Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
FAC. MEDICINA
DPTO. ESPECIALIDADES MEDICAS
Restriction Fragment
Length Polymorphism (RFLP)
Marcelo A. Castillo Navarrete, MsCs (c)
24 de Octubre de 2005
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)
• Identificación de cepas
• Estudio de mutaciones
genéticas
• Estudio de paternidad
• Estudios forences
• etc
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)
• Polimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción
• variaciones en las bases nitrogenadas en el
sitio donde una enzima de restricción corta
un segmento de ADN.
• Estas variaciones afectan el tamaño de los
fragmentos que resultan del corte.
• Los RFLP se pueden utilizar como
marcadores en la construcción de mapas
físicos y de ligamiento.
Enzimas de Restricción
• endonucleasas que reconocen una
secuencia entre 4-8 pb de ADN.
• El sitio de reconocimiento se llama
sitio de restricción,
– rompe un enlace fosfodiester en la hebra
de arriba y
– otro enlace fosfodiester en la hebra
complementaria.
Enzimas de Restricción
• se encuentran en muchas especies de
bacterias,
– funcionan in vivo como parte de un sistema de
restricción y modificación (sistema R/M).
– Este sistema es análogo a un sistema inmune, y
le permite distinguir a la bacteria entre
• su propio DNA y
• el DNA exógeno,
• siendo este último degradado por la enzima de
restricción.
– El DNA propio no es reconocido por sus enzimas
de restricción,
• previamente lo ha modificado por metilación a través de
la acción de una metiltransferasa
Tipos de Enzimas de Restricción
Tipos de Enzimas de Restricción
• Sistemas tipo I
– Una sola enzima (multimérica), posee 3
subunidades
•
•
•
•
reconoce la secuencia específica de DNA,
metila y
restringe.
Pero la restricción no ocurre en el sitio de
reconocimiento,
– es al azar y
– en sitios distantes al de reconocimiento.
• Sistemas tipo III
– similar al sistema tipo I,
– utilizan una enzima oligomérica que realiza
todas las actividades enzimáticas,
– y rompen el DNA 25-27 bp más allá del
sitio de reconocimiento.
Tipos de Enzimas de Restricción
Tipos de Enzimas de Restricción
• Sistemas tipo II
• Enzimas diferentes realizan la
restricción y modificación.
• Sistemas tipo II
– La restricción ocurre en el sitio de
reconocimiento ó adyacente.
– Estas enzimas tipo II son las utilizadas en
el clonamiento de genes,
• romper el DNA en sitios específicos,
• y recuperar secuencias conocidas.
Tipos de Enzimas de Restricción
• Sistemas tipo II
– en ingeniería genética se prefieren
aquellos con extremos complementarios,
puesto que permiten la unión espontánea
del gen a clonar con el vector
– La nomenclatura que se sigue para
designar las enzimas de restricción es la
siguiente:
• Eco RI E = Escherichia, género
• co = coli, especie
• RI = indica cepa
– Se han identificado más de 2300
– Las enzimas tipo II, dependiendo de su
especificidad, al romper el DNA provocan
2 tipos de cortes:
• Cortes escalonados, dejando productos con
extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco
RI
• Cortes simétricos, dejando productos con
extremos ciegos Ej: Alu I
MICROORGANISMO
ENZIMA
SECUENCIA
Arthrobacter luteus
Alu I
AG· CT
TC· GA
Escherichia coli RY13
Eco RI
G· AATTC
CTTAA· G
Escherichia coli J62
Eco RV
GAT· ATC
CTA· TAG
Klebsiella neumoniae
Kpn I
GGTAC· C
C· CATGG
Nocardia otitiscaviarum
Not I
GC· GGCCGC
CG CCGG· CG
Haemophilus aegyptus
Hae III
RGCGC· Y
Y· CGCGR
Haemophilus
influenzae
Hinf I
G· ANTC
CTNA· G
Estudio de paternidad
Estudio de paternidad
Homocigotos
Heterocigotos
JOURNAL OF CLINICAL
MICROBIOLOGY, 1995,
p. 2155–2158 Vol. 33, No.
8
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DPTO. ESPECIALIDADES MEDICAS
Restriction Fragment
Length Polymorphism (RFLP)
Marcelo A. Castillo Navarrete, MsCs (c)
24 de Octubre de 2005