85 SÍNTESIS DE HISTONAS EN Trypanosoma cruzi VALERIA SABAJ y NORBEL GALANTI Laboratorio de Biología Molecular, Departamento de Biología Celular y Genética. Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Las historias constituyen el ejemplo clásico de proteínas cuya síntesis se efectúa en forma acoplada a la replicación del DNA. Con el paso del tiempo, sin embargo, gracias a resultados obtenidos en tejidos en reposo proliferativo en que se determinó la existencia de síntesis de ciertas variantes de histonas, se ha dividido a los genes de histonas de acuerdo a su capacidad de expresión en: a) variantes replicativas (aquellas cuya expresión se encuentran acoplada a la replicación del DNA), y b) variantes de reemplazo (aquellas cuya expresión es independiente de la replicación del DNA). El Trypanosoma cnizi, agente productor de la enfermedad de Chagas, es un eucarionte muy antiguo. Su biología, como es lógico suponer, difiere en aspectos sustanciales de la de eucariontes superiores. Algunas características destacables son: la existencia de transplicing, mecanismo mediante el cual una región 5' común se une a diferentes mensajeros de genes nucleares; los genes mitocrondriales están sujetos a un mecanismo de edición del mensaje, capaz de modificar hasta en un 50% el transcrito original; durante la división celular, la envoltura nuclear permanece intacta; y por último, la cromatina de T. cruzi no condensa a cromosomas durante la mitósis, más aún, en esta etapa parece aumentar su decondensación. Las histonas de T. cruzi, por otra parte, también presentan características peculiares; las secuencias aminoacídicas de estas proteínas difieren sustancialmente de la de sus homologas en eucariontes superiores. Es así como la histona H4, prototipo de proteína conservada evolutivamente, muestra una divergencia de un 50% en su extremo aminoterminal. Dados estos antecedentes sobre la biología de T. cruzi, en especial de su cromatina, y la escasa información que existe sobre síntesis de histonas en eucariontes primitivos, resulta de interés el estudio de la síntesis de estas proteínas cromosomales en relación a la replicación del DNA en T. cruzi. En primer lugar, se comparó la síntesis de histonas y la de DNA en células en activa proliferación (5 días de cultivo) y en células en bajo grado de proliferación (14 días de cultivo). Para esto, se incubaron las células en presencia de 3 H - tímida, en el caso de la medición de replicación de 3 DNA y de H -usina en el caso de la medición de síntesis de histonas. Se trabajó con células permeabilizadas mediante shock hipotónico, dado el pobre ingreso de aminoácidos en células intactas. Las células incubadas con timidina se procesaron para la medición de radiactividad en DNA, mientras que en las incubadas con Usina, se realizó extracción de histonas y se midió la radiactividad total en ellas. Los resultados muestran una mayor incorporación tanto de tímida (10 veces) como de lisina (4 veces) en células de 5 días de cultivo que en las de 14 días. Al trabajar con un cultivo asincrónico, sin embargo, no es posible aseverar la existencia de un total acoplamiento entre ambos procesos. Por el motivo anterior, se determinó tanto la síntesis de histonas como la de DNA en células sincronizadas con hidroxiurea (HU). Luego de liberado el bloqueo con HU, se tomaron alícuotas de células a distintos tiempos (0,6,12 y 24 horas) y se midió en ellas la incorporación de 3 3 H timidina en DNA y de H - lisina en histonas. Los resultados mostraron a las O horas (24 horas en presencia de HU) una pobre incorporación de timidina en DNA y una baja incorporación de lisina en histonas. A las 6 horas, la replicación de DNA aumenta bruscamente, así como la síntesis de histonas. A las 12 horas ambas actividades permanecen altas, y a las 24 horas, disminuyen notablemente. Un claro acoplamiento se observó, entonces, entre ambos procesos. Interesante de estudiar resultó el hecho que a las O horas, cuando la incorporación de timidina en DNA era casi nula, se observó cierto nivel de incorporación de lisina en histonas, para esto, se separó a las histonas medíante electroforesis y se realizó una fluorografía del gel. Con esto se puso en evidencia una activa síntesis de histona H1 a las 0 horas (en ausencia de replicación de DNA), y la ausencia de síntesis de histonas del núcleo nucleosomal a este tiem- 86 po; a las 6 horas, se observó un aumento de la síntesis de histona H1 y el comienzo de la de histonas nucleosomales; a las 12 horas, la síntesis de histonas H1 y nucleosomales se encontraba activa; a las 24 horas, la síntesis de histona H1 disminuyó en forma importante y la de histonas nucleosomales desapareció. Por último, se estudió la relación entre replicación del DNA y síntesis de histonas en tripomastigotes, la forma naturalmente no replicativa del parásito. En estas células no se detectó replicación del DNA, como era de esperar, como tampoco síntesis de histonas. Resultado en conflicto con el obtenido en células sincronizadas, que pudiera pensarse se debe al hecho de utilizar un agente extraño a la célula (hidroxiurea). Sin embargo, hay que recordar que los tripomastigotes representan una forma celular diferenciada, lo que implica la expresión de todo un conjunto diferente de genes. A nivel de histonas, podría implicar la pérdida de la expresión de genes de histona H, independientes de la replicación del DNA. En resumen, hemos establecido la existencia de dos poblaciones diferentes de histonas; en primer lugar, una fracción de histona H1 cuya síntesis es independiente de la replicación de DNA y en segundo lugar, otra fracción de H1 y la totalidad de las histonas del núcleo nucleosomal, cuya síntesis se encuentra acoplada a la replicación del DNA. Mostramos también, una diferencia entre epimastigotes sincronizados y tripomastigotes en cuanto a acoplamiento entre síntesis de histonas y replicación de DNA, careciendo estos últimos de la fracción de histona H1 cuya síntesis no es acoplada a la replicación de DNA. Sugerimos que esta diferencia está dada por la ausencia de expresión de genes de H1 independientes de la replicación de DNA. Financiado por SAREC y Fondecyt-Chile.