FÁRMACOS PARA DESPERTAR UN GEN PATERNAL EN EL

CAROLINA GARCÍA POYATOS
GENÉTICA MOLECULAR
GRADO EN BIOLOGÍA- 7/12/2012
FÁRMACOS PARA DESPERTAR UN GEN PATERNAL
EN EL SÍNDROME DE ANGELMAN
Inhibidores de topoisomerasas eliminan el silenciamiento del
alelo dormido de UBE3A en neuronas.
1. INTRODUCCIÓN
El síndrome de Angelman es un grave trastorno neurológico
caracterizado por retraso mental grave, falta de habla, ataxia, convulsiones,
características únicas de comportamiento, tales como sonrisa y risas únicas
(Jana 2012) y rasgos faciales característicos (Figura 1)
Figura
1.
Rasgos
faciales
característicos de un paciente con
síndrome de Angelman.
La enfermedad es causada principalmente por deleción o mutación en
el alelo materno del gen ubiquitina ligasa E3A (UBE3A). Dicho gen se localiza
en el cromosoma 15q11-q13 y codifica una proteína de 100 kDa con función
ubiquitina ligasa y coactivador transcripcional (Jana 2012). Últimos estudios
han demostrado que dicha proteína juega un papel muy importante en la
función sináptica neuronal y en la regulación de la actividad dependiente de
dicha plasticidad. La disminución de los niveles de UBE3A da lugar a una
pérdida de la señalización dopaminérgica en las vías motoras subcorticales,
pérdida responsable de la sintomatología característica de dicho síntoma.
El síndrome de Angelman es un ejemplo clásico de enfermedad con
herencia epigenética (Figura 2). El desarrollo de la enfermedad viene dado en
función de si la copia del gen alterado proviene del padre o de la madre.
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Figura 2. Regulación diferencial de los alelos materno y paterno del gen UBE3A. De las
dos copias del gen, solo la copia materna es expresada en tejido neuronal, mientras que la
copia materna permanece silenciada por imprinting. Concretamente, la expresión del gen
paterno UBE3A es inhibida mediante la transcripción en dirección antisentido de una larga
secuencia que incluye no sólo este gen, sino también el centro de control que regula su
expresión. En el cromosoma materno equivalente, la secuencia que codifica el centro de
control está metilada (Me) de forma que no se expresa, la transcripción antisentido queda
inhibida permitiéndose la activación de la expresión de UBE3A.
En el síndrome de Angelman, mientras que el gen UBE3A materno está
mutado, el paterno permanece intacto pero inhibido epigenéticamente de forma
que los niveles proteicos de UBE3A son mínimos.
La sintomatología de este síndrome aparece a partir de los 6-12 meses
de vida, durante estos primeros meses la arquitectura y función del cerebro
permanecen normales. El equipo de Huang se planteó por tanto la posibilidad
de curar el trastorno recuperando la proteína UBE3A funcional mediante la
activación del gen paterno silenciado durante estas primeras etapas de vida de
forma que las consecuencias físicas aún no hubieran aparecido.
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2. MÉTODOS EXPERIMENTALES
Se procedió a buscar fármacos que activaran la copia paterna de dicho
gen. Para ello se usaron como modelo ratones modificados genéticamente de
forma que el gen UBE3A codificaba para una proteína transgénica UBE3A
fluorescente (UBE3A-YFP) (Figura 1) Se trabajó in vitro con neuronas
corticales de estos ratones (Figura 2).
Figura 2. a. Creación de ratones
transgénicos que codificaban para una
proteína recombinante UBE3A-YFP y
posterior tratamiento con 2.306
fármacos.
Para comprobar si realmente la copia de UBE3A paterna estaba
silenciada en neuronas corticales se crearon dos tipos de ratones: ratones que
sintetizaban la proteína UBE3A-YFP a partir del alelo paterno (m+/pYFP) y por
otro lado ratones que la sintetizaban a partir del alelo materno (m YFP/p+ ). Los
resultados mostraron solo presencia de UBE3A-YFP en los ratones mYFP/p+
(Figura 3).
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Figura 3. Ensayo ex vivo. Imagen microscopio de fluorescencia de neuronas
corticales aisladas a partir de embriones de ratones con UBE3A-YFP heredado por vía
YFP +
+ YFP
materna-YFP (m /p ) y paterna (m /p ). Contratinción de núcleos con DAPI.
Las neuronas corticales aisladas a partir de los embriones transgénicos
fueron tratadas con 2.306 fármacos (figura 2). Los resultados mostraron que
ningún compuesto de los que normalmente se usan para conseguir
modificaciones epigenómicas, como fármacos remodeladores de la cromatina o
inhibidores de ADN metilasas, revertían el silenciamiento del alelo paterno. En
cambio, se encontró un compuesto, el irinotecán (inhibidor de la topoisomerasa
I) que sí revertía dicho silenciamiento.
Finalmente se aislaron doce inhibidores para la topoisomerasa I (TOP1)
y cuatro para la topoisomerasa II (TOP2) con los que se conseguía el efecto
deseado. Uno de estos 16 inhibidores de topoisomerasas, el topotecán, resultó
ser mucho más eficaz que el resto de forma que los siguientes estudios se
centraron en dicho compuesto (Figura 4). El topotecán necesita de menores
concentraciones para llegar a su máximo de efectividad (Figura 4.a) y además,
los niveles de expresión de UBE3A-YFP resultan más altos en periodos de
tratamiento más cortos (Figura 4.b).
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Figura 4. El topotecán tiene mayor eficiencia en el revertimiento del silenciamiento del
gen paterno UBE3A que otros inhibidores de topoisomerasas. a. Curva dosis-respuesta
para el estudio del efecto revertimiento del silenciamiento del gen paterno UBE3A mediante el
uso de topotecán e irinotecán. b. Curva concentración de UBE3A-YFP en tejido neuronal
respecto a los días de tratamiento.
Se comprobó que el topotecán regulaba positivamente la expresión de
UBE3A tanto en células procedentes de ratones con UBE3A materno afectado,
es decir ratones con el síndrome de Angelman (m-/pYPF), como en ratones con
fenotipo salvaje (m+/pYPF), lo que se explicaba por la eliminación del
silenciamiento del alelo paterno. El topotecán reduce notablemente los niveles
de TOP1 activa al unirla covalentemente con el ADN.
Se vio que aparentemente este compuesto no modificaba los patrones
de metilación del centro de regulación (Figura 5) sino que actuaba reduciendo
la transcripción de un ARN a partir de un patrón de lectura antisentido que en
cis reprimía a UBE3A (Figura 6).
Figura 5. Esquema representativo del grado de metilación de los centros control de los
UBE3A materno y paterno. En presencia de topotecán estos patrones de metilación aparecen
intactos, el materno aparece totalmente metilado mientras que el paterno permanece sin
metilar.
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Figura 6. Regulación diferencial de los alelos materno y paterno del gen UBE3A. La
expresión del gen paterno UBE3A es inhibida mediante la transcripción en dirección antisentido
de una larga secuencia que incluye snoRNAs reguladores.
In vitro se vio que, una vez detenido el tratamiento con topotecán, la
inhibición del silenciamiento, es decir la expresión de UBE3A-YFP, se
mantenía.
Tras todos estos trabajos in vitro, se procedió a su estudio in vivo.
Primero se identificó una dosis de topotecán que era correctamente tolerada
por los ratones. Posteriormente se les inyectó dicha dosis en el ventrículo
lateral vía intraventricular pero los resultados no mostraron un aumento
relevante de los niveles de UBE3A-YFP. En cambio, al usar dosis más
elevadas sí se comprobó un aumento de dichos niveles en el sistema nervioso
sin que los niveles de topotecán en sangre fueran significantes.
Figura 7. El topotecán revierte el
silenciamiento de UBE3A in vivo.
Suministro unilateral de topotecan
(icv)
usando
una
bomba
miniosmótica en el ventrículo lateral
de ratones Ube3a m+/pYFP vivos. El
tratamiento durante dos semanas
con infusión de topotecán revierte el
silenciamiento del gen paterno en el
hemisferio infundido del hipocampo,
mientras que en el hemisferio no
infundido
no
se
revierte
el
silenciamiento.
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La concentración de topotecán, una vez cesado el tratamiento, en
menos de cinco horas disminuía notablemente pero en cambio los efectos
sobre UBE3A se mantenían durante días (Figura 8).
Figura 8. El topotecán revierte irreversiblemente el silenciamiento de UBE3A in vivo.
Una vez cesado el tratamiento los efectos de reversión del silenciamiento permanecen incluso
semanas después del tratamiento.
Por otro lado, el uso de topotecán llevó en algunos casos a relevantes
efectos secundarios. El topotecán inhibe la TOP1 y esta inhibición puede
afectar a la transcripción de otros genes cuya transcripción es requerida en
condiciones normales. Uno de ellos es el gen implicado en el síndrome de
Prader-Willi, trastorno genético que se caracteriza por la ausencia de expresión
de un alelo paterno, al contrario que el síndrome de Angelman en el que el
alelo afectado era el materno. Al inhibir TOP1, se inhibe también la expresión
de dicho gen materno comprobándose in vitro una transformación de células
inicialmente afectadas por el síndrome de Angelman, a células afectadas por
Prader-Willi. En cambio, el topotecán se está usando actualmente en algunos
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tratamientos de quimioterapia y en ningún caso se han dado síntomas de
Prader-Willi.
En Estados Unidos ya se han hecho inyecciones de topotecán en el
fluido cerebroespinal de adultos para tratar otras enfermedades. Aun así, el
tratamiento para el síndrome de Angelman debe hacerse en niños muy
pequeños lo que es mucho más arriesgado.
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3. CONCLUSIONES
El síndrome de Angelman es un trastorno genético causado por
inactivación del alelo materno del gen UBE3A, gen regulado por imprinting cuya
copia paterna aparece silenciada. Este síndrome puede llegar a curarse
mediante el tratamiento con fármacos inhibidores de topoisomerasas durante
los primeros meses de vida del paciente. Dichos fármacos revierten el
silenciamiento del alelo paterno de UBE3A que permanece sano en los
pacientes, al inhibir la transcripción en dirección antisentido de la secuencia
que incluye la región control, con lo que se inhibe la transcripción de los
snoRNAs reguladores.
El fármaco inhibidor de topoisomerasa más efectivo para la reversión de
dicho silenciamiento y además aceptado para la aplicación humana es el
topotecán cuya aplicación in vivo revierte el silenciamiento de la copia paterna
del gen de forma permanente, incluso una vez finalizado el tratamiento.
Este tratamiento con topotecán debe realizase con concentraciones
reguladas ya que un exceso podría llevar a la aparición del síndrome de
Prader-Willi. Hoy en día, los estudios se centran en la búsqueda de
tratamientos con topotecán viables y efectivos para niños menores de seis
meses de edad.
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