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Se ha diagnosticado la presencia de la bacteria de cuarentena
C.flaccumfaciens pv. flaccumfaciens
La detección de tres diferentes agentes causales en el síndrome descrito
manifiesta la complejidad del mismo
AGRADECIMIENTOS
M.J. Zanón ha desarrollado su trabajo gracias al apoyo de la Universidad Politécnica
de Valencia en su programa de formación de personal investigador.
BIBLIOGRAFÍA
González A., C. Mendoza, J.C. Tello (2004). Microorganismos patógenos transmitidos
por semilla tipo granja Asturiana. Saneamiento de semilla. Serida/KRK; Oviedo,
168 pp.
González, A.J., J.C. Tello, M. De Cara (2005a). First report of Erwinia persicina from
Phaseolus vulgaris in Spain. Plant Disease 89, 109.
González, A.J., J.C. Tello, M.R. Rocío (2005b): Bacterial wilt of beans (Phaseolus
vulgaris) caused by Curtobacterium flaccumfaciens in Southeastern Spain.
Plant Disease 89, 1361.
MAPA (2005). Resumen de los avances de Superficies y Producciones agrícolas
<http://www.mapya.es> [Consulta: 12 Junio 2006]
Segundo, E., G. Martín, I.M. Cuadrado, D. Janssen (2004). A new yellowing disease in
Phaseolus vulgaris associated with a whitefly-transmitted virus. Plant Pathology
53, 517.
Smith, I.M., J. Dunez, R.A. Lelliott, D.H. Phillips, J.A. Archer (1992). Manual de
enfermedades de las plantas. Mundi-Prensa; Madrid, 671 pp.
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Figura 7. Infecciones mixtas de BnYDV y E. persicina
Figura 8. Muestras de judía con resultado positivo a la presencia de C. flaccumfaciens
pv. flaccumfaciens
CONCLUSIONES
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La sintomatología que presentan los cultivos afectados sirven para catalogar la
enfermedad como de complejo diagnóstico.
Los amarilleos internerviales que avanzan quedando los nervios en verde se
corresponden con la presencia del virus BnYDV
Los amarilleos interneviales con nervios en verde oscuro y en un último estado
coloraciones amarillentas con zonas necrosadas se corresponden con la
presencia de la bacteria E. persicina
Se ha detectado la presencia en muestras de sólo el virus BnYDV, de sólo la
bacteria E. pesicina o de ambos en infecciones mixtas
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Figura 5. Vaina de judía con resultado positivo a la presencia de E. persicina
Figura 6. Muestras de judía con resultado positivo a la presencia de BnYDV
En la Figura 7 se recogen muestras que presentaron infecciones mixtas de modo que
una vez presentes los dos agentes, las hojas de judía afectadas evolucionan hasta
llegar a un estado de necrosis que abarca la totalidad del limbo foliar.
Los síntomas que se corresponden con la presencia de C. flaccumfaciens pv.
flaccumfaciens coinciden con los descritos por González y colaboradores (2005)
apareciendo en hojas manchas doradas y necrosis. En la Figura 8 se observan
muestras con resultado positivo a la presencia de esta bacteria.
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Diagnóstico de E. persicina y C. flaccumfaciens pv. flaccumaciens
El diagnóstico de ambas bacterias se realizó mediante la técnica serológica DASELISA (“Double Antibody Sandwich- Enzime Linked Inmunosorent Assay”) utilizando,
en ambos casos, antisueros específicamente obtenidos por el personal del grupo de
Virología de la Universidad Politécnica de Valencia, comprobándose la eficacia de los
antisueros obtenidos por técnica PCR (“Polimerase Chain Reaction” o Reacción en
Cadena de la Polimerasa) y posterior secuenciación de la banda obtenida.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este estudio se han analizado un total de 303 muestras de judía identificándose
hasta la fecha, tres agentes implicados en el complejo etiológico que desarrolla el
síndrome de la enfermedad: en el 50,5% de las muestras analizadas se detectó el
virus BnYDV, en el 7% la bacteria E. persicina, en el 3,3% la bacteria C.
flaccumfaciens pv. flaccumfaciens y en el 8,25% infecciones mixtas de BnYDV y E.
persicina.
En función de los resultados obtenidos y estableciendo una correlación visual entre
síntoma observado y resultado del diagnóstico, se puede concluir que la presencia de
E. persicina en hojas de judía se caracteriza por un amarilleo internervial que va
avanzando quedando sólo los nervios verdes y el resto del limbo adquiere una
coloración amarillenta con zonas necrosadas. Aparecen manchas cloróticas y
necróticas que van avanzando quedando, al final, la hoja totalmente afectada con una
coloración marrón (Figura 4). Esta sintomatología puede presentar algunas variaciones
dependiendo de la variedad de judía afectada.
Figura 4. Muestras de judía con resultado positivo a la presencia de E. persicina
En vainas de judía, la presencia de la bacteria provoca la aparición de manchas
acuosas y el grano queda muy marcado además, la vaina se curva y toma un típico
aspecto de anzuelo (Figura 5).
Los síntomas que se corresponden con la presencia del virus se caracterizan,
principalmente, con amarilleos internerviales que avanzan quedando finalmente los
nervios verdes. En la Figura 6 se observan muestras con resultado positivo
únicamente a la presencia del virus.
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Son varios los posibles agentes causales que se barajan como responsables de la
enfermedad. Así, Segundo y colaboradores (2004) relacionan esta nueva enfermedad
de amarilleo en judía con un nuevo crinivirus transmitido por la mosca blanca Bemisia
tabaci y lo hacen responsable de los daños ocasionados en España en los cultivos
durante el otoño de 2003 proponiendo el nombre de “Bean yellow disorder virus”
(BnYDV, Virus del Desorden Amarillo de la Judía) siendo este el primer informe sobre
amarilleos en judías provocados por un virus transmitido por B. tabaci.
Paralelamente, González y colaboradores (2005a) relacionan la aparición de graves
daños en el cultivo de judía en España desde noviembre de 2003 con la presencia de
la bacteria Erwinia persicina Hao et al. publicando, en enero de 2005, el primer informe
de la presencia de E. persicina en España en dicho cultivo. Posteriormente, también
se determinó en plantas de judía de las mismas zona afectadas, la presencia de la
bacteria Curtobacterium flaccumfaciens pv flaccumfaciens (Hedges) Dowson
(González y col., 2005b) adquiriendo una gran importancia al incluirse España, para
esta bacteria, como zona protegida en lo que concierne a la producción de semillas.
Debido a la importancia del cultivo en nuestro país y dada la complejidad etiológica
presentada por esta enfermedad este trabajo supone una primera gradación de la
implicación de los agentes patógenos identificados así como una primera
caracterización de síntomas resultando de gran importancia, también a nivel ecológico,
en lo que afecta la aparición de una nueva problemática a la producción tanto a nivel
de consumo humano como en el empleo de los restos de cosecha como ración de
volumen en la alimentación del ganado ovino y caprino de la zona.
MATERIAL Y MÉTODOS
Toma de muestras
Se realizó una prospección que engloba las áreas de judía afectadas del sureste
español de aproximadamente 100 ha, analizándose más del 10% de la superficie
cultivada.
Diagnóstico BnYDV
Se comprobó la presencia del virus en todas las muestras mediante la técnica RT-PCR
(transcripción inversa de la Reacción en Cadena de la Polimerasa) con los cebadores
específicos del virus (Segundo et al., 2004). Para la extracción de ARN se empleó 0.1g
de tejido fresco de hojas con síntomas. El ARN total de estas muestras fue extraído
utilizando el reactivo comercial RNAwiz (Ambion) siguiendo las instrucciones
recomendadas por la casa comercial. El ARN total se resuspendió en 40µl de H2O
Depc (0,1-0,5 µg/ µl). Para la amplificación por RT-PCR se empleó el Kit One Step RTPCR System (Invitrogen) con dichos cebadores específicos. La desnaturalización
inicial de los ARN totales (1:50 en H2O Depc) se realizó a 65 ºC durante 5 minutos. La
RT-PCR se llevó a cabo con 5µl del RNA desnaturalizado de cada una de las
muestras y 20µl de la mezcla para RT-PCR que se añadió a cada uno de los tubos. El
primer paso de la transcripción reversa se hizo a 50 ºC durante 30 minutos seguido de
un paso de desnaturalización a 94 ºC durante 2 minutos y 35 ciclos de 94 ºC-30
segundos, 50 ºC-30 segundos y 72 ºC-30 segundos finalizando con un paso de
elongación a 72 ºC durante 10 minutos. La RT-PCR se realizó en un termociclador
Eppendorf Mastercycler Personal. Los productos obtenidos en la PCR fueron
analizados mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1,5% en tampón
TBE 0,5x, teñidos en un baño de bromuro de etidio (0,5 µg/ ml) durante 15 minutos y
visualizados en un transiluminador de luz UV. Para estimar el tamaño de los
fragmentos obtenidos se compararon con un marcador de ADN de 100pb (MBI
Fermentas).
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Desde el año 2003 ha aparecido un nuevo síndrome de etiología compleja afectando
al cultivo de judía en el sureste español (Almería, Granada y Málaga) donde
plantaciones enteras se han visto dañadas. Actualmente la presencia de la
enfermedad continúa y desde su aparición las zonas dedicadas al cultivo de judías se
han reducido paulatinamente. La sintomatología que se viene observando resulta
totalmente anómala y se caracteriza por un amarilleo internervial, en un principio
suave, que va evolucionando hacia la aparición de manchas cloróticas y necróticas en
las hojas. En un último estado las hojas adquieren tonalidades marrones y los nervios
quedan verdes. Las plantas presentan poca masa foliar y un pobre desarrollo que
puede llevar a la muerte de la planta (Figura 1). En vainas se observa la aparición de
manchas acuosas y el grano marcado tomando, además una típica forma de anzuelo.
La evolución de la enfermedad se puede observar en la Figura 2.
Figura 1. Plantas de judía afectadas
1
2
3
4
Figura 2. Evolución de síntomas en hojas de judía (1, 2 y 3) y síntomas
observados en vaina (4)
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AMARILLEO NECRÓTICO DE LA JUDÍA: UNA ENFERMEDAD
PREOCUPANTE A DIAGNÓSTICO
M. J. Zanón*, M.I. Font*, M. de Cara**, D. Janssen*** A. González****, J. Tello** y C.
Jordá*
*
Instituto Agroforestal Mediterráneo, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de
Vera s/n 46022, Valencia. E-mail: mjordag@eaf.upv.es
**
Departamento de Producción Vegetal, Escuela Politécnica Superior, Universidad de
Almería, 04120, Almería. E-mail: jtello@ual.es
***
Centro de Investigación Agraria (CIFA), Autovía del Mediterráneo salida 420, 04745La Mojonera, Almería. E-mail: dirkjanssen@telefonica.net
****
Laboratorio de Fitopatología, SERIDA, Carretera de Oviedo, s/n 33300, Villaviciosa,
Asturias. E-mail: anagf@serida.org
RESUMEN
En noviembre de 2003 hace su aparición en el sureste español una nueva enfermedad
afectando al cultivo de judía (Phaseolus vulgaris L.) mostrando una sintomatología
hasta entonces desconocida caracterizada por amarilleos internerviales en hojas que
evolucionan a manchas cloróticas definidas y zonas necrosadas adquiriendo en un
último estado tonalidades marrones, manteniendo los nervios verdes. Las plantas
presentan poca masa foliar y un pobre desarrollo que puede llevarlas a la muerte. En
vainas se observan manchas acuosas, el grano marcado y forma de “gancho”. Las
pérdidas ocasionadas se han acercado al 50% en el 2006. Se ha realizado una
prospección en las áreas productoras de judía afectadas de aproximadamente 100 ha,
analizádose más del 10% de la superficie cultivada. Se han estudiado un total de 303
muestras de judía, identificandose hasta la fecha tres agentes implicados: en el 50,5%
de muestras analizadas se detectó el Bean yellow disorder virus, BnYDV, crinivirus
identificado recientemente y transmitido por Bemisia tabaci, en el 7,0% la bacteria
Erwinia persicina, en el 3,3% la bacteria Curtobacterium flaccumfaciens pv
flaccumfaciens (Hedges) Dowson y en el 8,25% infecciones mixtas de BnYDV y E.
persicina. La detección de tres diferentes agentes causales en el síndrome descrito
manifiesta su complejidad.
Palabras clave: BnYDV, Curtobacteruim flaccumfaciens, Erwinia persicina, Phaseolus
vulgaris
INTRODUCCIÓN
La judía, Phaseolus vulgaris L., pertenece a la familia Fabaceae subespecie
Papilonaceae. Su importancia radica en sus grandes posibilidades para la
alimentación humana debido a su doble aprovechamiento (de grano y vaina) así como
por su aporte proteico. En España, la superficie dedicada al cultivo de judías verdes se
cifró, de manera provisional, en 17.700 ha en 2004 con una producción de 226.000 t
acercándose el valor económico a los 294 millones de euros dedicándose también
una pequeña parte cercana a las 11.000 ha a la obtención de judía seca con una
producción de 19.000 t y un rendimiento económico superior a los 23 millones de
euros (MAPA, 2005).
Andalucía es la comunidad con una mayor superficie dedicada al cultivo de judías
verdes, concentrándose la producción protegida de judías para el consumo en fresco
en tres provincias: Almería, Granada y Málaga.
El principal problema en el cultivo de las leguminosas de grano en general, y de las
judías en particular, es su elevada sensibilidad a enfermedades incluyendo tanto
víricas como bacterianas (Smith et al., 1992; González et al., 2004).
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