no se han de “limpiar” como si se tratara de un depósito inerte en la superficie del diente, esto implicaría una gran simplificación de la naturaleza del biofilm. COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL BIOFILM EN SALUD Dado que el biofilm es una inmensa aglomeración de células, su contenido en agua se parece al de las bacterias y fluctúa entre un 70 y 80%. Estudios recientes han señalado que existen dos compartimientos principales en el biofilm dental: una fase acuosa y otra fase sólida o celular. La fase acuosa representa el 10 al 25% del peso total del mismo. Las proteínas constituyen el componente principal de la fase sólida (30-50% del peso seco), siendo aportadas por la secreción salival y el fluido crevicular. También se encuentran lípidos en una concentración que varía entre el 10 y el 15% del peso seco. No se conoce la naturaleza de éstos, ni su función en la actividad metabólica del biofilm y su virulencia. Aproximadamente del 5 al 10% del peso seco está constituido por materia inorgánica, con predominio de calcio, fosfatos y potasio. Los oligoelementos como el flúor, varían según el Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 2 contenido del mismo en el agua y alimentos consumidos. Los carbohidratos constituyen el otro componente del biofilm que está sometido a grandes variaciones de concentración y composición. Dicho biofilm contiene entre un 10 y un 20 % del volumen en forma de polisacáridos. El principal polisacárido extracelular (PEC) aislado del biofilm es el glucano, un polímero de la glucosa cuyos enlaces predominantes son α (1→6), además de una elevada proporción de α (1→3). La fructosa es el componente principal de otro polisacárido hallado en el biofilm, denominado comúnmente levano o fructano. Una de las diferencias importantes entre el fructano y el glucano soluble en agua, es que el primero puede ser degradado por el biofilm bacteriano, mientras que el segundo es muy resistente a la acción hidrolítica enzimática. Por consiguiente el levano desaparece frecuentemente del biofilm después de haber sido sintetizado, constituyendo así una reserva de azúcares fermentables para la flora oral. Otro polisacárido hallado en el biofilm es un polímero formado intracelularmente. El polímero intracelular (PIC) se parece al almidón o al glucógeno, y está constituido por unidades de glucosa enlazadas mediante uniones α (1→4). El significado biológico de los polisacáridos en el biofilm ha sido sometido a numerosos estudios. Los puntos más importantes son: 1. La formación de polisacáridos representa un mecanismo para almacenar energía en la célula y a su alrededor, de la cual se dispone en ocasiones cuando se presenta una necesidad metabólica. 2. La síntesis de los polisacáridos también representa una vía metabólica que permite a las células bacterianas manejar grandes concentraciones de carbohidratos sin tener que utilizar las vías glucolíticas u oxidativas. 3. Los polisacáridos extracelulares (PEC) son importantes en los procesos de adherencia entre las células, así como entre ellas y otras estructuras dentales, como la película y la hidroxiapatita. 4. Los PEC actúan como una barrera que impide la difusión de nutrientes y productos metabólicos finales en su entrada o salida del biofilm. Todos estos factores tienen un significado importante para determinar la patogenia de las enfermedades asociadas al biofilm, y merecen una cuidadosa consideración por los profesionales de la salud bucal. FACTORES NUTRICIONALES Como toda forma de vida, los microorganismos requieren un aporte de nutrientes para su mantenimiento y crecimiento. Éstos nutrientes proporcionan a los organismos la energía necesaria para sus reacciones biosintéticas, así como la materia prima para la síntesis de los componentes celulares. La microflora oral puede alimentarse de un conjunto de nutrientes que a veces es Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 3 superabundante, pero en otras ocasiones es intermitente y limitado en los sustratos requeridos. Las fuentes pueden ser los tejidos y secreciones del huésped, su dieta y también productos metabólicos de los microorganismos que habitan en estrecha proximidad. Los microorganismos orales presentan gran diversidad de requerimientos nutricionales. Como fuente de energía algunos de ellos utilizan carbohidratos mientras que otros pueden preferir aminoácidos o ácidos orgánicos. Para el crecimiento todos necesitan componentes nitrogenados. Las necesidades de nitrógeno son satisfechas por péptidos, aminoácidos o, en algunos casos, amoníaco. Todos necesitan vitaminas, minerales, purinas, pirimidinas, ácidos grasos y otros factores de crecimiento. Debido a la gran diversidad nutricional de los microorganismos, es lógico esperar que la localización de cada uno de ellos se vea grandemente influida por la disponibilidad de los nutrientes requeridos. Por lo tanto, el metabolismo y la actividad nutricional de las bacterias del biofilm dependen de la disponibilidad de nutrientes. En ocasiones, el metabolismo bacteriano se ha de efectuar con deficiencia de azúcares, fosfatos o compuestos nitrogenados, según la localización del biofilm. FORMACIÓN DEL BIOFILM La formación del biofilm tiene lugar aún en períodos de ayuno. Por tal motivo, la matriz del biofilm dental en la que están inmersas las bacterias, presentará diferentes texturas, grosor y composición según se forme en ausencia o en presencia de alimentos. Formación del biofilm en ausencia de ingesta de alimento Luego de un correcto cepillado, a las pocas horas se comienza a colonizar la superficie dentaria. En ausencia de ingesta de alimentos, las bacterias utilizarán fuentes endógenas de nutrientes. Son nutrientes endógenos los producidos en la cavidad oral del huésped. Las fuentes de estas sustancias nutritivas incluyen la saliva, el fluido gingival, las células epiteliales descamadas y los componentes de la sangre. Si bien, en comparación con la saliva, se secretan pequeñas cantidades de líquido del surco gingival, éste aporta albúmina, hemina y α-2-globulina, que son requeridos específicamente por algunos microorganismos. Además, hay otra fuente de nutrientes endógenos, derivada de la facultad de algunos microorganismos para utilizar productos metabólicos terminales o factores de crecimiento liberados por microorganismos vecinos. Los nutrientes endógenos pueden tener significado en algunos casos, por ejemplo, en pacientes alimentados exclusivamente por tubos gástricos, en cuyos dientes se ha observado abundante depósito de biofilm bacteriano. Por lo tanto, el metabolismo bacteriano dependerá de los sustratos metabolizables disponibles. En una situación de ayuno y en ausencia de carbohidratos fácilmente metabolizables, sólo disponen de los azúcares derivados de las glicoproteínas salivales. Esto es posible por la Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 4 acción conjunta de enzimas hidrolíticas extracelulares de dos tipos: - neuraminidasas que remueven los residuos de ácido siálico provocando la desnaturalización proteica y su precipitación a partir de la saliva, - glicosidasas que producen la liberación secuencial de otros azúcares que serán utilizados por las bacterias como fuente de energía. La proteólisis de estas proteínas desnaturalizadas produce péptidos y aminoácidos libres que también podrán actuar como sustratos bacterianos. En estas condiciones, la matriz extracelular de la biopelícula es delgada y relativamente porosa derivada en su mayoría de proteínas salivales. Estas características permiten el paso del oxígeno y fluidos salivales y gingivales hacia el seno de la biopelícula, así como la difusión de los productos ácidos del metabolismo bacteriano en sentido opuesto. De esta manera, estos ácidos podrán neutralizarse por acción de los bufferes salivales o difundir hacia la saliva, con lo cual minimizan el ataque ácido del esmalte. Formación del biofilm en presencia de alimento Cuando hay ingesta de alimentos, los microorganismos los utilizarán como fuentes exógenas de nutrientes. La formación de biopelícula dental es particularmente notoria en las áreas con fisuras, en los puntos de contacto entre los dientes y en los márgenes gingivales. En estas áreas los nutrientes serán metabolizados por las bacterias generando productos que afectarán la integridad de los tejidos dentarios. La composición, forma y consistencia de la dieta, así como la frecuencia de la ingesta, son factores importantes a considerar cuando se intenta comprender las relaciones entre la utilización microbiana de los residuos alimentarios y la composición de la población de bacterias en los ecosistemas orales. Excepto en situaciones especiales, la eliminación del alimento se completa en media hora. Además, los nutrientes derivados de los alimentos raramente afectan a la microflora del surco gingival, ya que el flujo de salida de su líquido actúa impidiendo la penetración de la saliva y los nutrientes exógenos en este hábitat. La influencia del contenido de azúcar en la dieta sobre los ecosistemas orales se ha estudiado más que cualquier otro factor. Hay un gran predominio numérico de microorganismos que utilizan con preferencia carbohidratos como principal fuente de energía. La mayoría de ellos elaboran ácidos orgánicos como producto final del proceso, de forma que las zonas donde pueden acumularse tales ácidos resultan ecológicamente ventajosas para los microorganismos resistentes a ellos. La disponibilidad de carbohidratos procedentes de la dieta es intermitente, sin embargo, algunas bacterias pueden aprovechar el exceso de ellos convirtiéndolos en polisacáridos intracelulares de reserva (PSI) y/o también en polisacáridos extracelulares (PSE) solubles o insolubles de reserva y/o de adhesión. Es necesario tener en cuenta que el tipo de biopelícula que se forme dependerá de las características de la dieta que se ingiera. Así, el consumo de una dieta rica en proteínas y grasas y Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 5 aún aquella que contiene glucosa o almidón resultará poco estructurada y porosa. En cambio, en caso de dietas ricas en sacarosa la biopelícula adquiere el aspecto de una capa gelatinosa. Esto sugiere que existe una relación directa entre el consumo de sacarosa y la presencia de ciertos homopolisacáridos que serán sintetizados por la flora cariogénica de la biopelícula y que darán a la misma las características de resistencia y adhesividad. ACTIVIDADES BIOQUÍMICAS DE LAS BACTERIAS DEL BIOFILM ACTIVIDADES EXTRACELULARES DEL BIOFILM Desde un punto de vista bioquímico, las reacciones más importantes en el biofilm dental son las relacionadas con la utilización metabólica del sustrato proporcionado por la mezcla alimento-saliva que entra en contacto con las bacterias del biofilm. Por esta razón, la clase de alimento y la frecuencia de ingestión tienen máxima importancia para determinar la naturaleza del biofilm formado, así como su potencial patógeno. Cuando se mastican alimentos, algunas partículas quedan retenidas sobre las mucosas y las superficies de la lengua, y también se depositan en los dientes, particularmente en las áreas interproximales. La saliva contiene α-amilasa, que actúa aleatoriamente sobre las moléculas de almidón dando, como productos de hidrólisis, una mezcla de glucosa, maltosa, dextrina y polímeros pequeños de glucosa (9-10 unidades). Este efecto de la amilasa salival tiene poca importancia desde el punto de vista de la digestión de alimentos; sin embargo, no debe ser subestimado en relación con la salud oral. El almidón, debido a su alto peso molecular no es capaz de difundir en el biofilm, pero los productos derivados de la rotura del mismo pueden proporcionar sustratos fermentables algún tiempo después del la masticación del mismo, teniendo en cuenta que es una molécula con un alto grado de retentividad. La saliva contiene, además, sistemas enzimáticos como las óxidorreductasas o las deshidrogenasas. Estas pueden convertir, en presencia de NAD, alguno de los polialcoholes (por ejemplo sorbitol) en fructosa, la que, a su vez, sería mejor metabolizada por las bacterias del biofilm. Estas reacciones enzimáticas no han sido evaluadas extensamente con respecto a su contribución al metabolismo del biofilm y deben ser consideradas en la futura investigación. Sin embargo, el metabolismo de los monosacáridos y disacáridos ha sido estudiado con mayor detalle. Tanto los estreptococos cariogénicos (Streptococcus mutans) como los no cariogénicos (Streptococcus salivarius, mitis, sanguis, milleri) producen cantidades semejantes de polisacáridos extracelulares pero sólo los sintetizados por los cariogénicos resultarán adhesivos. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 6 Es decir que: La diferencia entre los microorganismos cariogénicos y no cariogénicos no reside en la cantidad sino en la calidad de los polisacáridos que producen. Estos polisacáridos extracelulares pueden ser homopolímeros de glucosa (glucanos) o de fructosa (fructanos). Dentro de los glucanos se encuentran los dextranos y mutanos que difieren en el tipo de unión glucosídica como también en sus funciones y solubilidad en agua. Por su parte los fructanos están representados por el grupo de los levanos que, en contraposición, son lineales. Estas características se resumen en el siguiente cuadro: Denominación Tipos de uniones Funciones Solubilidad Reserva Sí Cadena lineal Ramificación dextranos α 1,6 α 1,4 ó α 1,3 energética Glucanos mutanos α 1,3 levanos β 2,6 Fructanos α 1,6 ó α 1,4 Adhesión --- No Reserva energética Sí Las estructuras correspondientes a dextranos y levanos se muestran en el siguiente esquema: Figura 1: Estructura de un glucano ramificado donde se ven los enlaces α- 1, 6 de las cadenas lineales y las ramificaciones α- 1, 4 y α- 1,3. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 7 Figura 2: Estructura de un fructano lineal con enlaces β- 2,6. Formación de polisacáridos La sacarosa tiene importancia especial en el metabolismo del biofilm debido a que los estreptococos tienen enzimas extracelulares sintetizadoras de homopolisacáridos: las glucosiltransferasas. Estas enzimas aprovechan específicamente la sacarosa como sustrato para formar polímeros de elevado peso molecular. Tales enzimas extracelulares no sólo son importantes por sus facultades sintetizadoras, sino también porque representan los mecanismos de enlace que producen la agregación de las células. Los dos grupos principales de enzimas sintetizadoras de los homopolisacáridos son las glucosiltransferasas y las fructosiltransferasas. Las glucosiltransferasas son un grupo de enzimas extracelulares encontradas en bacterias como St. sanguis y St. mutans. Son responsables de la síntesis de glucanos para lo cual hidroliza la molécula de sacarosa y transfiere el residuo de glucosa a un polímero de glucano preexistente. glucosiltransferasa Sacarosa + (glucosa)n (glucosa)n+1 + fructosa glucano Por su parte, el residuo de fructosa es captado por la célula bacteriana donde tiene dos destinos: es metabolizado dando como producto final ácidos orgánicos ó bien es acumulado como polisacárido intracelular de reserva. Los ácidos mencionados difundirán hacia la matriz de la biopelícula acidificando el entorno y produciendo el consiguiente descenso de pH. La reacción no parece requerir un cofactor metálico ni coenzimas, y no resulta afectada por los iones fluoruro. La enzima tiene un amplio pH óptimo (entre 5 y 7). La enzima fructosiltransferasa encontrada en St. salivarius, A. viscosus y algunos St. mutans, sintetiza otro polisacárido extracelular importante, homopolímero de la fructosa, al que se denomina levano o fructano. Este es un polímero de la D-fructofuranosa que muestra un predominio de enlaces β (2→6), tales polímeros tienen elevado peso molecular, son bastante solubles y fácilmente degradables. Dado que estas bacterias también son capaces de degradar dicho polímero, es difícil determinar la verdadera producción de fructano por las bacterias del biofilm. El sustrato específico para las fructosiltransferasas es la sacarosa, de la que se usa la fructosa para incrementar el polímero fructofuranosa, liberando una molécula de glucosa en el proceso. En este caso, la glucosa restante será captada por la célula bacteriana y destinada a la obtención de energía o almacenada como polímero intracelular de reserva, teniendo el mismo Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 8 efecto sobre la biopelícula bacteriana que los descriptos en el caso de la glucosiltransferasa. fructosiltransferasa Sacarosa + (fructosa)n (fructosa)n+1 + glucosa fructano Aunque el glucano y el fructano son los principales polímeros extracelulares formados en el biofilm a partir de la sacarosa, no se deben considerar como los únicos polímeros del biofilm, o que otros azúcares no pudieran ser utilizados por otros sistemas enzimáticos para producir polisacáridos diferentes. Energía de enlace para la síntesis de los polisacáridos GLUCOSA FRUCTOSA Figura 3: Estructura de la sacarosa La sacarosa tiene una unión glucosídica entre α-D-glucosa y β-D-fructosa que incluye los grupos reactivos de ambas hexosas y que tiene una energía libre de hidrólisis equivalente a la del ATP. Tal energía es utilizada para la reacción de polimerización. La energía libre de hidrólisis de maltosa y lactosa es mucho más baja, por lo tanto estos disacáridos no resultan efectivos para la síntesis de polisacáridos extracelulares. Esto explica por que, si bien otros azúcares pueden ser metabolizados por las bacterias, la sacarosa es el único hidrato de carbono eficiente para la síntesis de polímeros extracelulares. Propiedades del biofilm supragingival Según hemos explicado, la matriz del biofilm recién formado, en presencia de sacarosa se convierte con el tiempo en una malla gruesa y gelatinosa de proteínas y polisacáridos, a la que llamaremos biopelícula madura. Esmalte Sacarosa Bacteria Matriz proteica Polisacáridos extracelulares Glucosa Fructosa Figura 4: Formación de polisacáridos extracelulares por bacterias del biofilm a partir de sacarosa dietaria. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 9 El efecto de esta biopelícula gruesa consiste en una limitación del libre movimiento de las moléculas entre la saliva y el biofilm, por ejemplo el oxígeno. Se crea así un ambiente anaeróbico que favorece la fermentación de los azúcares con producción de distintos ácidos orgánicos tales como: láctico, fórmico, acético, propiónico, butírico, que se acumulan al difundir con mayor dificultad y no ser neutralizados por los buffers salivales. Figura 5: Movimiento de los metabolitos entre la saliva y el fluido del biofilm Algunos de los polisacáridos formados presentan propiedades de adhesión impidiendo el barrido de la biopelícula por efecto de la saliva. Otros pueden actuar como reserva de carbohidratos para uso de las bacterias. En efecto, en el ayuno nocturno los levanos actúan como reserva energética ya que son degradados por levanasas bacterianas. El Streptococcus mutans también puede degradar sus depósitos intracelulares, semejantes al glucógeno, obteniendo energía durante los períodos de escasez de nutrientes. Es aceptado actualmente que el proceso cariogénico depende más de la forma y frecuencia de ingestión de azúcar que de la cantidad total de éste que se consume. De modo que si se han de consumir dulces, es más conveniente hacerlo durante las comidas (seguido de una correcta higiene dental) que entre ellas. Curva de Stephan Es sabido que no todos los hidratos de carbono de la dieta serán utilizados de igual forma por las bacterias de la biopelícula. Los carbohidratos poliméricos, como el almidón, son menos accesibles como sustratos para las bacterias de la biopelícula que aquellos de bajo peso molecular. Ello se debe a que los polisacáridos, dado su alto peso molecular difunden con menor facilidad que los mono o disacáridos. Además los polisacáridos deben ser hidrolizados antes de ser metabolizados. El impacto de los diferentes hidratos de carbono sobre el pH de la biopelícula bacteriana fue estudiado por Stephan en 1940, quien realizó una medición directa de los cambios de pH en la Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 10 biopelícula dental utilizando un electrodo de antimonio. Así comprobó que luego de realizar enjuagues con soluciones diluídas de glucosa, fructosa o sacarosa se producía una caída del pH en minutos, originando condiciones de descalcificación en la superficie dental. Este descenso del pH se debió a un incremento de la actividad glucolítica bacteriana. Sobre un biofilm bucal el pH mínimo (aproximadamente 5.5) se alcanzó entre los 15 y 20 minutos después del enjuague con el carbohidrato fermentable, correspondiendo ese valor a la máxima producción de ácido láctico. Después de esto, hubo una recuperación lenta hasta alcanzar los valores de pH iniciales, aproximadamente a los 60 minutos, a medida que el ácido láctico fue reemplazado por otros ácidos más débiles y se produjo la difusión y neutralización por bufferes salivales. pH Tiempo (min) Figura 6: Curva de Stephan mostrando la respuesta de la biopelícula dental humana a la sacarosa. El estudio se hizo sobre una biopelícula desarrollada durante 72 hs. A tiempo 0 los pacientes se realizan un enjuague prolongado (60 seg.) con solución de sacarosa al 10%. En contraste con los monosacáridos y la sacarosa, las soluciones de almidón al 10% tuvieron poco efecto o ninguno sobre el pH de la biopelícula por las razones antes comentadas. Los alcoholes o azúcares como el xilitol (derivado de xilosa) o el sorbitol (derivado de glucosa) no son metabolizados por las bacterias de la biopelícula y por lo tanto no producen caída de pH. Por esta razón se ha extendido su uso como edulcorantes alternativos de la sacarosa para productos seguros dentalmente o no cariogénicos. Stephan realizó la misma curva en un grupo de pacientes con baja actividad cariogénica y en otro con alta actividad. En el primer grupo el descenso del pH del biofilm luego del enjuague fue menor y el retorno a los valores iniciales fue más rápido que en el segundo grupo. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 11 pH en salud cariogénico Tiempo (min) Figura 7: Curva de Stephan en un biofilm en salud y en biofilm cariogénico. Debemos tener en cuenta además que los valores de pH varían de un sitio a otro dependiendo del espesor de la biopelícula y el acceso de saliva. De tal forma que en el gráfico pH de la placa podemos comparar las variaciones de pH entre la biopelícula oclusal y la biopelícula interproximal. Oclusal Interproximal Tiempo (min) Figura 8: Curva de Stephan en un biofilm oclusal y en otro interproximal. ACTIVIDADES INTRACELULARES DEL BIOFILM Una vez formado el biofilm en la superficie del diente, las bacterias continúan metabolizando los sustratos disponibles para satisfacer sus necesidades energéticas y producir componentes estructurales destinados al mantenimiento y la reproducción. Los carbohidratos son la fuente principal de energía y pueden provenir de la dieta o de los polisacáridos intracelulares. Desde el punto de vista metabólico las biopelículas bacterianas pueden dividirse en dos grandes grupos según su principal fuente energética: a) las que utilizan preferentemente carbohidratos que convierten en ácidos orgánicos y tienden a disminuir el pH. b) las que utilizan preferentemente material nitrogenado y producen sustancias básicas que tienden a incrementar el pH; Es importante destacar que las bacterias usan ambos tipos de sustratos aunque cada bacteria en particular metaboliza preferencialmente uno de ellos. Las bacterias del biofilm Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 12 supragingival utilizan como principal fuente de energía los hidratos de carbono. Todos estos sustratos pueden provenir de la dieta, del fluido de la biopelícula, de la saliva o del fluido gingival. El desarrollo de caries depende inversamente de la exposición a la saliva; así, los dientes anteriores inferiores que están continuamente bañados por ella son en general más resistentes a las caries mientras que los superiores, en dónde su acceso es más limitado, son más proclives a desarrollarlas. Por otra parte, aquellas regiones muy expuestas a la saliva, especialmente en el lado lingual de los incisivos inferiores y en el lado bucal de los molares superiores, tienden a desarrollarse con el tiempo cálculos supragingivales. Esto es debido principalmente a que en esos puntos se localiza la salida del conducto excretor de glándulas salivales cuyo fluido presenta una alta concentración de calcio y fosfatos que mineralizan a la biopelícula allí formada. Metabolismo de azúcares y producción de ácidos Los estreptococos son los organismos más importantes en términos de producción de ácidos. Los azúcares captados serán fermentados generando distintos tipos de ácidos orgánicos: láctico principalmente, acético, butírico, fórmico y propiónico. Estos ácidos serán responsables del descenso del pH y la consecuente desmineralización del esmalte. Figura 9: Oxidación aeróbica y anaeróbica de la glucosa Mecanismos de captación de azúcares Estos microorganismos pueden captar azúcares del medio por dos mecanismos: 1) de alta afinidad 2) de baja afinidad Estos mecanismos operan en situaciones diferentes pero son ambos imprescindibles para el metabolismo bacteriano. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 13 1) De alta afinidad En condiciones de ausencia de alimento o muy baja concentración de azúcares en la biopelícula y por lo tanto a pH neutro, opera el sistema de la fosfotransferasa. Este es un sistema de transporte activo de azúcares presente en muchas membranas bacterianas. Constituye el paso limitante en la producción de energía cuando el estreptococo se desarrolla a bajas concentraciones extracelulares de azúcares. Es un sistema altamente específico, presenta alta afinidad para azúcares y cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el fosfoenolpiruvato al azúcar que es entonces transportado al interior de la célula. El azúcar fosforilado será utilizado como sustrato para la glucólisis generando dos moles de fosfoenolpiruvato, uno de los cuales será usado para fosforilar la próxima molécula de azúcar que ingrese y el otro se usará para la producción de ATP. Figura 10: Mecanismo de alta afinidad o sistema de la fosfotransferasa. Este sistema de alta afinidad se satura a concentraciones relativamente bajas de azúcares pero existe un mecanismo alternativo para la captación de los mismos que le permite al microorganismo sobrevivir en estas condiciones. 2) De baja afinidad A medida que aumenta la concentración extracelular de azúcares el sistema de la fosfotransferasa se va inhibiendo gradualmente, al mismo tiempo se va activando el sistema de baja afinidad. Como vemos en la figura 9, en el entorno hay alta concentración de azúcares que serán metabolizados por los microorganismos generando ácido láctico principalmente, que al pH intracelular se encuentra ionizado en forma de lactato que difunde al líquido extracelular. Para Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 14 evitar el descenso del pH intracelular que inhibiría a la vía glucolítica los protones son expulsados en intercambio con iones K+ por la actividad de una ATPasa ligada a la membrana bacteriana. Se genera un gradiente de protones y por consiguiente una fuerza protomotriz a través de la membrana celular. Esto favorece el transporte del azúcar hacia el interior en simporte con H+. Este sistema resulta muy activo en el Streptococcus mutans, aún a pH 5,5, el cual es desfavorable para otras bacterias de modo que le permite ser dominante en la biopelícula bacteriana. Sistema dependiente de la fuerza protomotriz Sistema del fosfoenolpiruvato Figura 11: Mecanismo de baja afinidad. Metabolismo de los azúcares incorporados Los estreptococos no contienen las enzimas del ciclo de Krebs ni las de la cadena respiratoria, requieren entonces de la glucólisis para la obtención de energía. El destino final del piruvato depende de que la disponibilidad de azúcares sea alta o baja: Cuando la concentración de azúcar disponible es alta la enzima lácticodeshidrogenasa (LDH) es activada alostéricamente por fructosa-1,6 bisfosfato y gliceraldehído-3 fosfato que son intermediarios de la vía glucolítica. Así se favorece la formación de lactato como principal producto. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 15 Figura 12: Metabolismo del piruvato en alta disponibilidad de azúcares. Cuando la concentración de azúcar disponible es baja, la vía alternativa es la catalizada por la enzima piruvato formiato liasa (PFL). Esta enzima es inhibida por altas concentraciones de gliceraldehído-3 fosfato de modo que sólo estará activada cuando este intermediario de la glucólisis se encuentre en bajas concentraciones. Esta vía presenta una ventaja para las condiciones desfavorables que debe afrontar la bacteria ya que genera una molécula extra de ATP a partir del intermediario acetil~ fosfato por cada molécula de glucosa metabolizada. Los ácidos producidos por estas vías son transportados fuera de la célula y se acumulan en el medio externo. Esta acumulación externa retardaría cada vez más la secreción del lactato intracelular causando una gradual acidificación del citoplasma bacteriano inhibiendo la glucólisis. Figura 13: Metabolismo del piruvato en baja disponibilidad de azúcares Sin embargo esto no ocurre porque otras bacterias como las del género Veillonella utilizan el ácido láctico como sustrato removiendo de este modo un producto perjudicial para el estreptococo. La Veillonella metaboliza el lactato de la siguiente forma: lactato + H2O acetato + CO2 + 2 H2 Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 16 lactato + H2 propionato + H2O Los ácidos propiónico y acético son más débiles que el láctico y actúan como bufferes elevando el pH del medio. En resumen, podemos decir que: El metabolismo bacteriano produce cambios en el pH del biofilm, los cuales en un biofilm en salud están sujetos a factores de control que se resisten a dichos cambios. Por otra parte, en un biofilm cariogénico, con poco acceso de saliva, los cambios de pH no podrán ser neutralizados tan fácilmente por lo cual pueden causar alteraciones en la solubilidad de los fosfatos de calcio produciendo cambios clínicos en la superficie del esmalte. ¿CÓMO ES EL MECANISMO BIOQUIMICO INVOLUCRADO EN EL DESARROLLO DE UNA CARIES DENTAL? La caries dental causa una reversión de los procesos fisicoquímicos involucrados en la maduración de los tejidos duros dentales. Una reversión similar se produce en la enfermedad periodontal, donde hay pérdida del tejido alveolar que sostiene al diente. Ambas condiciones son el resultado de una persistente acumulación de biofilm de placa bacteriana. Los fosfatos de calcio existen en una variedad de formas y fases. El pH regula la naturaleza de la fase sólida y sus propiedades. En el hueso, el pH se mantiene entre 6.5 y 75, y la actividad celular es capaz de controlar el intercambio de calcio y fosfato entre la fase sólida y los fluidos tisulares. En cambio, en el biofilm, como resultado de la actividad metabólica de los microorganismos, el pH varía entre 4.5 y 8.5. Cuando el pH baja, la hidroxiapatita (HA) se convierte en una sal más soluble con una relación calcio/fosfato menor. Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H+ 6CaHPO4 + 2H2O + 4Ca2+ Aunque a pH medianamente ácido el fosfato dicálcico (CaHPO4) es la más estable de estas sales, gradualmente se disocia en sus iones constitutivos que se pierden en saliva. CaHPO4 + H+ Ca2+ + H2PO4- Un factor crítico en la solubilización es el área superficial expuesta. El fosfato dicálcico forma una cubierta protectora para la HA que se encuentra debajo, dado que es removida lentamente, y la velocidad depende de la concentración de los iones de calcio y fosfato a la que Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 17 está expuesta la superficie del diente. En la medida en que el ácido es neutralizado a través de esta reacción con la HA, el pH se incrementa y las condiciones de equilibrio se restablecen. Como la HA es la forma más estable a pH neutro, el proceso tiende a revertirse; es decir, el fosfato dicálcico expuesto a soluciones cada vez más alcalinas se convierte en una sal con una relación calcio/fosfato mayor. 10CaHPO4 + 8OH- Ca10(PO4)6(OH)2 + 4HPO42- + 6H2O Sin embrago, la estructura de la HA hace improbable que esta reacción ocurra directamente. Se piensa que el fosfato dicálcico puede sufrir reorientación molecular para formar fosfato de calcio amorfo no cristalino que actúa como un intermediario en el proceso. La remineralización es favorecida por la acción catalítica de los iones fluoruros. Como en la mineralización normal el proceso entero es probablemente dirigido y controlado por la matriz orgánica, no es sorprendente que la solubilización y la remineralización no presente la estructura ordenada del esmalte original. Luego de frecuentes y prolongadas exposiciones al ataque ácido, el proceso ya no es reversible y gradualmente se produce la pérdida permanente de calcio y fosfato a partir del esmalte, en particular en las regiones más solubles ricas en magnesio y carbonato. Una zona de descalcificación se forma inmediatamente debajo de la superficie del esmalte, clínicamente conocida como “mancha blanca”. MANCHA BLANCA Zona de reprecipitación Biofilm Biofilm Esmalte Esmalte (a) (b) Figura 14: Formación de la mancha blanca En esta figura se esquematiza el intercambio iónico entre la superficie del esmalte y el fluido de la placa que produce una superficie altamente sustituida (a) y una incipiente lesión cariosa (b), donde el ataque ácido severo sobre la superficie del esmalte produce una subsuperficie descalcificada sobre una superficie externa relativamente densa debido a la reprecipitación y a la migración neta de iones fuera del esmalte. Eventualmente, la superficie irregular y permeable se rompe y las bacterias invaden el lugar y se forma más placa dentro de la cavidad, la cual bajo Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 18 condiciones de un sistema cerrado causa un ataque ácido más severo y finalmente la destrucción del esmalte. CONCLUSION: La cariogenicidad va a depender de: Tipo de Hidrato de Carbono en la dieta Tipo de bacteria Tipo de polisacárido producido Frecuencia y oportunidad de exposición al azúcar Localización del biofilm Todo esto en función del tiempo. Cátedra de Bioquímica General y Bucal –FOUBA- 19
