Tecnología del ADN recombinante y sus aplicaciones en la

Tecnología del ADN recombinante y sus aplicaciones en la Medicina.
Objetivos de aprendizaje
-Conocer y familiarizarse con los principios básicos de la biología molecular.
-Aprender fundamentos de las técnicas de rutina de biología molecular.
-Estudiar la secuenciación de ADN y su aplicación en el diagnóstico clínico.
-Comprender la técnica de PCR conceptualmente y aplicaciones de la misma.
-Conocer y comprender algunas aplicaciones médicas de la investigación de genes, estudio de
enfermedades hereditarias, huella genética, proteínas recombinantes, animales transgénicos,
terapia génica.
Los instrumentos básicos de la investigación de genes.
En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida como ingeniería
genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha revolucionado la biología. El campo de la
salud es uno de los más beneficiados con el desarrollo de esta tecnología. Las investigaciones que se
realizan en este área están enfocadas al diagnóstico oportuno de enfermedades, así como su posible
tratamiento a través de la terapia con moléculas recombinantes e introducción de genes. Además, la
manipulación de genes proporcionará en el futuro una herramienta fundamental para la eliminación de
enfermedades mortales para el hombre. Por estas razones resulta útil que el médico esté familiarizado con
conceptos básicos sobre biología molecular, su aplicación en la investigación biomédica, y en especial con
sus posibles aplicaciones clínicas, conceptos estos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la
literatura biomédica, tanto básica como clínica.
El rápido progreso de la biotecnología y, de hecho, su propia existencia, es el resultado de utilizar
unas pocas técnicas que se describen a continuación.
Enzimas de restricción
El descubrimiento de las enzimas de restricción ha permitido a los investigadores manipular segmentos
específicos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta molécula de gran tamaño.
Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, reconocen secuencias de bases
específicas en el ADN doble hélice y cortan en lugares concretos ambas hebras del dúplex que contienen las
secuencias reconocidas. Las enzimas de restricción fueron obtenidas a partir de una gran variedad de
procariontes. Su función biológica en estos organismos consiste en eliminar mediante su actividad de
endonucleasa ADN foráneo que pudiera ingresar en una bacteria. El ADN del propio microorganismo no se
destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restricción se encuentran metilados.
Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en el ADN de entre 4 a 8 pares de
bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de la región reconocida. Una característica notable
1
de estos sitios de corte es que casi siempre son palíndromos, o una repetición invertida, y los puntos de corte
están dispuestos simétricamente (Figura 1).
Figura 1: Los puntos de corte están indicados por las flechas. El corte con Bam HI (izquierda) produce extremos simple
cadena o “adhesivos” y el corte con AluI (derecha) produce extremos doble cadena o “romos”. En cada hebra, la enzima
hidroliza el enlace fosfodiéster en el lado 3’ del eje de simetría.
Se han purificado y caracterizado más de 100 enzimas de restricción. Se nombran con una
abreviatura de tres letras que se refiere al organismo hospedador, por ej. Eco de Escherichia coli, Hin de
Haemophilus influenzae, Hae de Haemophilus aegyptius, seguida, en su caso, de una indicación de la cepa
en cuestión y de un número romano (en el caso que se haya identificado más de una enzima de restricción de
la misma cepa). Los cortes de estas enzimas pueden ocurrir en el centro mismo de la secuencia dejando lo
que se conoce como extremos “romos” con ADN doble cadena, o extremos “adhesivos” si el corte ocurre
corrido en una hebra y en la otra del ADN, dejando en este caso una porción de hebra simple cadena. Las
enzimas de restricción se utilizan para cortar moléculas de ADN y proporcionar fragmentos específicos que se
pueden analizar y manipular con más facilidad que la molécula original. Además, la cantidad de los
fragmentos de ADN obtenidos luego del corte con una enzima de restricción dependerá de la frecuencia de
corte de dicha enzima ya que si su secuencia de reconocimiento se encuentra muchas veces repetida en el
ADN, se generarán muchos fragmentos de restricción de diferentes tamaños. Es importante destacar que a
medida que el sitio de restricción de una enzima tenga mayor número de pares de bases, la frecuencia de
corte será menor, ya que es menos probable que se combinen dichas pares de bases para formar la
secuencia de reconocimiento y encontrarla en el ADN.
Técnicas de transferencia o “blotting”
Las técnicas Southern blot y Northern blot se utilizan para separar y caracterizar ADN y ARN
respectivamente. La técnica de Southern blot fue desarrollada por Edwin Southern para separar ADN y por
analogía la separación de ARN se denominó Northern blot y la transferencia de proteínas se denominó
2
Western blot.
En todas estas técnicas se realiza primero una electroforesis en gel con el objetivo de separar las
moléculas por su tamaño y carga, posteriormente la transferencia a una membrana para finalmente identificar
un fragmento específico de ADN, una molécula de ARN particular o una proteína de interés mediante la unión
específica de otra molécula de ácido nucleico (sonda) para ADN o ARN o de un anticuerpo en el caso de las
proteínas.
La electroforesis en gel es una técnica en la que se aplica un campo eléctrico para separar moléculas
en base a su tamaño y a su carga como ya fue explicado en la clase de separación de proteínas. Debido a
que los ácidos nucleicos contienen grupos fosfatos cargados negativamente, migran hacia el electrodo
positivo (ánodo) en un campo eléctrico. El ADN cortado previamente por una o más enzimas de restricción o
el ARN es sembrado en un gel y al aplicarse el campo eléctrico los fragmentos se separan por tamaño. Luego
pueden ser visualizados, detectándose hasta pequeñas diferencias de peso molecular. Se utilizan dos tipos
de geles: de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos miles de pares de bases y geles de
agarosa, más porosos, para separar mezclas de fragmentos de hasta 20.000 bases (20 kilobases (kb)),
utilizados para Southern blot. Una característica importante de estos polímeros es su alta capacidad de
resolución, por ejemplo utilizando geles de poliacrilamida se pueden distinguir entre cientos de fragmentos de
ADN que difieren en longitud por un único nucleótido (se utilizan para secuenciar ADN) mientras que los geles
de agarosa sirven para separar fragmentos con mayores diferencias de tamaño entre sí. Luego de la corrida
electroforética, los fragmentos de ácidos nucleicos no se visualizan directamente sino que debe teñirse el gel
con un agente que se intercala entre las bases de la doble hélice y que fluoresce al ser irradiado con luz
ultravioleta (como el bromuro de etidio. De esta manera se observan los fragmentos de ADN de una intensa
fluorescencia anaranjada cuando se expone el gel a luz ultravioleta. (Figura 2).
3
Figura 2: Electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa, y tinción con Bromuro de Etidio de los fragmentos
separados.
La transferencia consiste en el pasaje de los ácidos nucleicos desde el gel donde se han separado por
electroforesis hacia un papel o membrana de nylon. Esta transferencia ocurre por capilaridad donde el
movimiento del buffer que embebe el gel transfiere las moléculas de ácido nucleico a la membrana. Es
importante destacar que la posición de los fragmentos de ADN o ARN en el gel se conserva en la membrana.
En el caso de Southern blot, las membranas deben ser luego sometidas a condiciones alcalinas para
desnaturalizar las dos hebras y dejar al ADN como simple cadena. En el caso del Northern blot no es
necesario este paso ya que el ARN es simple cadena.
Un paso de gran importancia en estas técnicas, al igual que en la técnica de Western blot, es el
bloqueo previo de la membrana de manera de evitar hibridaciones inespecíficas producto de la gran afinidad
de la membrana por los ácidos nucleicos. Con este fin, en general se utiliza ADN de esperma de salmón o
arenque.
¿Cómo identificar específicamente un fragmento de interés en la membrana? Mediante el uso de sondas
específicas.
SONDAS: Una sonda es un fragmento de tamaño variable (de pocos nucleótidos como 50 pb hasta 2 kb) que
puede ser ADN o ARN que se une específicamente por complementariedad de bases a la secuencia que se
encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. Este evento de unión por bases
4
complementarias se conoce como hibridación. Se dice que la sonda “hibrida” con el fragmento específico.
Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna “marca” para que pueda detectarse la unión y
por ende, identificar la secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas
para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen nucleótidos comerciales
marcados con fósforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes técnicas le otorga la
capacidad de ser detectada mediante la exposición de la membrana a una placa autorradiográfica (como la
de rayos X). En la placa se observan específicamente el o los fragmentos donde hibridó la sonda ya que la
radiación emitida en ese sitio vela la placa autorradiográfica. Un concepto importante es que la sonda no tiene
que ser necesariamente del mismo tamaño del fragmento de interés, es suficiente que la sonda reconozca
específicamente una porción del fragmento de interés. Luego que la sonda ha hibridado con el fragmento de
interés, debe lavarse la membrana para eliminar el exceso de sonda que no se hubiera unido específicamente
y luego se visualiza la sonda por autorradiografía (Figura 3). Existen otras formas de detección de las sondas
que no son radioactivas, algunas se marcan con grupos químicos que luego se observan por fluorescencia.
Figura 3: Un fragmento de ADN o una molécula de ARN que contiene una determinada secuencia puede identificarse si
se separan por electroforesis una mezcla de fragmentos, se transfieren a nylon, y se hibridan con una sonda marcada
con 32P (fósforo radioactivo), complementaria a la secuencia que se busca. El fragmento que contiene la secuencia
buscada se visualiza después por autorradiografía. Recordar: si se realiza un Southern blot, deben separarse las dos
cadenas de ADN en un medio alcalino (NaOH) para que la sonda hibride con la secuencia complementaria a una de las
cadenas (figura modificada de Griffiths et al., 2000).
5
Blotting
Tipo de blot
Southern
Northern
Western
Analiza
ADN
ARN
Proteínas
1) Preparación de la muestra
Se corta en fragmentos
Nada
Nada
2) Separación por electroforesis
Tamaño
Tamaño
Tamaño o carga
3) Tratamiento del gel
Desnaturalizar el ADN
Nada
Nada
Por capilaridad
Campo eléctrico
Procedimiento
con álcali
4)Transferir a una membrana
5) Identificar moléculas de
interés
Por capilaridad
Sonda de RNA radioac- Sonda de RNA Anticuerpos marcados
tiva o ADN simple
radioactiva o
fluorescente o ra-
cadena
ADNsc
dioactivamente
Secuenciación de ADN
La secuenciación de ADN se realiza mediante métodos cuya finalidad es la determinación del orden
de los nucleótidos (A, C, G y T) en una molécula de ADN. La secuencia de ADN constituye la información
genética heredable del núcleo celular, los plásmidos (bacterias), la mitocondria y cloroplastos (en plantas) que
forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. Así pues, determinar la secuencia de ADN
es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales, así como en campos
aplicados, como el diagnóstico de enfermedades hereditarias y la investigación forense. El desarrollo de la
secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología.
Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano.
Los métodos de secuenciación actuales se basaron en el método de terminación de la cadena desarrollado por Sanger en el año 1977. Describiremos el método de terminación de la cadena, que es el
actualmente utilizado. Se basa en el principio de que moléculas de ADN simple cadena que difieren en
longitud en apenas un nucleótido pueden separarse unas de otras por electroforesis en gel de poliacrilamida.
Esto significa que es posible separar una familia de moléculas, en representación de todas las longitudes de
10 a 1500 nucleótidos, en una serie de bandas. El principio clave del método de Sanger es el uso de dideoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN. Estos dideoxinucleótidos terminan
la elongación de la cadena al carecer del grupo 3'-OH que se necesita para la formación del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos durante la elongación de la cadena de ADN.
El método clásico de terminación de la cadena o método de Sanger requiere una hebra molde de ADN
simple cadena, un primer de ADN, una ADN polimerasa, nucleótidos marcados radiactivamente o mediante
6
fluorescencia y nucleótidos modificados que terminan la elongación de la cadena de ADN. La muestra de
ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciación separadas que contienen los cuatro deoxinucleótidos
estándar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En cada mezcla de reacción se añade solo
uno de los cuatro didesoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). La incorporación de un dideoxinucleótido en la cadena naciente de ADN termina su extensión, lo que produce varios fragmentos de ADN de
longitud variable. Los dideoxinucleótidos se añaden en concentraciones lo suficientemente bajas como para
que se generen fragmentos de todas los posibles tamaños y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la
secuenciación.
Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados son desnaturalizados por calor y separados por tamaño (con una resolución de un solo nucleótido) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada
una de las cuatro reacciones de síntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) de acuerdo al
dideoxinucleótido añadido y se visualizan las bandas de ADN mediante autorradiografía o luz ultravioleta, y la
secuencia de ADN se puede leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel.
A
B
En la imagen A, la película de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las bandas oscuras
corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en un carril indica un
fragmento de ADN que es el resultado de una terminación de la cadena tras la incorporación de un dideoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP, o ddTTP). El nucleótido terminal puede ser identificado de acuerdo al
dideoxinucleótido que se añadió en la mezcla de reacción que dió lugar a esa banda. Las posiciones relativas
entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN como se indica.
Como se muestra en el panel B, actualmente la alternativa es el marcado de los terminadores de la
cadena, un método conocido como "secuenciación por terminador fluorescente". La mayor ventaja de este
método es que la secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción, en lugar de en cuatro reacciones como en el método del cebador marcado. En una secuenciación por terminador fluorescente se marcan
cada uno de los cuatro dideoxinucleótidos que terminan la cadena con un colorante fluorescente diferente,
7
con fluorecen a diferentes longitudes de onda. Este método es atractivo por su gran capacidad y rapidez y
actualmente es el método de referencia en la secuenciación automatizada con analizadores de secuencia
controlados por computadora
ADN producido por transcripción reversa
Los ARN mensajeros (ARNm) transcriptos en un tejido determinado pueden ser usados como molde o
templado por la enzima transcriptasa reversa, la cual produce una copia de ADN (ADNc) a partir del ARN. A
diferencia de los fragmentos de ADN clivados a partir del genoma por enzimas de restricción, el ADN
producido por la transcriptasa reversa, debido a que usa ARNm maduro como templado, no contiene intrones.
La transcriptasa reversa cataliza la síntesis en dirección 5' a 3' a partir de oligo-dT como primer o iniciador.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
TÉCNICA
En 1984, Kary Mullis ideó un ingenioso método para amplificar secuencias específicas de ADN que se
denomina Reacción en Cadena de la Polimerasa (polymerase chain reaction, PCR). Mediante esta técnica se
puede amplificar un segmento específico de ADN hasta millones de veces en pocas horas in vitro, si se
conocen las secuencias colindantes (flanqueantes) a esta secuencia blanco.
La PCR se llevará a cabo agregando a un tubo a) una solución que contenga moléculas de ADN que
contengan la secuencia a amplificar, b) oligonucleótidos (de entre 20 y 30 nucleótidos) que actuarán como
cebadores (o primers) uniéndose específicamente a la secuencias colindantes con la secuencia blanco, c) los
cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs), d) un buffer de pH en el rango de 7,4 y e) una ADN polimerasa estable
al calor. Cada ciclo de replicación consiste en tres pasos:
a) Separación de las hebras: Desnaturalización de la doble hélice de ADN. Las dos hebras de la molécula de
ADN original se separan mediante calentamiento de la solución a 95°C durante 15 segundos.
b) Hibridación de los cebadores: La solución se enfría rápidamente a una temperatura entre 50 y 60°C que
es generalmente la temperatura a la cual cada cebador se une con una hebra de ADN desapareada. Un
cebador hibrida con el extremo 3’ de la secuencia blanco en una hebra y el otro cebador hibrida con el
extremo 3’ de la secuencia en la hebra complementaria. No se formará nuevamente el ADN doble hebra
inicial porque los cebadores están presentes en exceso.
c) Síntesis de ADN: A continuación la mezcla se calienta a 72°C. La ADN polimerasa termoestable (Taq
polimerasa) que se utiliza proviene de una bacteria termófila (Thermus aquaticus) y su temperatura óptima
de acción es alrededor de 70°C. La Taq polimerasa cataliza la elongación de ambos cebadores copiando
la secuencia blanco. La Taq polimerasa puede ser activa aún a temperaturas tan extremas como 95°C
que es la temperatura del primer paso del ciclo de PCR lo cual permite que se puedan realizar hasta 35
ciclos consecutivos de calentamiento y enfriamiento, sin necesidad de reponer la polimerasa luego de este
paso. ¿Qué pasaría si se usase una ADN polimerasa humana? Todos los componentes de la PCR se
agregan por única vez al inicio de la reacción.
Estos tres pasos constituyen un ciclo de PCR y se pueden llevar a cabo repetidas y consecutivas
veces modificando únicamente la temperatura de la reacción. Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de
8
ADN, por lo que finalmente se produce un aumento de 2n de la cantidad de ADN original siendo n el
número de ciclos que se llevan a cabo. La amplificación es de un millón de veces después de 20 ciclos y
de mil millones de veces después de 30 ciclos, los cuales se pueden llevar a cabo en menos de una hora
(Figura 4).
Características importantes de la técnica
No es necesario conocer toda la secuencia a amplificar, únicamente hay que conocer las secuencias
que flanquean el fragmento de ADN interés.
La región a amplificar puede ser mucho mayor que los cebadores. Por PCR se pueden amplificar
fragmentos tan grandes como 10 kb.
No es necesario que los cebadores se ajusten perfectamente a las secuencias que flanquean el
fragmento a amplificar. El uso de cebadores derivados de un gen de secuencia conocida hace posible la
búsqueda de variaciones sobre el tema. Esta característica es muy importante porque así se han descubierto
por PCR familias de genes y relaciones evolutivas entre organismos.
La PCR puede ser muy específica en amplificar un único fragmento de interés, y no otros, debido al
rigor de la hibridación de los cebadores a temperatura muy elevada (50-60°C). Sin embargo, modificando la
temperatura y concentraciones salinas del buffer se puede controlar el rigor de la amplificación. La
temperatura y las concentraciones salinas pueden determinar la especificidad de unión de los cebadores a
sus secuencias complementarias. A altas temperaturas y altas concentraciones salinas (condiciones de alta
rigurosidad) los cebadores solamente hibridan con secuencias totalmente complementarias y se amplifica un
único fragmento; si disminuye la temperatura o las concentraciones salinas (condiciones de baja rigurosidad),
los cebadores comienzan a hibridar con secuencias que no son totalmente complementarias sino que tienen
variaciones de algunas pares de bases.
APLICACIONES
La PCR permite amplificar una secuencia que constituye menos de la millonésima parte del ADN total
de un organismo superior. Es una técnica sumamente sensible, se puede amplificar y detectar una única
molécula de ADN.
9
Figura 4: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La PCR puede aportar una información muy valiosa en medicina
♦ Detección de bacterias y virus utilizando cebadores específicos. Por ejemplo, la PCR puede descubrir la
presencia de virus latentes como los de la hepatitis B y C y el de inmunodeficiencia humano (HIV) en el
genoma de los individuos infectados que no han desarrollado respuesta inmune a dichos patógenos, por
lo cuales no puede ser detectado por ensayos con anticuerpos. La búsqueda de bacilos en muestras de
tejido puede ser muy lenta y laboriosa pero con la PCR se pueden detectar con la presencia de solo 10 de
estos microorganismos por cada millón de células humanas.
10
♦ Colaboración con la medicina forense en la identificación de personas permitiendo el reconocimiento de
cadáveres, parentescos biológicos en casos de disputa de paternidad.
♦ Establecer grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando secuencias de los HLA del donante y
receptor para determinar compatibilidades.
♦ Detección de organismos transgénicos, por ejemplo productos de agricultura como soja o maíz, para su
comercialización.
♦ Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos ya que bajo ciertas circunstancias el ADN puede
mantenerse intacto durante miles de años o incluso más tiempo.
PCR en tiempo real
La PCR cuantitativa, qPCR, Q-PCR (del inglés quantitative polymerase chain reaction) o PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una variante de la PCR utilizada para amplificar y simultáneamente
cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ADN.
La PCR cuantitativa es la metodología más moderna para el estudio de la expresión génica. Podemos
clasificar las técnicas de PCR en tiempo real según el empleo de fluorocromos o bien de sondas moleculares
dependientes de la secuencia.
En las técnicas basadas en fluorocromos se detecta la generación exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une intercalándose a la molécula doble cadena y al estar unido
produce fluorescencia. A medida que se amplifican las moléculas de ADN aumenta el número de moléculas
del fluorocromo unidas. Un ejemplo de fluorocromo que permite esta detección es el SYBR Green, que,
excitado mediante luz azul (λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522 nm). Posee la ventaja de requerir
sólo un par de cebadores para efectuar la amplificación, lo que abarata su coste; sin embargo, sólo es posible
amplificar un producto en cada reacción.
La PCR en tiempo real se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada
muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el
fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las
muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
La PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la
amplificación mediante la señal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores
de fluorescencia se expresan en forma logarítmica a fin de estudiar fácilmente la fase exponencial de amplificación (que aparece como una línea recta al representar gráficamente el logaritmo de la fluorescencia frente
al número de ciclo). Este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN
inicial.
Cuantificación y genotipado en clínica
Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patógenos concretos o a coinfecciones, y este hecho no sólo puede dificultar el diagnóstico mediante las técnicas clásicas, sino que puede
redundar en un distinto pronóstico y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la
PCR en tiempo real posibilita tanto la cuantificación como el genotipado (caracterización de la cepa) de virus
11
como el HBV (virus de la hepatitis B). El grado de infección, cuantificado como las copias de genoma viral por
unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos; por ejemplo, la probabilidad de que el virus del
herpes simple de tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios.
Esta cuantificación se realiza mediante retrotranscripción o sin ella, en el caso de que los virus se integren en
el genoma humano en algún momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano),
alguna de cuyas variantes está asociada con la aparición de cáncer de cérvix.
Clonado de ADN
La primera técnica desarrollada para amplificar ADN en cantidad es conocida como clonado. Un
fragmento de ADN obtenido a partir de un organismo (ADN foráneo) es insertado en un vector (o
transportador) compuesto de ADN, y la quimera así obtenida (ADN recombinante) es usada para transformar
células hospedadoras. A medida que la célula hospedadora se divide, además de replicar su propio ADN, ella
también replica el ADN del vector, el cual incluye el ADN foráneo. Subsecuentemente, se podrían aislar
cantidades relativamente grandes del ADN foráneo.
Si las células hospedadoras son bacterias, el primer paso en el procedimiento de clonado es insertar
el ADN foráneo dentro de un vector que pueda transportar este ADN dentro de la bacteria. Los vectores son
unidades de ADN que pueden replicarse en forma autónoma y dentro de los cuales pueden insertarse otros
fragmentos de ADN. Los vectores más comúnmente usados son plásmidos que son moléculas de ADN
circular doble cadena extracromosomal que se encuentran en bacterias en forma natural. Los plásmidos
naturales tienen la capacidad de replicarse autónomamente y únicamente dentro de la célula hospedadora
adecuada. Estos vectores poseen un tamaño pequeño que facilita su entrada a la bacteria y además,
habitualmente portan genes que le confieren al la misma resistencia a antibióticos como ampicilina.
Estos plásmidos han sido modificados mediante ingeniería genética y actualmente existen
comercialmente una gran variedad de los mismos para distintos propósitos. Los vectores de clonado poseen
una región denominada “sitio de clonado multiple” que contiene sitios de corte de distintas enzimas de
restricción que permite la inserción del ADN foráneo en esa región del plásmido.
Para inserción de un segmento de ADN foráneo a un vector de clonado, dicho segmento de ADN y el
plásmido deben ser clivados con la misma enzima de restricción. En el proceso más simple se usa una
enzima de restricción que produce extremos adhesivos tanto en el ADN foráneo como en el vector. Estas
regiones de ADN simple cadena complementarias pueden aparearse entre si. Una vez producido el
apareamiento entre las bases se pueden unir ambas moléculas covalentemente por la acción de la enzima
ADN-ligasa.
La nueva molécula de ADN producto de la unión de dos moléculas de ADN de diferente origen se
denomina ADN recombinante. Una vez obtenidas estas nuevas moléculas para lograr su amplificación, es
decir obtener un mayor número de copias, se deben introducir a una célula hospedadora. El proceso
mediante el cual se introduce un vector a una bacteria se denomina transformación. Si se introduce un vector
a una célula eucarionte este proceso es denominado transfección.
12
Figura 5: Vector plasmídico de clonado de ADN circular, con sus componentes básicos; AmpR, resistencia a ampicilina
para selección; Insert, sitio de clonado múltiple, con sitios de restricción para varias enzimas de restricción diferentes
donde se inserta el fragmento de ADN de interés; T7, promotor que reconoce la ARN polimerasa II de Escherichia coli,
EcoRI y PstI, sitios de corte para las respectivas enzimas de restricción.
MARCADO DE LOCI EN CROMOSOMAS ESPECÍFICOS
Varios métodos son útiles para asignar genes o marcadores a los cromosomas individuales, uno de
ellos es la hibridación in situ. Si el gen está clonado y está disponible, se puede utilizar para realizar una
sonda marcada para la hibridación in situ. Si los cromosomas individuales del set genómico son identificables
mediante su patrón de bandas, tamaño, relación de los brazos, o alguna otra característica citológica, puede
ser localizado el nuevo gen en un cromosoma si hibrida con el.
Las sondas más comúnmente utilizadas son radioactivas o fluorescentes. En la técnica de hibridación
in situ fluorescente (FISH; fluorescent in situ hibridization), la sonda complementaria al gen en estudio se
marca con un reactivo fluorescente y una preparación de cromosomas parcialmente desnaturalizados se
incuba con la sonda. La sonda se une al cromosoma in situ y la localización del fragmento clonado se revela
como una señal fluorescente (Figura 6).
Figura 6: Análisis de FISH de cromosomas de tres especies diferentes de plantas. Las sondas usadas eran
13
complementarias a regiones codificantes para ARN ribosomal en azul (para el 5S), en rosa (para el 18S, 5,8S y 26S) y
en verde una secuencia específica de las dos especias de arriba.
POLIMORFISMOS DEL ADN
Los polimorfismos en el genoma sirven como base para el uso de técnicas de ADN recombinante en el
diagnóstico de enfermedades. Los polimorfismos son variaciones en las secuencias de ADN. En el genoma
humano pueden encontrarse millones de diferentes polimorfismos. Los primeros en ser identificados
involucraban mutaciones puntuales, la sustitución de una base por otra pero también pueden ser deleciones e
inserciones. Algunos polimorfismos, que ocurren dentro de la región codificante de genes y otros que se
encuentran en regiones no codificantes estrechamente relacionadas a genes, están involucrados en la
etiología (causa) de enfermedades heredables.
El análisis de ADN hace posible examinar variaciones en la secuencia de ADN entre individuos y entre
especies. Se pueden realizar estos estudios a dos niveles: estudiar la variación en sitios reconocidos por
enzimas de restricción (por RFLP, técnica que está en desuso actualmente) y en un nivel más preciso,
métodos de secuenciación del ADN que permiten analizar la variación del ADN base por base. La
secuenciación es el método de elección en la actualidad para analizar regiones del ADN, zonas de genes,
regiones no codificantes, vectores etc.
Aplicaciones de las técnicas de secuenciación en el diagnóstico de enfermedades hereditarias
La Poliposis adenomatosa familiar (PAF) es una enfermedad autosómica dominante, que se
caracteriza clásicamente por el desarrollo de cientos a miles de adenomas en el colon y el recto durante
la segunda década de la vida. La PAF tiene una incidencia de 1/8,300 nacimientos, y se manifiesta por
igual entre ambos sexos. Casi todos los pacientes desarrollan cáncer colorrectal (CCR) si no se identifican y son tratados en una etapa temprana. La enfermedad es causada por mutaciones en un gen
supresor tumoral localizado en el cromosoma 5q21.
El gen APC codifica para una proteína de 2843 aminoácidos y produce un ARNm de 8,9 Kb dividido en 15 exones. La proteína APC tiene múltiples dominios que median tanto la oligomerización como
la unión a una variedad de proteínas intracelulares, las cuales tienen importantes roles en la adhesión
celular, la transducción de señales, y la activación de la transcripción. Otras características son: 1) Las
mutaciones pueden ocurrir en varias localizaciones dentro del gen APC. 2) Las dos mutaciones más
comunes son en los codones 1061 y 1309, se describe un nuevo sitio con alta probabilidad de mutaciones en la ubicación 1465. 3) Las mutaciones del APC patogénicas resultan en un codón stop prematuro
por alguno de estos mecanismos: sustitución, deleción o inserción de nucleótido.
Hoy en día, una serie de pruebas genéticas están disponibles para analizar las mutaciones en el
gen APC. El método más utilizado actualmente es la secuenciación directa del gen APC. Cuando se
identifica una mutación específica causante de la enfermedad, se debe realizar la prueba genética a
todos los parientes de primer grado. Miembros de la familia con un resultado negativo para la mutación
detectada en el paciente no necesitan más investigación y su seguimiento es el mismo de la población
14
en general.
La información genética no es solo relevante para el paciente afectado, sino también para la
familia inmediata y sus futuros descendientes. La prevención del cáncer y el mantener una buena
calidad de vida de estos pacientes son los objetivos principales. Por eso el diagnóstico precoz a través
del análisis de la secuencia del gen logró extender y mejorar la calidad de vida de estos pacientes.
También es relevante el conocimiento de que tipo de mutación presentan los pacientes ya que
ayuda a predecir la severidad de la enfermedad, dado que la ubicación de la mutación puede afectar la
función de la proteína de diferente manera.
Farmacogenética
Es la ciencia que estudia las variaciones heredadas en los genes que dictan la respuesta a fármacos.
Explora como estas variaciones se pueden utilizar para predecir si un paciente tendrá una buena, mala o
ninguna
respuesta
a
una
determinada
droga.
¿Hay
una
diferencia
entre
farmacogenética
y
farmacogenómica? Farmacogenómica se refiere al estudio general de diversos genes que determinan
comportamiento a una droga. La farmacogenética refiere al estudio de las diferencias heredadas
(variaciones) en el metabolismo y respuesta a una droga. La distinción entre los dos términos se considera
arbitraria y actualmente los dos términos se utilizan alternativamente. Para entender mejor la importancia de
esta nueva rama de la ciencia les describiremos un ejemplo.
Lucia es una niña de siete años que padece leucemia. Su doctor quiere comenzar la quimioterapia
cuanto antes. El purinethol es un quimioterápico común cuyo mecanismo de acción involucra su incorporación a las células cancerosas en activa división que conlleva la muerte celular. Esta droga fue utilizada por
primera vez hace 30 años. Mientras que la mayoría de los pacientes fueron beneficiados por el uso de esta
droga, los doctores sabían que el tratamiento producía un riesgo de muy importante y los efectos secundarios
eran a veces fatales en ciertos pacientes. Se estudió entonces el metabolismo de la droga encontrándose que
la enzima TPMT es responsable de metabolizarla e inactivarla. Encontraron que en la población variaban los
niveles de la actividad enzimática de TPMT. Dado que se trata de una sustancia tóxica es importante que
permanezca solamente en el cuerpo por una cantidad de tiempo limitada y que afecte principalmente a las
células cancerosas y no a las células normales. Por lo tanto, antes de prescribir la droga, es crítico conocer si
el paciente tiene actividad de TPMT para hacer inactivo con eficacia el Purinethol. El 89% de los niños poseen
la capacidad de inactivar la droga tóxica eficientemente, mientras el 11% de los niños tienen una variante de
15
TPMT con menor eficiencia pudiendo sufrir efectos secundarios severos si se les administra la dosis completa
del tratamiento. Sin embargo, se beneficiarán de una dosis mucho más baja. El 0.33% de niños tienen la
variante de menor actividad, y la sustancia tóxica puede persistir en el cuerpo de estos niños durante mucho
mas tiempo por lo que sufrirán efectos secundarios severos o fatales si se les administra cualquier dosis de
Purinethol. Saber qué variante genética de TPMT posee el paciente influenciará el tratamiento enormemente.
Para determinar la dosificación de Purinethol que Lucia necesitará se debe realizar una prueba de
diagnóstico basada en el estudio de secuencias del ADN para determinar qué variante de TPMT tiene Lucia.
La historia de Lucia ilustra apenas una manera en que la farmacogenética puede ser utilizada en la
clínica. La farmacogenética también ayuda a elegir la droga adecuada para un determinado paciente de una
diversidad de distintos tratamientos. Por otro lado ayuda a determinar el riesgo de un paciente frente a un
determinado tratamiento y a diseñar en función de esta información una estrategia para tratar la enfermedad.
DETECCION DE POLIMORFISMOS QUE CONTIENEN REGIONES ALTAMENTE VARIABLES
El ADN humano contiene algunas secuencias que están repetidas en tándem un número variable de
veces en ciertos loci dispersos en el genoma. Esas regiones se llaman regiones hipervariables porque
contienen un número variable de repeticiones en tándem (variable number of tandem repeats, VNTRs) o bien
minisatélites de ADN. Los VNTRs en humanos son secuencias de 1-5 kpb (kilopares de bases) que
consisten en un número variable de unidades repetitivas de 15 a más de 100 pb de longitud en los diferentes
genomas de los individuos. Cuando el ADN completo es cortado con enzimas de restricción que reconocen
sitios que flanquean la región VNTR (sin cortar dentro de los VNTRs) se obtienen fragmentos que contienen
esos loci, los cuales difieren en tamaño de un individuo a otro dependiendo del número de repeticiones que
estén presentes. Los fragmentos de diferentes tamaños pueden ser separados por electroforesis en gel
mediante la técnica de Southern blot. Las sondas usadas para identificar esos fragmentos de restricción se
unen a la secuencia que está repetida o a una secuencia cercana a ésta (Fig. 8).
Dada la enorme variabilidad en el número de repeticiones en tándem de un individuo a otro, el grupo
de fragmentos que aparece en la autorradiografía del Southern blot es altamente personalizado.
Los patrones de fragmentos de restricción producidos a partir de esos loci pueden usarse para
identificar individuos de manera tan segura como la tradicional huella digital. En efecto, esta técnica de
fragmentos de restricción suele ser llamada como la huella digital de ADN (DNA fingerprint) y es
ampliamente usada en análisis forense. Por este método pueden determinarse relaciones familiares, y puede
usarse para ayudar a incriminar o no a sospechosos en casos policiales. En investigaciones criminales,
pueden usarse muestras de sangre o semen, hasta diminutas muestras de tejido como células del folículo
piloso en el extremo de un único pelo. Las secuencias de VNTRs se amplifican por la técnica de PCR.
Se realiza el DNA fingerprint y se comparan los patrones de los resultados obtenidos a partir de la
evidencia y de una muestra tomada del sospechoso. Individuos que están estrechamente relacionados
genéticamente tendrán patrones de fragmentos de restricción que son más similares que aquellos que están
más distantemente relacionados. Sólo gemelos monocigóticos tendrán patrones idénticos.
Una de las primeras sondas que detectaron los VNTRs humanos fue obtenida en 1985 a partir de una
16
cuádruple repetición de una secuencia de 33 pb encontrada dentro del primer intrón del gen de la mioglobina.
Una vez que los VNTRs se clonaron y secuenciaron se encontró que la razón de la hibridación de la sonda a
los VNTRs era una secuencia central (core) de 13 pb común a todas las repeticiones y a la sonda. Las
secuencias flanqueantes a ese core, no eran necesariamente similares.
Figura 8: Obtención de un DNA fingerprint, utilizando una sonda para VNTR: Panel a). La sonda utilizada reconoce una
secuencia interna de 13 pb presente en los VNTR Panel b): En este diagrama se observa tres cromosomas somáticos
homólogos conteniendo VNTRs para cada individuo (I, II, III). El tamaño de los fragmentos depende del número de
repeticiones que ellos contengan. Se realiza un Southern-blot utilizando la sonda indicada en a) y se visualizan los
fragmentos de restricción producidos a partir del material genómico de los individuos (A, B y C).
Aplicaciones de la huella genética
La huella genética se utiliza en la medicina forense, para identificar a los sospechosos con muestras
de sangre, cabello, saliva o semen. También ha dado lugar a varias exoneraciones de condenados.
Igualmente se utiliza en aplicaciones como la identificación de los restos humanos, pruebas de paternidad,
la compatibilidad en la donación de órganos, el estudio de las poblaciones de animales silvestres, y el
establecimiento del origen o la composición de alimentos. También se ha utilizado para generar hipótesis
sobre las migraciones de los seres humanos en la prehistoria.
17
Muestras de referencia
Para la identificación del ADN se debe realizar una extracción de ADN que puede proceder de
sustancias tales como:
-Artículos personales (por ejemplo cepillo de dientes, maquina de afeitar).
-Banco de muestras (como un banco de esperma o la biopsia de un tejido).
-Parientes de sangre.
-Restos humanos previamente identificados.
-Algunas muestras de referencia son recolectadas con un hisopo bucal.
Existe otra clase de secuencias repetitivas de ADN dispersas, los microsatélites (short tandem
repeats, STRs) que contienen repeticiones más cortas, de 2 a 5 pb. Literalmente cientos de sistemas de
STRs han sido mapeados en todo el genoma humano, varios fueron investigados para su aplicación en tests
de identificación de humanos. Fueron encontrados en casi todos los cromosomas en el genoma y pueden ser
amplificados usando una variedad de cebadores por el método de PCR. Se analizan principalmente
repeticiones de 4 pb que son amplificadas por PCR con mayor fidelidad que las repeticiones dinucleótidicas
aunque también se usan repticiones tri y pentanucleotídicas. Al examinar múltiples STR loci, se puede
obtener un alto grado de discriminación entre individuos dada la enorme variedad de alelos presentes en una
población.
Short Tandem Repeats (STRs)
AATG
7 repeticiones
8 repeticiones
La región repetida es variable entre muestras mientras
que las regiones laterales donde se unen los cebadores
para la PCR son constantes.
Homocigota = Ambos alelos tienen el mismo número de
repeticiones
Heterocigota = Los alelos son distintos y pueden ser diferenciados
Ventajas de los STRs sobre los VNTRs
El estudio de STRs por PCR presenta varias ventajas sobre las técnicas convencionales de Southern
blot de los VNTRs. Se pueden obtener alelos discretos de los STRs, dado su menor tamaño, pudiéndose
diferenciar los fragmentos de ADN por una única base. Además puede usarse menor cantidad de ADN o
incluso ADN degradado. Por lo tanto, la integridad y cantidad de muestra es un problema menor al utilizar los
métodos de tipificación por basados en PCR que con los métodos convencionales de obtención de
fragmentos de distintos tamaños como los VNTRs.
Para
revisión
del
uso
de
STRs
en
identidad
genética,
se
puede
acceder
http://www.promega.com/pnotes/58/5189c/5189c.html.
18
a:
Las huellas dactilares de ADN resultaron un importante avance en medicina forense. Igualmente, debe
aclararse que esta metodología ha sido discutida en algunos ámbitos por problemas en las interpretaciones
estadísticas. Es absolutamente necesario que se tengan en cuenta todos los controles, incluyendo muestras
de ADN de la víctima, no sólo del sospechoso. Otro cuestionamiento a esta técnica, es que dada la gran
amplificación obtenida por PCR se pueden amplificar cantidades mínimas de ADN contaminante de una
fuente no relacionada con el caso. Los resultados obtenidos de las muestras tomadas de los sospechosos se
comparan con el del ADN obtenido de una muestra de sangre tomada de la víctima (Fig. 9; carril 1). Aunque
sólo se obtengan pequeñas cantidades de la muestra del cuerpo de la víctima, el ADN se puede amplificar
por PCR. Los resultados, usando una sonda que reconoce una de las secuencias repetitivas del ADN
humano, se muestran en la Figura 9.
1- ¿A qué se debe que en los distintos individuos aparezcan fragmentos distintos marcados si se utiliza la
misma sonda?
2- ¿Cuál de los sospechosos le resultaría culpable?
3- ¿Por qué se analiza también el ADN de la víctima?
Figura 9: Análisis de los VNTRs realizado con las distintas muestras obtenidas en la escena, el carril 1 muestra
los fragmentos de VNTRs obtenidos de la muestra de sangre tomada de la víctima. Las muestras obtenidas se
amplificaron por PCR y se sometieron a Southern blot utilizando una sonda que reconoce una secuencia de 13 pb
común a todos los VNTRs presentes en el genoma humano.
19
USO DE TECNICAS DE ADN RECOMBINANTE PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES
Producción de Proteínas Terapéuticas
Con el desarrollo de métodos que permiten la transferencia de genes específicos de una célula a
otra, y la inducción de la expresión de los mismos en el nuevo hospedador, la industria farmacéutica ha
adquirido una gran potencialidad. Algunas compañías farmacéuticas han empezado ya la producción de
polipéptidos humanos por bacterias o levaduras. Un ejemplo de estos polipéptidos producidos son
hormonas como la insulina, hormona del crecimiento, glucagon, interferón, factores de la coagulación,
factor VIII, etc. Estos productos se encuentran comúnmente en venta en las farmacias y son producidos
por técnicas de biotecnología.
El primer paso para lograr esta producción de proteínas es el clonado de un ADNc en un vector
de expresión. Un vector de expresión es un plásmido que además de contener las características
anteriormente mencionadas debe tener además las secuencias que permitan la transcripción y
traducción del ADN insertado en dicho vector permitiendo de esta manera la expresión de la proteína.
Para expresar una proteína humana en una célula o sistema procarionte como la Escherichia
coli (E. coli) se necesita obtener la secuencia codificante de dicha proteína. Esto se puede realizar
mediante la técnica de RT-PCR que consiste en transcripción reversa y PCR. Se obtiene el ADNc a
partir del ARNm correspondiente, por transcripción reversa y mediante cebadores específicos se
amplifica por PCR la secuencia de ADN de la proteína de interés. ¿Por qué no podemos utilizar la
secuencia completa del gen de la proteína? Porque las bacterias no realizan splicing y no podrían
remover los intrones y empalmar los exones de un transcripto primario.
La secuencia codificante o gen de interés debe ser insertado en el vector adyacente (río abajo) a
un promotor procarionte como puede ser el promotor T7 que será reconocido por la ARN polimerasa T7
de la bacteria y resultará en una alta producción de la proteína de interés en la bacteria, que luego
podrá ser purificada e identificada.
¿Cómo podemos identificar las bacterias que contienen el plásmido recombinante y expresan la
proteína de interés? Podemos crecer distintas colonias de bacterias y aislar las proteínas analizando la
expresión de nuestra proteína de interés mediante Western blot. Una vez identificadas estas bacterias
las mismas pueden ser utilizadas para producir la proteína en gran escala. La misma será purificada del
resto de las proteínas bacterianas mediante técnicas de purificación convencionales.
20
La aplicación de las técnicas de ADN recombinante a la fabricación de insulina ha disminuido
sustancialmente el precio de dicha hormona. La insulina que era utilizada corrientemente en la terapia
de la diabetes se extraía del páncreas de vaca o cerdo. Dicha insulina difiere ligeramente en su
secuencia de aminoácidos de la insulina humana, y aunque la mayoría de dichas insulinas controlan los
principales síntomas del diabético, pueden presentarse efectos secundarios, como el deterioro renal y
de la retina; y generar alergias u otro tipo de reacciones inmunológicas.
Esta metodología se utilizó para la producción de la hormona del crecimiento humana (hGH)
(Figura 10) y de interferones. La deficiencia en hormona del crecimiento hipofisaria conduce a una
forma de enanismo que puede tratarse por administración de la hormona. Dicha hormona es
característica de cada especie; la fuente de la que se la obtenía anteriormente eran cadáveres
humanos. Su escasa disponibilidad, aún a pesar de sus muchas aplicaciones clínicas, ha constituido un
factor condicionante del desarrollo de la investigación sobre la misma.
Codón stop
Primer aminoácido de la
hGH madura
Corte con EcoRI
Remoción de codones
para los aminoácidos
1-24
Aislar el fragmento de
ADN que codifica para
los aminoácidos 24-191
Oligonucleótido sintético para
los aminoácidos 1-24
Metionina
iniciadora
Ligar
Corte con
HindIII
Ligar
Metionina
iniciadora
Vector de expresión
Secuencia de la hGH
Promotor
E. coli transformada
La hGH se acumula
dentro de la célula
bacteriana
hGH aislada del
extracto bacteriano
Metionina iniciadora
Figura 10: Expresión de la hormona de crecimiento humana (hGH) en E.coli. La secuencia humana es removida
21
permitiendo que la proteína sea producida por las células bacterianas. El producto contiene una metionina bacterial
extra
La hGH se utiliza en la clínica para tratamiento de desordenes de crecimiento en niños y
deficiencia en el crecimiento en adultos. En los años recientes, las terapias de reemplazo con hGH han
mostrado efectos en pacientes deficientes incluyendo: disminución de grasa corporal, aumento de masa
muscular, densidad ósea, niveles energéticos, y mejora de la función del sistema inmune. Aunque la
hGH se ha obtenido en cantidad, exitosamente en organismos procariontes, la bioactividad obtenida de
esta manera ha sido escasa.
Las proteínas que necesitan modificaciones post-traduccionales necesarias para su actividad
biológica (glicosilación, fosforilación, etc.) o alguna conformación particular no pueden ser producidas en
bacterias, y se debe utilizar sistemas eucariontes para su producción. Los vectores de expresión
utilizados en este caso difieren en que las secuencias promotoras que regulan la transcripción son de
origen eucarionte. En este caso pueden utilizarse células de levaduras, algas, plantas, insectos,
gusanos de la seda (Bombix mori) y mamíferos.
Proteínas humanas más complejas han sido producidas en células de mamíferos en cultivo. El
gen del Factor VIII, una proteína involucrada en la coagulación de la sangre, está alterado en individuos
con hemofilia. Antes de que se dispusiera de Factor VIII por ingeniería genética, muchos hemofílicos
murieron de SIDA o hepatitis debido a que contrajeron la enfermedad por transfusiones con sangre
contaminada o con Factor VIII aislado a partir de sangre contaminada. El activador del plasminógeno
tisular (TPA) es una proteasa presente en la sangre que convierte el plasminógeno en plasmina, una
proteasa que a su vez cliva a la fibrina, y disuelve los coágulos de sangre. El TPA recombinante,
producido en cultivos de células de mamífero, se administra frecuentemente durante o inmediatamente
luego de un ataque cardíaco para disolver los trombos que ocluyen las arterias coronarias.
Vacunas
Antes del advenimiento de la tecnología de ADN recombinante, las vacunas se producían a
partir de agentes infecciosos los cuales eran previamente destruidos o atenuados (alterados de tal
manera que no podían multiplicarse en un individuo inoculado). Ambos tipos de vacunas eran
potencialmente peligrosas debido a que podían estar contaminadas con el agente infeccioso vivo. En
efecto, en un pequeño numero de casos, la enfermedad fue causada por la vacunación. Debido a que el
sistema inmunitario humano responde a proteínas antigénicas de la superficie del agente infeccioso, se
hizo muy atractiva la posibilidad de producir esos antígenos por técnicas de ADN recombinante. Por
estas técnicas, las proteínas pueden producirse completamente libres del agente infeccioso y se elimina
así todo riesgo de infección. La primera vacuna recombinante que fue producida de forma satisfactoria
fue la vacuna contra el virus de la hepatitis B. La primera vacuna disponible contra la hepatitis B
contenía virus de Hepatitis B (HBV) químicamente inactivado. El virus había sido obtenido de sangre de
individuos que se sabía eran portadores de HBV. Más tarde, se usaron vacunas en las que el virus
permanecía vivo pero había sido alterado como para que no se multiplicara más en el individuo
inoculado (atenuado). Ambas vacunas, la de virus inactivado y la de virus atenuado, son potencialmente
peligrosas porque pueden estar contaminadas con HBV infectivo.
22
Las nuevas vacunas, comercializadas desde 1987, fueron obtenidas por técnicas de
recombinación de ADN. Ya que esta vacuna consiste únicamente en la proteína de superficie del virus,
antígeno contra el cual responde el sistema inmune, no hay riesgo de infección por HBV. El virus
contiene un antígeno de superficie (HBsAg, llamado también antígeno australiano) cuyo ADN ha sido
aislado. Pero debido al hecho de que la proteína está glicosilada, no puede ser producida en
Escherichia coli (porque las bacterias no pueden glicosilar proteínas). Por lo tanto, se utiliza un sistema
de expresión en levaduras (célula eucarionte) para producir la forma glicosilada de la proteína. La
proteína viral, separada de una pequeña cantidad de proteínas de levadura, se utiliza como vacuna en
la inmunización contra el virus causante de la hepatitis B.
Algunas proteínas obtenidas por técnica de ADN recombinante utilizadas en la medicina:
Productos
Usos
Anticoagulantes, TPA
Activa plasmina, una enzima involucrada en la
disolución de los trombos, por lo tanto efectivo en
el tratamiento de pacientes con afecciones cardíacas o circulatorias en general.
Promueve la coagulación deficiente en pacientes
hemofílicos; su uso elimina los riesgos de infección
generados por múltiples transfusiones.
Son factores de crecimiento del sistema inmune
que estimulan la producción de leucocitos, usados
para tratar deficiencias inmunológicas y contra
infecciones.
Estimula la producción de eritrocitos; usado para
tratar anemias en pacientes con enfermedades
hepáticas.
Estimula la diferenciación y crecimiento de varios
tipos celulares, usado para promover curación de
heridas.
Usada para tratar el enanismo
Usada para tratar diabetes
Interfieren con la replicación viral, usados para
tratamiento de algunos tumores.
Activan y estimulan diferentes clases de leucocitos;
posibles usos en infección con VIH, cáncer y
deficiencias inmunológicas.
Especificidad de unión, usados en: tests diagnósticos, transporte dirigido de drogas, toxinas o
compuestos radioactivos como terapia antitumoral.
Previene daño tisular de las especies reactivas del
oxígeno cuando el tejido brevemente se somete a
bajo oxígeno para luego aumentar abruptamente
como en cirugías.
Proteínas derivadas de la cápside viral efectivas en
alertar al sistema inmune pero más seguras que
las tradicionales a virus inactivado.
Factores de la coagulación, Factor VIII
Factores estimulantes de colonias (CSF)
Eritropoyetina
Factores de crecimiento
Hormona de crecimiento humana (hGH)
Insulina humana
Interferones
Interleuquinas
Anticuerpos monoclonales (mAbs)
Superóxido dismutasa (SOD)
Vacunas
Tomado del Lehninger “Principios de Bioquímica” David L. Nelson y Michael M. Cox
23
ANIMALES TRANSGENICOS
En los organismos superiores, animales o vegetales, la información genética se transmite por
mecanismos de reproducción sexual, es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin
embargo, hace ya unos veinte años se lograron obtener los primeros ratones transgénicos mediante
transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto obtenido por fecundación in vitro
(Figura 11). Es decir, se trataba de una transmisión genética horizontal, también llamada transgénesis.
Dado que el cigoto se hace transgénico inicialmente, el ADN extra pasa a las células germinales
y luego es transferido a la progenie derivada de estas células comportándose como un gen nuclear
regular. Al igual que ocurre en plantas, los animales son manipulados no sólo para mejorar la calidad
del animal mismo, pero también para ser productores convenientes de una proteína particular en
granjas farmacéuticas.
La generación de animales transgénicos es esencial para el estudio in vivo de la función de genes durante el desarrollo, la organogénesis y el envejecimiento. También permite la evaluación de
estrategias terapéuticas en modelos de enfermedades humanas, así como la investigación de la progresión de la enfermedad de una manera que no sería posible en seres humanos. Dentro de las aplicaciones comerciales se incluyen la preparación de proteínas recombinantes, la protección de animales
contra enfermedades, y la introducción de nuevos rasgos genéticos.
Plásmido portador del gen de la
hormona de crecimiento de rata
Microinyección en
el pronúcleo de
huevos fertilizados
Implantación en madres
ratón adoptivas
Ratones de la descendencia
crecimiento
Ratones transgénicos con unas 800
veces más hormonas de crecimiento que
sus compañeros de camada
Figura 11: Esquema de la introducción del gen de la hormona de crecimiento de rata en ratones. Se microinyectaron copias de un plásmido de ADN recombinante que contenía el gen de la hormona de crecimiento de rata a
24
óvulos fertilizados de ratón, que se implantaron en madres adoptivas. Algunos de los ratones de la descendencia
contenían el gen foráneo integrado en su propio genoma y expresaron una cantidad mucho mayor de lo normal de
la hormona de crecimiento razón por la cual crecieron mucho más que sus compañeros de camada de tamaño
normal.
Se han producido animales transgénicos en una gran variedad de especies. Dentro de los vertebrados, se han desarrollado en especies de peces, anfibios, aves y mamíferos. Algunas especies de
invertebrados incluyen algunos ampliamente utilizadas en investigación, tales como los artrópodos
Drosophila melanogaster, y el nematodo Caenorhabditis elegans.
Objetivos y aplicaciones
La Biotecnología incluye cualquier técnica que utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos
para usos específicos.
La potencialidad de la biotecnología estriba en:
•
Producir cantidades ilimitadas de substancias de las que nunca se había dispuesto con anterioridad
o de productos que se obtenían en pequeñas cantidades.
•
Abaratamiento de los costos de producción.
•
Mayor seguridad en los productos obtenidos.
•
Nuevas materias primas, más abundantes y menos caras.
Dentro de este contexto general, la Biotecnología ha incorporado la transgénesis animal con
los siguientes fines:
•
Mejora de caracteres productivos
•
Resistencia a enfermedades
•
Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout).
•
Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor (proteínas
terapéuticas): Las "granjas farmacéuticas" o "granjas moleculares"
•
Donación de órganos: Xenotransplantes
Disrupción o reemplazo de genes en ratones: Knockout
A partir de la disrupción de genes en levaduras, se ha obtenido invalorable información sobre el
rol de genes específicos a través de su reemplazo por una copia mutada. Estas versiones llamadas
organismos “knockout” pueden presentar fenotipos modificados que luego pueden ser examinados.
Por ejemplo, se han creado ratones knockout que carecen de las enzimas vitales de reparación
del ADN con el objetivo de estudiar si este fenotipo causa un incremento en la tasa de aparición de
tumores.
Brevemente, se prepara un vector de ADN que contenga el gen de interés clonado e interrumpido por la inserción, por ejemplo, del gen para neomicina (que codifica para la resistencia al antibiótico
neomicina) generándose entonces un gen mutado artificialmente. Cabe aclarar que las células de
mamífero no poseen el gen de resistencia a neomicina. El gen de resistencia a antibiótico se usará
25
luego como marcador para indicar que el vector de ADN ha sido captado por las células y se ha insertado en el cromosoma del hospedador. Luego se introduce el vector en células aisladas de un embrión
de ratón. Cuando ocurre la recombinación homóloga, las regiones que contienen el gen interrumpido
toman el lugar del gen original. Para detectar las células que portan el gen mutado se colocan las
células en un medio de cultivo conteniendo las drogas seleccionadas, por ej. en este caso, un compuesto análogo a neomicina. Este compuesto es letal para las células que no tienen el gen de resistencia a neomicina funcional y entonces se eliminan las células en las cuales no ha habido integración del
vector. Las células seleccionadas se inyectan en un embrión temprano (blastocisto) y se implantan en
una madre sustituta. La progenie resultante será heterocigota y luego se cruzará para la obtención de
la segunda generación entre los cuales habrá homocigotas para el gen mutado.
Granjas farmacéuticas
La Biotecnología ha aplicado estas técnicas experimentales de transgénesis y ya hoy se están
estableciendo las primeras granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas. En estos casos la manipulación genética de un mamífero doméstico transgénico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano, uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un
elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de una proteína de la
leche (por ejemplo, la β-lactoglobulina, la caseína, etc.). De esta manera se asegura que el gen humano sólo se expresará en las células de las glándulas mamarias del animal transgénico (oveja, cabra,
vaca, cerdo) obtenido tras la inyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un cigoto
producido por fecundación in vitro. (Figura 12). Se ha conseguido que la leche de las hembras transgénicas contenga proteínas terapéuticas humanas (α -1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) que pueden luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas
propias del animal. Es importante señalar que el animal transgénico no se ve perjudicado en su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células de las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se lo ha asociado y, por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza
la proteína humana al estar silenciado el gen humano.
También se utilizan vacas con el objetivo de obtener leche maternizada, suprimiendo mediante
la técnica de "knockout" del gen de la β -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
En Argentina, en el año 2002 se logró clonar por primera vez tres terneras transgénicas que
producen hormona de crecimiento humana, vital para tratar a las personas que padecen enanismo.
Figura 12: Microinyección de ovocitos fecundados
26
Un animal puede llegar a producir no menos de un gramo de esa proteína transgénica por litro
de leche secretada lo que equivale a cinco kilos de esta proteína en su leche por año.
Una vez que se tiene el animal transgénico, es posible obtener otros idénticos a partir de la clonación. De esta forma se puede conservar y multiplicar alguna característica beneficiosa.
27
En los próximos años se esperan avances en estos desarrollos biotecnológicos. En Argentina,
ya se obtuvieron descendientes de Mansa, una dinastía de animales transgénicos que integran el
"tambo farmacéutico".
TERAPIA GENICA
La terapia génica se define como la transferencia in vivo o ex vivo de una secuencia genética
para reemplazar material genético defectuoso o conferir una nueva actividad a la célula. Al principio se
pensó que era un procedimiento apropiado sólo para el tratamiento de enfermedades de origen hereditario, pero actualmente está en experimentación en enfermedades cardiovasculares, SIDA, cáncer,
autoinmunidad y otras patologías.
Esta terapia ha tenido resultados buenos en animales de laboratorio, y la bioseguridad de la
transferencia genética ha sido comprobada, dependiendo del tejido afectado. En humanos, se han
logrado algunos éxitos en patologías asociadas al pulmón y a tumores de piel, pero la gran mayoría de
tratamientos se encuentran en fase experimental en animales de laboratorio y en pacientes en los que
otros tratamientos no fueron efectivos. Igualmente, esta nueva terapia abre nuevos interrogantes éticos
y sociales.
Para introducir eficientemente el gen “bueno” dentro de las células, pueden usarse retrovirus
(virus con ARN) o adenovirus (virus con ADN lineal doble cadena). Se observó que las transfecciones
con adenovirus eran transitorias, por lo que se necesitaba que el paciente realice el tratamiento en
forma diaria o cada 2 o 3 días. En cambio, las transfecciones con retrovirus fueron más permanentes,
fundamentalmente porque éstos son más hábiles para escapar a la respuesta inmune. Actualmente se
están utilizando virus HIV como vector, sustituyendo genes infectivos y algunos genes de la cápside,
aunque en este caso las restricciones deberían ser éticas. El objetivo es liberar al marcador vírico a una
zona particular en un embrión o en una persona, infectando así un número limitado de células a partir
de la cual se obtendrá un clon de células que contenga el marcador vírico integrado. También se está
experimentando con liposomas, formados por lípidos cargados positivamente que pueden interaccionar
con las cargas negativas de la membrana celular. Se probaron diferentes sistemas de transferencia
ADN-liposomas en pacientes mediante catéteres, pero se encontró que tenían baja eficiencia de
transfección y alta toxicidad.
Todos los sistemas enumerados hasta ahora funcionan en cualquier célula, ya que no tienen
receptores específicos. Actualmente se están desarrollando diferentes sistemas de transferencia con
receptores, para tratar un solo tipo celular, pero como deben incorporarse diferentes señales (señal
para evadir los lisosomas después de la entrada a la célula, señal para atravesar los poros nucleares,
etc) dentro del vector sintético, la eficiencia de transfección es muy baja.
Los criterios seguidos en general pueden resumirse en:
1- las investigaciones están restringidas a células somáticas. De esta forma los individuos no pueden
transferir a su descendencia las modificaciones genéticas adquiridas.
2- el riesgo de la aplicación de la técnica debe que ser largamente superado por los beneficios a
obtener. Existe la posibilidad inherente de que el ADN se integre en un gen funcional llevando a la
28
inactivación de dicho gen. De tratarse de un gen relacionado con la proliferación celular podría producirse una célula cancerosa.
3- La enfermedad en estudio debe ser el resultado de la alteración de un único gen.
La terapia génica no es un campo nuevo, ya que ha venido desarrollando durante décadas. A
pesar de los esfuerzos de los investigadores de todo el mundo, la terapia génica ha logrado sólo un
éxito limitado.
La terapia génica sólo funcionará si se logra entregar un gen normal a un gran número de
células - por ejemplo, varios millones - en un tejido. Y tienen que ser las células correctas, en el tejido
correcto. Una vez que el gen llegue a su destino, debe ser activado, y producir la proteína codificada por
el gen. La entrega y activación del gen son los mayores obstáculos que enfrentan los investigadores de
terapia génica. La orientación de un gen a las células correctas es crucial para el éxito de cualquier
tratamiento de terapia génica. Igualmente importante, sin embargo, es asegurarse de que el gen no se
incorpore a las células equivocadas. La entrega de un gen en otro tejido sería ineficaz y podría causar
otros problemas de salud al paciente.
Por ejemplo, la orientación inadecuada puede incorporar el gen terapéutico en la línea germinal
de un paciente. Si esto sucede, el paciente podría transmitir el gen introducido a su descendencia. Las
consecuencias dependerían del tipo de gen introducido.
Por otro lado, los vectores utilizados deben ser capaces de escapar del sistema inmune. De lo
contrario, puede causar enfermedades graves o incluso la muerte.
La historia de Jesse Gelsinger ilustra este reto también. Gelsinger, que tenía un trastorno
hepático raro, participó en un ensayo en 1999 en la Universidad de Pennsylvania y murió de
complicaciones de una respuesta inflamatoria poco después de recibir una dosis de vector adenovirus
experimental. Su muerte detuvo todos los ensayos de terapia génica en los Estados Unidos por un
tiempo y desató un debate muy necesario sobre la mejor manera de regular los ensayos
experimentales.
También hay que tener en cuenta que para ser efectiva la terapia el gen debe integrarse al
genoma de las células en el tejido blanco, pero puede ocurrir que dicha inserción altere la expresión de
algún otro gen en forma colateral. Por ejemplo, si se inserta en un sitio y afecta la expresión de un gen
supresor de tumores, las células portadoras podrían expresar la proteína de interés pero a la vez
adquirir un fenotipo proliferativo y eventualmente tumoral.
Ejercicios
1) Dos bebés del mismo sexo (B1 y B2) nacieron el mismo día en el mismo hospital. Debido a que se
sospechó que los mismos fueron accidentalmente cambiados en la nursery del hospital, se llevó a cabo
un test genético basado en fragmentos de restricción del ADN que exhiben polimorfismo debido a que
contienen un número variable de tandems repetidos. Se obtuvieron muestras de sangre de los padres y
de los bebés, se extrajo el ADN y se amplificó por PCR. El ADN luego fue tratado con la enzima de
29
restricción Ban I y se separaron los fragmentos obtenidos por electroforesis en gel de agarosa. Los
resultados de un Southern blot son los mostrados más abajo. Para revelar los fragmentos se usó una
sonda radioactiva que se une a una secuencia dentro de los fragmentos Ban I que exhiben
polimorfismos. Basados únicamente en este test, ¿quiénes son, con mayor probabilidad, los padres del
bebé B1 y quiénes los del bebé B2? (MA es una de las madres y PA es su marido y MB es otra de las
madres y PB su marido).
MA
PA
B1
B2
MB
PB
2) Se ha encontrado una enfermedad relacionada con el gen X que codifica para la enzima Z. La causa
de dicha enfermedad es la ausencia de la actividad de Z. Se realizaron pruebas a distintos individuos
utilizando diferentes técnicas de biología molecular: southern y northern blot utilizando una sonda
marcada que es el ADNc específica para el gen X y western blot utilizando anticuerpos específicos para
la enzima Z. En el análisis de Southern blot primero se realizó digestión del ADN con la enzima de
restricción EcoRI. El individuo A es el control normal que no presenta la enfermedad. El individuo B no
presenta síntomas pero algunos de sus hijos presenta la enfermedad. Los individuos C y D presentan la
enfermedad.
a) Explique porqué el individuo B no presenta síntomas.
b) Sugerir posibles defectos que lleven a la enfermedad en el individuo C y D a partir de los resultados
obtenidos. Justifique su respuesta.
En el gráfico se representan las autorradiografías de las distintas técnicas. A, B, C y D
corresponde a los carriles de las muestras de los correspondientes pacientes.
30
A
B
C
D
Peso molecular
Southern
blot
5 Kb
4 Kb
1 Kb
A
B
C
D
Northern
blot
3 Kb
A
Western
blot
B
C
D
43 kDa
20 kDa
31