OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS NATURALES

OBTENCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS NATURALES DE ORIGEN VEGETAL
Ruiz-López Mario Alberto, Zamora-Natera Francisco, Rodríguez Macías Ramón y García
López
Pedro
Macedonio.
Departamento
de
Botánica
y
Zoología,
e-mail:
mruiz@cucba.udg.mx.
INTRODUCCION
En los niveles en los que se considera a la biodiversidad (genes, especies y ecosistemas),
México es considerado entre los países de mayor biodiversidad en el Mundo (megadiverso)
se estima que la cantidad de plantas existentes es de cerca de 30,000 especies (CONABIO,
1998). También es uno de los centros de origen y domesticación más importantes del
mundo, ya que al menos 120 especies de plantas han sido domesticadas (entre ellas algunas
de importancia alimentaria mundial, como el maíz, el frijol y el jitomate). Muchas de estas
especies de plantas han servido como alimento, en la medicina tradicional, en la elaboración
de saborizantes, colorantes y aromatizantes a escala comercial ya que una característica de
las plantas es su capacidad de sintetizar y almacenar metabolitos tanto primarios como
secundarios. Por lo que la utilidad de alguna especie vegetal en particular va a depender
fundamentalmente de sus componentes químicos.
Los metabolitos secundarios son compuestos de estructuras muy diversas y de bajo peso
molecular, son importantes en la defensa contra herbívoros y organismos fitopatógenos, en
la competencia contra otras plantas, establecimiento de simbiosis, atracción de
polinizadores y dispersores de semillas, además son protectores de la luz ultravioleta en
ambientes con alta incidencia de luminosidad (Sepulveda et al., 2003; Harborne, 1993;
Rhoades, 1979).
Los metabolitos secundarios se sintetizan principalmente en tejidos jóvenes, sin
embargo su distribución es variable en diferentes tejidos vegetales como una importante
estrategia de defensa y adaptación (Johnson et al., 1985; Makkar et al., 1991, Wink y
Hartmann 1982).
El tipo individual de metabolito secundario, generalmente está limitado a un estrecho
número de especies dentro de un grupo filogenético, lo que indica que no son esenciales
para el metabolismo primario.
Los metabolitos secundarios han sido utilizados por el hombre como control natural de
plagas, hierbas medicinales, saborizantes, aromatizantes, cosméticos, antioxidantes y
fuentes de fármacos, debido a su actividad biológica.
A continuación se presenta el No de estructuras de compuestos conocidos (Fuente: Wink,
2010:
COMPUESTO
No. de estructuras
Monoterpenos
2,500
Sesquiterpenos
5,000
Diterpenos
2,500
Triterpenos/esteroides/saponinas
5,000
Tetraterpenos
500
Policetidos
750
Poliacetilenos
1,500
Flavonoides/taninos
5,000
Fenilpropanoides/cumarinas/lignanos
2,000
Aminas
100
Alcaloides
21,000
Aminoacidos no proteicos
700
Glucosidos cianogenicos
60
Glucosinolatos
100
Lectinas
2,000
TERPENOS
Los terpenos son compuestos secundarios ampliamente distribuidos en la naturaleza,
principalmente en plantas y son constituyentes de aceites esenciales. La mayoría son
hidrocarbonos, con compuestos oxigenados como alcoholes, aldehídos o cetonas. Sus
unidades formadoras son los isoprenos, CH2=C(CH3)-CH=CH2 (C5H8)n, se clasifican de
acuerdo al número de unidades de isoprenos: monoterpenos (2) sesquiterpenos (3)
diterpenos (4) triterpenos (6) tetraterpenos (8)
Existen varios métodos para la obtención de terpenos sobre todo para la extracción de
aceites esenciales, de tipo terpenoides (monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos) que son
compuestos muy volátiles y por lo tanto arrastrables por vapor de agua, con aplicación en
numerosas industrias:
· Industria cosmética y farmacéutica: como perfumes, conservantes, saborizantes, principios
activos, etc.
· Industria alimenticia y derivadas: como saborizantes para todo tipo de bebidas, helados,
galletitas, golosinas, productos lácteos, etc.
· Industria de productos de limpieza: como fragancias para jabones, detergentes,
desinfectantes, productos de uso hospitalario, etc.
· Industria de plaguicidas: como agentes pulverizantes, atrayentes y repelentes de insectos,
etc.
Principales métodos utilizados para obtener aceites esenciales:
• Destilación en agua
•
Destilación con agua y vapor
•
Destilación con arrastre por vapor
•
Destilación por pirólisis o degradación térmica
•
La expresión o presión en frio
•
Percolacion en frio
•
Extracción en caliente (decocción)
•
Extracción con fluidos en estado supercrítico
METODOS ANALITICOS PARA LOS ACEITES ESENCIALES
Métodos cromatográficos
•
Análisis por cromatografía en capa fina (TLC)
•
Análisis por cromatografía de gases (GC)
•
Determinación cuantitativa de los componentes por GC-MS
Métodos espectroscópicos
•
Perfil espectroscópico o características específicas
•
Ultravioleta-Visible (UV-Vis)
•
Infrarrojo (IR)
•
Resonancia Magnética Nuclear de 13C-NMR
•
IRMS, SNIF-NMR
COMPUESTOS FENOLICOS
Químicamente los fenoles son compuestos que poseen un anillo aromático con uno o más
grupos hidroxilo (grupo fenol). Se sintetizan a partir de la fenilalanina (aa aromático).
No hay un procedimiento satisfactorio de extracción para todos los fenoles o para una
clase específica de los fenoles.
La solubilidad de estos compuestos está en función del tipo de solvente (polaridad) usado,
el grado de polimerización, la interacción con otros constituyentes y la formación de
complejos insolubles.
Los solventes más usados para la extracción son metanol, etanol, acetona, agua, acetato de
etilo, propanol, dimetilformamida y sus combinaciones.
No hay un método seguro para la cuantificación de compuestos fenólicos que sea aplicado
a todos los productos.
El análisis es influenciado por la naturaleza química, el método de extracción empleado, el
tamaño de partícula de la muestra y el tiempo y condiciones de almacén, así como el
método ensayado, y la presencia de sustancias de interferias como ceras, grasas, terpenos y
clorofilas
Métodos de Análisis y Cuantificación de Compuestos Fenólicos
Los ensayos pueden ser clasificados en los que determinan el contenido total de fenoles o
los que cuantifican un grupo o clase especifica de fenoles. Los métodos de Folin-Denis y el
de azul de Prusia son métodos usados para la determinación de fenoles totales. El método
de la vanillina es usado para catequinas y proantocianidinas. Asimismo se han desarrollado
técnicas cromatografías para identificar y cuantificar compuestos fenólicos específicos
Contenido de polifenoles de fuentes vegetales terrestre, acuática y marina con
potencial antioxidante (Ruiz-López et al., 2013).
El contenido de polifenoles totales se puede observar en el cuadro 2, existe mayor
variación entre la especie terrestre Solanum madrense que mostro el mayor contenido de
estos compuestos de 8.7 ± 0.5 mg de equivalentes de ácido gálico/g de muestra, seguido del
alga marina Sargassum liebmanni con 6.00 ± 0.35
que fue similar al lirio acuático
(Eichhornia crassipes) de 5.9 ± 0.38 mg de equivalentes de ácido gálico/g de muestra.
Cuadro 2. Contenido de polifenoles (mg de equivalentes de ácido gálico/g de muestra en
peso seco) en tres especies de diferentes hábitats.
Especie
Promedio
Solanum madrense Eichhornia crassipes Sargassum liebmanni
(terrestre)
(acuática)
(marina)
8.7 ± 0.5
5.9 ± 0.38
6.00 ± 0.35
Promedios ± desviación estándar, n = 5
Esos resultados son menores a los reportados en frutas y moras (arándanos, fresas, baya
de cuervo, aronia y frambuesa) que presentan altos valores de 12.4-50.8 mg EAG /g, pero
similar a frutas como manzanas y a hierbas medicinales como vara de oro (Solidago
virgaurea), sanguinaria (Achillea millefolium) y manzanilla (Matricaria chamomilla) con
valores reportados de 5.3-9 mg EAG /g. Sin embargo nuestras especies analizadas
presentan valores superiores de polifenoles a los reportados en cereales, como avena,
arroz, cebada y trigo (de 0.2-1.3 mg/g GAE) y a vegetales como cebolla, nabo, remolacha,
calabazas, zanahorias, jitomates chicharos y papas (de 0.4-6.6 mg/g GAE) (Kähkönen et al.,
1999).
ALCALOIDES
Los alcaloides son producidos por una gran cantidad de organismos, bacterias, hongos, y
animales, pero especialmente por plantas superiores entre el 10 y 25% de especies
vegetales tienen alcaloides (Acamovic et al., 2004). Es por esto que en el pasado el término
alcaloide fue asociado con plantas, por lo tanto estos compuestos son tóxicos a los
organismos que no los producen.
Además de las plantas, los alcaloides se encuentran en hongos, como la psilocibyna en el
género Psilocybe, y en animales, como la bufotenina en la piel de algunas especies de sapos y
algunos organismos marinos también contienen alcaloides (Hesse 2002).
Dependiendo de la planta, la máxima concentración de alcaloides se encuentra en las hojas,
frutos, semillas raíz o corteza, sin embargo en diferentes tejidos de la misma planta pueden
contener diferentes alcaloides (Acamovic et al., 2004).
Debido a sus efectos farmacológicos los alcaloides han sido utilizados por cientos de años
como medicamentos drogas de recreación o en rituales religiosos. Ejemplos son anestésicos
y estimulantes locales cocaína; psicodélicos psilocina; estimulante cafeína; analgésico
morfina; antibacterial berberina; anticancer vincristina; agente antihipertensión reserpina;
colinomimerico galatamina; agente espasmolisis atropina; vasodilator vincamina; antiarritmia quinidina; terapéutico anti-asma efedrina; y droga antimalaria quinina (Bansal
2003, Hesse 2002).
Además muchas drogas sintéticas y semisintéticas son modificaciones estructurales de los
alcaloides, los cuales son diseñados para mejorar o cambiar el efecto primario de la droga y
reducir los efectos secundarios no deseados (Van Wyk and Wink, 2004). Por
ejemplo, naloxona, un receptor antagonista opioide, es un derivado presente en el opio.
Debido a la similitud a moléculas que participan en la transmisión de las señales del
sistema nervioso, el efecto toxico de los alcaloides radica en su capacidad de bloquear
neuroreceptores, intermediarios de la transducción de la señal neuronal y canales iónicos
de los vertebrados (Van Wyk y Wink, 2004).
Extracción y aislamiento
Debido a la diversidad estructural de los alcaloides, no hay un método simple de
extracción de sus fuentes naturales. La mayoría de los métodos aprovechan la propiedad de
los alcaloides de ser solubles en solventes orgánicos, pero no en agua, y la tendencia
opuesta de sus sales. Muchos alcaloides pueden ser purificados de extractos crudos por
extracción acido-base.
Muchas plantas contienen varios alcaloides, primero se extraen todos mezclados y luego
se separan los alcaloides individuales. Las plantas deben ser cuidadosamente muestreadas
antes de la extracción de los alcaloides. Posteriormente se procesa el material crudo con
solución alcalina y se extraen los alcaloides basificados con solventes orgánicos, tales como
1,2-dicloroetano, diclorometano, cloroformo, éter dietílico o benceno. Luego, las impurezas
se disuelven por acidificación; los alcaloides son convertidos a sus sales para ser
purificados.
En la extracción acidificada el material crudo es procesado en una solución acidificada
débil (por ej. ácido acético en agua, etanol, o metanol). Luego se adiciona una base para
convertir los alcaloides a su forma básica para ser extraídos con solventes orgánicos.
METODOS ANALITICOS PARA LOS ALCALOIDES
Métodos cromatográficos
•
Análisis por cromatografía en capa fina (TLC)
•
Análisis por cromatografía de gases (GC)
•
Análisis por cromatografía de líquidos (HPLC)
•
Determinación cuantitativa de los componentes por GC-MS
Métodos espectroscópicos
•
Infrarrojo (IR)
•
Resonancia Magnética Nuclear de 13C-NMR
•
IRMS, SNIF-NMR
Contenido de alcaloides quinolizidinicos en las especies silvestres de lupinos de
Jalisco.
Se han realizado diversos estudios para conocer el contenido total e individual de
alcaloides del tipo quinolizidinco es las especies de lupinos nativos del estado de Jalisco,
encontrando lo siguiente:
Cuadro 3. Contenido de alcaloides quinolizidínicos en 7 especies silvestres de Lupinus del
occidente de México (mg de alcaloides/g de muestra, en base seca)
Especie
Esparteína
citisina
lupanina
3-oh lupanina
13-oh lupanina
L. exaltatus
0.028 ± 0.004
ND
5.83 ± 0.46
1.53 ± 0.19
ND
L. elegans
ND
ND
0.03±0.001
3.73 ± 0.175
ND
L. splendens
0.29 ± 0.048
ND
0.89 ± 0.1
1.05 ± 0.249
1.00 ± 0.133
L. reflexus
26.63 ± 1.136
ND
2.91 ± 0.03
0.16 ± 0.051
0.08 ± 0.018
L. rotundiflorus
0.11 ± 0.005
ND
11.5 ± 0.19
4.19 ± 0.427
ND
L. simulans
0.40± 0.007
ND
8.87 ± 0.183
2.76 ± 0.163
0.09 ± 0.012
L. spp
0.02 ± 0.001
ND
10.63 ±0.08
2.08 ± 0.113
0.03 ± 0.003
Los valores son medias ± desviación estándar (n = 3)
ND = no detectado
La presencia de lupanina se aprecia en las siete especies de lupinos estudiados. El mayor
contenido de este alcaloide se encontró en Lupinus rotundiflorus, Lupinus spp y L. simulans
de 11.5, 10.6 y 8.87 mg/g de muestra respectivamente, mientras que L. elegans presentó el
nivel más bajo (0.03 mg/g de muestra). La esparteína se encontró en seis de las especies
analizadas, la mayor concentración se cuantificó en L. reflexus con 26.63 mg/g de muestra,
mientras que en L elegans hubo ausencia de este alcaloide. La 3-hidroxilupanina se presentó
en todos lo lupinos, en niveles de 0.16 (L. reflexus) a 4.2 mg/g de muestra (L. rotundiflorus).
En L. exaltatus, L. elegans y L. rotundiflorus no se detectó 13-hidroxilupanina, el mayor
contenido de este alcaloide se encontró en L. splendens con 1.0 mg/g de muestra, mientras
que el menor fue para L. sp. con 0.03 mg/g de muestra. En ninguna de las especies
estudiadas se encontró citisina (Ruiz y Sotelo, 2001).
H
N
N
H
O
Lupanina
Figura 1. Espectro de masas y estructura de la lupanina (Fuente: Ruiz y Sotelo, 2001)
Cuadro 4. Variación del contenido de alcaloides quinolizidinicos en semillas de cuatro
especies mexicanas de lupinos de diferentes localidades (mg/g base seca)
Especie
Esparteina
Lupanina
13-hidroxilupanina
Multiflorina
L. mexicanus1
0.0080 ± 0.0001
5.56 ± 0.060
0.006 ± 0.002
0.140 ± 0.001
---
L. mexicanus2
0.0070 ± 0.001
4.70 ± 0.930
0.042 ± 0.030
0.200 ± 0.004
---
L. mexicanus3
0.0030 ± 0.001
4.90 ± 0.007
0.004 ± 0.000
0.030 ± 0.000
---
L. mexicanus4
0.0120 ± 0.001
5.06 ± 0.520
0.007 ± 0.007
0.016 ± 0.001
---
0.0075 ± 0.004
5.05 ± 0.370
0.015 ± 0.018
0.096 ± 0.090
L.exaltatus5
0.0030 ± 0.000
1.75 ± 0.10
0.006 ± 0.000
0.005 ± 0.000
---
L.exaltatus6
0.0040 ± 0.000
1.47 ± 0.00
0.010 ± 0.003
0.004 ± 0.000
---
L. exaltatus7
0.0030 ± 0.000
1.20 ± 0.01
0.030 ± 0.010
0.002 ± 0.000
---
0.0033 ± 0.000
1.47 ± 0.27
0.015 ± 0.013
0.004 ± 0.000
L. montanus8
3.50 ± 0.21
1.75 ± 0.32
0.110 ± 0.007
0.090 ± 0.002
0.013 ± 0.003
L. montanus9
4.47 ± 0.13
1.60 ± 0.051
0.190 ± 0.024
0.100 ± 0.003
0.050 ± 0.004
Media ± D.E,
Media ± D.E,
Angustifolina
L. montanus10
Media ± D.E.
L. stipulatus11
3.93 ± 0.05
1.60 ± 0.400
0.006 ± 0.000
0.027 ± 0.002
0.081 ± 0.006
3.97 ± 0.49
1.65 ± 0.090
0.102 ± 0.090
0.07 ± 0.004
0.048 ± 0.034
0.04 ± 0.01
0.10 ± 0.002
0.120 ± 0.004
0.2 0± 0.004
---
Los valores son medias ± D.E. de tres replicas
1= Lagos de Moreno, Jalisco 2006, 2= Manalisco, Jalisco, 2006, 3= Teoloyucan, Edo. de México, 2006,
4= Guanajuato, Guanajuato, 2006, 5= Cd. Guzmán, Jalisco, 2006, 6= Cd. Guzmán, Jalisco, 2007,
7=Zapopan, Jalisco, 2006, 8= Tonila, Jalisco, 2006, 9= Tonila, Jalisco 2007, 10= Bolaños, Jalisco, 2007,
11= Monte Escobedo, Zacatecas, 2007.
La lupanina, esparteína, 13-hidroxilupanina, y multiflorina se encuentran en todas la
muestras colectadas. Sin embargo la angustifolina se encontró solo en L. montanus (Ruiz et
al., 2010) lo que indica una posible relación quimiotaxonómica de esta especie con las
especies Europeas de lupinos L. angustifolius, L.albus y L. polyphyllus que contienen este
alcaloide (Wink et al., 1995; Kinghorn et al., 1980). Y al igual que la mayoría de especies
americanas de lupinos, la angustifolina no fue detectada en L. exaltatus, L. stipulatus y L.
mexicanus.
La lupanina fue el alcaloide mayoritario en todas las especies con excepción de L.
montanus, donde la esparteína fue el principal alcaloide (3.97 ± 0.49 mg/g) (Ruiz et al.,
2010). Este nivel de esparteína en L. montanus es más alto reportado para una especie de
Jalisco mayor a L. reflexus (2.66 mg/g) (Ruiz y Sotelo, 2001).
LITERATURA CITADA
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