inhibidores de sintesis de acidos grasos como agentes

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
kInt. Cl. : A61K 31/34
11 Número de publicación:
2 182 888
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ESPAÑA
A61K 31/335
A61P 31/00
A61P 33/00
k
TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 95909239.6
kFecha de presentación: 24.01.1995
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 738 107
kFecha de publicación de la solicitud: 23.10.1996
T3
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k
54 Tı́tulo: Inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos como agentes antimicrobianos.
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73 Titular/es:
k
72 Inventor/es: Dick, James D. y
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74 Agente: Sugrañes Moliné, Pedro
30 Prioridad: 24.01.1994 US 188421
THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY
720 Rutland Avenue
Baltimore, MD 21205-2109, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.03.2003
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
ES 2 182 888 T3
16.03.2003
Aviso:
k
k
Kuhajda, Francis P.
k
En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
ES 2 182 888 T3
DESCRIPCION
Inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos como agentes antimicrobianos.
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Antecedentes de la invención
Campo de la invención
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Esta invención se refiere al campo de la terapia antibiótica y antiparasitaria. En particular, esta
invención contempla la administración de inhibidores de la sı́ntesis o del metabolismo de los ácidos grasos
a pacientes que padecen infección o colonización microbiana o parasitaria.
Información precedente
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En los organismos inferiores, tales como levaduras y bacterias, la sı́ntesis de los ácidos grasos difiere
de la de los humanos. En bacterias (procariotas), el ensamblaje real de los ácidos grasos ocurre mediante
siete enzimas separadas. Estas enzimas son disociables libremente y se clasifican como sintasas de Tipo
II. El fármaco Tiolactomicina inhibe especı́ficamente a las ácido graso sintasas de Tipo II. La Tiolactomicina, (4S)(2E, 5E)-2,4,6-trimetil-3-hidroxi-2,5,7-octatrieno-4-tiolida, es una estructura antibiótica única
que inhibe las ácido graso sintasas disociadas, pero no multifuncionales. El antibiótico no es tóxico en
ratones y proporciona una protección significativa frente a infecciones bacterianas del tracto urinario e
intraperitoneales.
En los organismos superiores, sin embargo, han ocurrido sucesos de fusión génica entre las siete enzimas separadas de las bacterias. Esto tuvo como resultado unas enzimas multifuncionales para la sı́ntesis
de los ácidos grasos las cuales se clasifican como Tipo I. En levaduras, tales como S. cerevisiae, existen
dos polipéptidos distintos designados alfa y beta, que son responsables de la sı́ntesis de los ácidos grasos.
Los productos principales de la sı́ntesis de los ácidos grasos en levaduras son ácidos grasos saturados de
16 y 18 átomos de carbono producidos como derivados de la coenzima-A. En micobacterias, tales como
M. smegmatis, todas las actividades enzimáticas se encuentran en un gran polipéptido de 290.000 Da.
El producto de esta sintasa son ácidos grasos saturados de 16 a 24 átomos de carbono derivatizados a
la coenzima-A. En Mycobacterium patógenas, tales como las especies de Nocardia, existe una segunda
sintasa, la ácido micocerósico sintasa (SAM). Esta sintasa es responsable de ácidos grasos ramificados
de cadena muy larga. De manera importante, la SAM contiene una actividad de beta-cetoacil sintetasa
(enzima condensante) similar a la de las ácido graso sintasas de Tipo I.
Mientras que la Tiolactomicina es un inhibidor especı́fico de las ácido graso sintasas de Tipo II, la
cerulenina es un inhibidor especı́fico de las ácido graso sintasas de Tipo I. La cerulenina se aisló en
un principio como un antibiótico antifúngico potencial del caldo de cultivo de Cephalosporium Caerulens. Estructuralmente, la cerulenina se ha caracterizado como amida del ácido 2R,3S-epoxi-4-oxo-7,10trans,trans-dodecanoico. Se ha encontrado que su mecanismo de acción es la inhibición, mediante ligación
irreversible, de la beta-cetoacil sintasa, la enzima condensante requerida para la biosı́ntesis de los ácidos
grasos. La cerulenina se ha caracterizado como antifúngico, principalmente frente a Candida y Saccharomyces sp. Además, ha mostrado alguna actividad in vitro frente a algunas bacterias, antinomicetos, y
micobacterias, aunque no se ha encontrado actividad alguna frente a Mycobacterium tuberculosis. No se
ha evaluado la actividad de los inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos y de la cerulenina en particular frente a protozoos tales como Toxoplasma gondii u otros patógenos eucarióticos infecciosos tales
como Pneumocystis carinii, Giardia lamblia, Plasmodium sp., Trichomonas baginalis, Crytosporidium,
Trypanosoma, Leishmania, y Shistosoma.
A pesar de la actividad in vitro de la cerulenina frente a algunas bacterias y hongos, no se ha desarrollado como agente terapéutico. Hasta la fecha, la investigación sobre este compuesto se ha centrado en su
uso como una herramienta de investigación para investigar el papel de los ácidos grasos en el metabolismo
y la fisiologı́a de una variedad de organismos debido a su actividad como inhibidor de la sı́ntesis de los
ácidos grasos.
La razón para el uso de la inhibición de la ácido graso sintasa como una terapia tópica y sistémica
para diversas patologı́as se basa en el hecho de que la ruta biosintética de los ácidos grasos en el hombre
está normalmente infrarregulada debido al elevado contenido graso en nuestra dieta. En el hombre, puede
ocurrir una sı́ntesis significativa de ácidos grasos en dos sitios: el hı́gado, en donde el ácido palmı́tico libre
es el producto predominante (Roncari, Can. J. Biochem., 52:221-230, 1974); y las glándulas mamarias
lactantes, en las que predominan los ácidos grasos C10 -C14 (Thompson, y col., Pediatr. Res., 19:139-143,
1985). Excepto para la lactancia, y el ciclo del endometrio (Joyeux, y col., J. Clin. Endocrinol. Metab.,
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70:1319-1324, 1990), la ruta biosintética de los ácidos grasos tiene poca importancia fisiológica, dado que
la toma exógena de lı́pidos en la dieta infrarregula la ruta en el hı́gado y en otros órganos (Weiss, y col.,
Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367:905-912, 1986).
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Dado que la sı́ntesis de los ácidos grasos se produce a niveles insignificantes en humanos pero a niveles
elevados en diversos microorganismos patógenos, la ruta biosintética de los ácidos grasos proporciona ası́
pues un objetivo selectivo potencial para el desarrollo de terapias antibióticas y antiparasitarias.
En una realización, esta invención proporciona el uso de un inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos
en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células microbianas invasivas
seleccionadas del grupo constituido por Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis y Toxoplasma sp.
multirresistentes a los fármacos en un animal, siendo las citadas células dependientes de los ácidos grasos
sintetizados endógenamente, en donde el citado inhibidor es un inhibidor de la enzima ácido graso sintasa
de tipo 1.
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En otra realización, el medicamento se adapta para la administración sustancialmente no sistémica.
En un modo preferido, el inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos se formula en una composición
farmacéutica adecuada para aplicación tópica y se administra localmente para una terapia no sistémica.
En otro modo preferido, el inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos se formula en liposomas para la
administración como se describió arriba.
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Esta invención describe el uso de la inhibición de la biosı́ntesis de los ácidos grasos para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de diversos organismos patógenos y oportunistas los cuales se sabe
que experimentan una sı́ntesis endógena de ácidos grasos. Las concentraciones de un agente requeridas
para inhibir el crecimiento de estos agentes infecciosos in vitro indica un ı́ndice terapéutico potencial en
mamı́feros, especialmente el hombre. Además, algunos de estos agentes infecciosos, tal como la especie
M. tuberculosis, tienen ácido graso sintasas de Tipo I las cuales son estructuralmente similares pero no
idénticas a la ácido graso sintasa de los mamı́feros.
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Descripción detallada de la invención
I. Sı́ntesis de ácidos grasos en organismos inferiores
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La sı́ntesis de los ácidos grasos tanto en bacterias como en humanos requiere las siguientes siete funciones enzimáticas (Wakil, S.J., Biochemistry, 28: 4523-4530, 1989):
acetil transacilasa
malonil transacilasa
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beta-cetoacil sintetasa (enzima condensante)
beta-cetoacil reductasa
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beta-hidroxiacil deshidrasa
enoil reductasa
tioesterasa
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Aunque las bacterias y los mamı́feros comparten estas actividades enzimáticas, están organizadas de
manera diferente filogenéticamente. En bacterias, existen siete péptidos separados, cada péptido responsable de una actividad enzimática. Ésta se clasifica como ácido graso sintasa de Tipo II y se inhibe
mediante el fármaco Tiolactomicina. Por el contrario, las micobacterias, levaduras, y organismos superiores tienen condensadas estas actividades enzimáticas en péptidos con funciones enzimáticas múltiples.
Por ejemplo, las levaduras tienen dos polipéptidos separados mientras que en micobacterias y mamı́feros,
todas las siete actividades enzimáticas están presentes en un único polipéptido. Estas se designan como
ácido graso sintasas de Tipo I.
Usando ensayos de inhibición del crecimiento in vitro convencionales, los inventores han demostrado
que los inhibidores de la SAG de Tipo I, tales como Cerulenina, reducen el crecimiento de micobacterias
patógenas, tales como M. tuberculosis, incluyendo cepas multirresistentes a fármacos, y parásitos intra3
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celulares, tales como Toxoplasma gondii.
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La concentración de cerulenina usada para inhibir estos organismos in vitro, no es tóxica para los
fibroblastos humanos normales en cultivo. De hecho, T. gondii son parásitos intracelulares los cuales
se cultivan dentro de los fibroblastos humanos normales. La cerulenina es capaz de matar el parásito
intracelular sin dañar los fibroblastos humanos. Ası́ pues, la ruta sintética de los ácidos grasos endógena
es un objetivo selectivo para el desarrollo de la terapia antibiótica.
II. Tratamiento antimicrobiano basado en la inhibición de la sı́ntesis de los ácidos grasos
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La presente invención proporciona el uso de un inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células microbianas invasivas seleccionadas
del grupo constituido por Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis y Toxoplasma sp. multirresistentes
a los fármacos en un animal, siendo las citadas células dependientes de los ácidos grasos sintetizados
endógenamente, en donde el citado inhibidor es un inhibidor de la enzima ácido graso sintasa de tipo
1. Las infecciones o colonizaciones se pueden reducir en tales animales mediante la administración al
animal de uno o más de los inhibidores. Estos inhibidores inhiben el crecimiento o son citotóxicos para
las células microbianas las cuales experimentan la sı́ntesis de ácidos grasos, y la administración que tiene
como resultado la reducción de la sı́ntesis y utilización de los ácidos grasos por las células microbianas
reducirá la infección o colonización en el animal.
A. Selección de la población de pacientes
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El procedimiento de esta invención contempla el tratamiento de células microbianas que son dependientes de la sı́ntesis endógena de los ácidos grasos (es decir, ácidos grasos que se sintetizan dentro de
la célula). Los pacientes preferidos se pueden identificar porque están infectados o colonizados por un
organismo el cual se conoce que depende de la sı́ntesis endógena de los ácidos grasos. Estos organismos se
pueden identificar mediante cultivo, ensayo de antı́genos, técnicas de hibridación directa de ácidos nucleicos, tales como PCR, o mediante identificación microscópica de biopsias o fluidos del paciente. Además,
los pacientes se pueden identificar, mediante ensayos de susceptibilidad in vitro de organismos aislados
de estos pacientes usando inhibidores de la SAG de Tipo I u otros inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos
grasos, excluyendo los inhibidores de la ácido graso sintasa de Tipo II. Los organismos infecciosos que
son susceptibles a tratamiento con inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos incluyen Mycobacterium
tuberculosis, especialmente cepas multirresistentes a fármacos, y Toxoplasma sp.
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Las enfermedades infecciosas que son particularmente susceptibles al tratamiento mediante el uso de
esta invención son enfermedades que causan lesiones en superficies accesibles externamente del animal
infectado. Las superficies accesibles externamente incluyen todas las superficies que pueden alcanzarse
por medios no invasivos (sin cortar o perforar la piel), incluyendo la superficie dérmica misma, las membranas mucosas, tales como las que cubren las superficies nasal, oral, gastrointestinal, o urogenital, y
las superficies pulmonares, tales como los sacos alveolares. Las enfermedades susceptibles incluyen: (1)
micosis o tiñas cutáneas, especialmente si están causadas por Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton, o Mucocutaneous candidiasis; (2) queratitis micótica, especialmente si está causada por Aspergillus,
Fusarium, o Candida; (3) quetatitis amébica, especialmente si está causada por Acanthamoeba; (4) enfermedad gastrointestinal, especialmente si está causada por Giardia lamblia, Entamoeba, Crytosporidium,
Microsporidium, o Candida (más comúnmente en animales inmunocomprometidos); (5) infección urogenital, especialmente si está causada por Candida albicans o Trichomonas baginalis; y (6) enfermedad
pulmonar, especialmente si está causada por Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus, o Pneumocystis
carinii.
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Otras enfermedades infecciosas que son susceptibles al tratamiento mediante el uso de esta invención
son las infecciones sistémicas del animal. Estas incluyen Mycobacterium tuberculosis diseminada, infecciones parasitarias diseminadas, tales como T. Gondii e infecciones fúngicas diseminadas, tales como
Candida fungemia.
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B. Inhibición de la ruta sintética de los ácidos grasos
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Las células microbianas eucarióticas, las cuales dependen de sus propios ácidos grasos sintetizados
endógenamente, expresarán la SAG de Tipo I. Esto se demuestra tanto por el hecho de que los inhibidores de la SAG son inhibidores del crecimiento como por el hecho de que los ácidos grasos añadidos
exógenamente pueden proteger a las células del paciente normales pero no a estas células microbianas de
los inhibidores de SAG. Por consiguiente, los agentes los cuales previenen la sı́ntesis de los ácidos grasos
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por las células pueden usarse para tratar infecciones. En eucariotas, los ácidos grasos se sintetizan por
medio de la SAG de Tipo I usando los sustratos acetil CoA, malonil CoA y NADPH. Ası́ pues, otras
enzimas las cuales puedan alimentar sustratos en esta ruta también pueden afectar a la tasa de sı́ntesis
de ácidos grasos y por tanto ser importantes en microbios que dependan de los ácidos grasos sintetizados
endógenamente. La inhibición de la expresión o actividad de cualquiera de estas enzimas tendrá efecto en
el crecimiento de las células microbianas que dependen de los ácidos grasos sintetizados endógenamente.
De acuerdo con esta invención, se pude usar cualquier inhibidor de SAG de Tipo I para reducir la infección en mamı́feros. Además, dado que la beta-cetoacil sintasa (enzima condensante) es similar entre
la SAG de Tipo I y la ácido micercósico sintasa (SAM), se anticipa que la inhibición de la SAM también
puede reducir la infección en mamı́feros infectados por organismos los cuales expresan la SAM, tales como
micobacterias patógenas.
El producto de la SAG de Tipo I difiere en diversos organismos. Por ejemplo, en el hongo S. cerevisiae,
los productos son predominantemente palmitato y estearato esterificados a coenzima-A. En Mycobacterium smegmatis, los productos son ésteres CoA de ácidos grasos saturados cuya longitud varı́a desde
16 a 24 átomos de carbono. Frecuentemente estos lı́pidos se tratan adicionalmente para satisfacer las
necesidades celulares para diversos componentes lipı́dicos. Como se usa aquı́, el término (biosı́ntesis de
lı́pidos) se refiere a cualquiera de una combinación de pasos que ocurren en la sı́ntesis de los ácidos grasos
o tratamiento posterior de los ácidos grasos para fabricar componentes celulares que contienen ácidos
grasos. Un ejemplo de este paso es la ácido micoserósico sintasa (SAM), el cual está presente en micobacterias patógenas. Esta enzima es responsable de los ácidos grasos ramificados de cadena muy larga
vistos en micobacterias y especies Norcardia.
Puede esperarse que la inhibición de los pasos claves en el tratamiento aguas abajo o la utilización de
los ácidos grasos inhiba la función celular, si la célula depende de los ácidos grasos endógenos o utiliza los
ácidos grasos suministrados desde el exterior de la célula, y de este modo los inhibidores de estos pasos
aguas abajo pueden no ser lo suficientemente selectivos para las células microbianas que dependen de los
ácidos grasos endógenos. No obstante, se ha descubierto que la administración de inhibidores de Tipo I
de la sı́ntesis de los ácidos grasos a tales microbios los hace más sensibles a la inhibición por inhibidores
del tratamiento y/o utilización de los ácidos grasos aguas abajo. Debido a esta sinergia, la administración
de inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos en combinación con uno o más inhibidores de los pasos
aguas abajo en la biosı́ntesis y/o utilización de lı́pidos afectará selectivamente a las células microbianas
que dependan de los ácidos grasos sintetizados endógenamente. Las combinaciones preferidas incluyen
un inhibidor de la SAG y carboxilasa acetil CoA, o SAG y un inhibidor de la SAM.
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C. Inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos
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Cuando se ha determinado que un mamı́fero está infectado con células de un organismo el cual expresa
la SAG de Tipo I, o si se ha encontrado la SAG en un fluido biológico de un paciente, se puede tratar al
mamı́fero o al paciente administrándole un inhibidor de la sı́ntesis de ácidos grasos. Los inhibidores cuya
administración está dentro de la contemplación de esta invención pueden incluir cualquier compuesto que
muestre una inhibición demostrable de la biosı́ntesis o utilización de lı́pidos por una célula.
Cualquier compuesto que inhiba la sı́ntesis de los ácidos grasos se puede usar para inhibir el crecimiento celular microbiano, pero desde luego, los compuestos administrados a un paciente no deben ser
igualmente tóxicos para el paciente que para las células microbianas diana. Los inhibidores preferidos
para uso en el uso de esta invención son aquellos con ı́ndices terapéuticos elevados (el ı́ndice terapéutico es
la relación de la concentración la cual afecta a las células del paciente con la concentración la cual afecta
a las células microbianas diana). Los inhibidores con un ı́ndice terapéutico alto se pueden identificar in
vitro comparando el efecto del inhibidor en una lı́nea celular humana, tal como una lı́nea de fibroblastos
normales, con el efecto en células microbianas susceptibles las cuales han demostrado expresar niveles
altos de la SAG.
Por ejemplo, se puede determinar el ı́ndice terapéutico comparando la inhibición del crecimiento de
fibroblastos normales confluentes con la dosis de los compuestos que tienen como resultado la concentración inhibitoria mı́nima para un organismo dado. La CIM para Cerulenina y las cepas de tipo salvaje y
multirresistentes a fármacos de M. tuberculosis varı́a desde ≤ 1,5 hasta 12,5 µg/ml. Esta dosis de fármaco
puede ensayarse después sobre cultivos confluentes de fibroblastos humanos normales para determinar un
ı́ndice terapéutico.
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La sı́ntesis de lı́pidos consta de pasos enzimáticos múltiples. Los datos demuestran que la inhibición
de la biosı́ntesis de lı́pidos en dos o más pasos puede crear efectos sinérgicos, disminuyendo tanto la
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concentración requerida como la toxicidad potencial de cualquier paciente único. Cuando se tratan los
microbios mediante la administración de una combinación sinérgica de al menos un inhibidor de la sı́ntesis
de los ácidos grasos y al menos un inhibidor de las enzimas las cuales suministran sustratos para la ruta
de sı́ntesis de los ácidos grasos o de las enzimas que catalizan el tratamiento y/o utilización aguas abajo
de los ácidos grasos, el ı́ndice terapéutico será sensible a las concentraciones de los inhibidores de los
componentes de la combinación. La optimización de las concentraciones de los componentes individuales
mediante comparación de los efectos de mezclas particulares en lı́neas celulares humanas y células susceptibles es un asunto de rutina para el experto en la materia. La dosis de componentes individuales
necesaria para alcanzar el efecto terapéutico se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos
convencionales, teniendo en cuenta la farmacologı́a de los componentes individuales.
El inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos, o la combinación sinérgica de inhibidores se administrará a un nivel (basado en la dosis y duración de la terapia) por debajo del nivel que matarı́a al animal
en tratamiento. Preferiblemente, la administración se realizará a un nivel que no dañe a los órganos
vitales de forma irreversible, o no lleve a una reducción permanente en la función hepática, función renal,
función cardiopulmonar, función gastrointestinal, función genitourinaria, función integumentaria, función
musculoesquelética, o función neurológica. Por otra parte, no se excluye necesariamente la administración
de inhibidores a un nivel que mate algunas células las cuales se regeneraran posteriormente (por ejemplo,
células endometriales).
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La acetil CoA carboxilasa y la enzima condensante de los complejos de la SAG y la SAM son candidatos probables para la inhibición. La sı́ntesis de los ácidos grasos se reducirá o detendrá mediante
inhibidores de estas enzimas. Los resultados serán la privación de los lı́pidos de membrana, la cual causará la muerte celular. Las células humanas normales, sin embargo, sobrevivirán dado que son capaces
de importar y usar los lı́pidos circulantes. La acetil CoA carboxilasa es el punto principal para el control
de la biosı́ntesis de lı́pidos. La enzima condensante del complejo de la SAG está bien caracterizada en
cuanto a la estructura y la función; el centro activo contiene un cisteı́na tiol crı́tico, el cual es el objetivo
de los reactivos antilipı́dicos, tales como la cerulenina.
Una gran variedad de compuestos han demostrado inhibir a la SAG, y la selección de un inhibidor de la
SAG adecuado para el tratamiento de pacientes con carcinoma está dentro de las habilidades de un experto
normal en esta técnica. La actividad de la ácido graso sintasa se puede medir espectrofotométricamente
basándose en la oxidación dependiente de acetil- o malonil-CoA del NADPH, o radiactivamente midiendo
la incorporación de acetil- o malonil-CoA marcado radiactivamente. (Dils, y col, Methods Enzymol, 35:7483). Los inhibidores de la SAG adecuados se pueden seleccionar, por ejemplo, de entre aquéllos que se
citan como ejemplo en la Tabla 1.
TABLA 1
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Inhibidores representativos de las enzimas de la ruta de sı́ntesis de los ácidos grasos
Inhibidores del ácido graso sintasa:
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1,3-dibromopropanona
Reactivo de Ellman [5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), DTNB]
Nicotinato de 4-(4’-clorobenciloxi)bencilo (KCD-232)
Ácido 4-(4’-clorobenciloxi)bencilo (MII)
2-carboxilato de 2[5(4-clorofenil)pentil]oxirano (POCA) y su derivado CoA
anhı́drido etoxifórmico
tiolactomicina
cerulenina
fenilcerulenina
melarsoprol
iodoacetato
óxido de fenilarsina
pentostam
melittin
metil malonil CoA
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6
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Inhibidores de la citrato liasa:
5
(-)hidroxicitrato
(R,S)-S-(3,4-dicarboxi-3-hidroxi-3-metil-butil)-CoA
S-carboximetil-CoA
Inhibidores de la CoA carboxilasa:
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35
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setoxidim
haloxifop y su éster CoA
diclofop y su éster CoA
cletodim
aloxidim
trifop
ácido clofı́brico
2,4-D mecoprop
dalapon
glutarato de 2-alquilo
glutarato de 2-tetradecanilo (TDG)
ácido 2-octilglutárico
ácido 9-decenil-1-pentenodioico
ácido decanil-2-pentenodioico
ácido decanil-1-pentenodioico
(S)-ibuprofenil-CoA
(R)-ibuprofenil-CoA
fluazifop y su éster CoA
clofop
ácido 5-(tetradecicloxi)-2-furoico
ácido beta, beta’-tetrametilhexadecanodioico
tralcoxidim
ácido beta,beta (primer metilo sustituido) hexadecanodioico libre o su monotioéster (MEDICA 16)
alfa-ciano-4-hidroxicinamato
S-(4-bromo-2,3-dioxobutil)-CoA
p-hidroximercuribenzoato (PHMB)
N6,O2-dibutiril adenosina 3’,5’-monofosfato cı́clico
N6,O2-dibutiril adenosina 3’,5’-monofosfato cı́clico
N2,O2-dibutiril adenosina 3’,5’-monofosfato cı́clico
Derivado CoA del ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furoico (TOFA)
2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina
Inhibidores de la enzima málica:
3-aminopiridina adenina dinucleótido fosfato periodato oxidado
5,5’-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico)
p-hidroximercuribenzoato
N-etilmaleimida
ésteres oxalil tiol tales como S-oxalilglutationa
gosipol
fenilglioxal
2,3-butanodiona
bromopiruvato
pregnenolona
El fármaco melarsoprol es un compuesto arsénico trivalente; Pentostam es un compuesto de antimonio
pentavalente. Los compuestos de arsénico trivalentes reaccionan con los grupos tiol adyacentes al igual
que los compuestos de antimonio pentavalentes. La actividad de la ácido graso sintasa requiere múltiples
grupos tiol reducidos los cuales actuarı́an como objetivos para la inhibición por melarsoprol y otros reac7
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tivos SH.
5
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Aparte de estos fármacos antiparasitarios, hay un grupo de otros compuestos los cuales inhiben la
SAG en una variedad de sitios: los inhibidores de proteı́na kinasa bloquean la trascripción de la SAG en
células mamı́feras; la interferencia de la colchicina con los microtúbulos bloquea la inducción de la SAG
por insulina; melittin, un péptido del veneno de abeja se entrecruza con la acil proteı́na portadora de
la SAG de algunas especies; y cerulenina, un antibiótico, bloquea la actividad de la enzima condensante
de la SAG. Cerulenina es un inhibidor especı́fico de la actividad de la enzima condensante de la ácido
graso sintasa según demostró (Funabashi, y col, J. Biochem, 105:751-755, 1989) y cerulenina, formulada
en liposomas o para aplicación no invasiva como se describe debajo, es un inhibidor de la SAG preferido
para el procedimiento de esta invención.
Otros inhibidores preferidos de la enzima condensante incluyen un amplio intervalo de compuestos
quı́micos, que incluye agentes alquilantes, oxidantes, y reactivos capaces de sufrir intercambio disulfúrico.
El lugar de ligación de la enzima prefiere dienos E, E de cadena larga, tales como:
20
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En principio, un reactivo que contiene el dieno de cadena lateral mostrado arriba y un grupo el cual
muestra reactividad con aniones tiolato podrı́a ser un buen inhibidor de la enzima condensante. La
cerulenina (2S)(3R)2,3-epoxi-4-oxo-7,10 dodecadienoil amida es un ejemplo:
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35
Se muestran a continuación los ejemplos de compuestos alternativos con diferentes grupos funcionales
y la cadena lateral de dieno:
40
45
50
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60
8
ES 2 182 888 T3
5
10
15
X = Tosilo, haluro u otro grupo saliente
20
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35
40
45
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55
60
Se puede variar la cola del grupo R según el informe de Morisaki, y col. [Eur. J. Biochem. 211,
111(1993)]. Aumentar o disminuir la longitud de la cadena lateral reduce la potencia inhibidora. La
tetrahidrocerulenina es 80-150 veces menos potente que la cerulenina. Este resultado concuerda con la
idea de la importancia de los electrones π en la cadena lateral en el enlace. De igual modo, los dobles
enlaces trans confieren rigidez conformacional la cual puede también ser importante.
Los pacientes sépticos se pueden tratar administrando compuestos que inhiben la acetil CoA carboxilasa, la enzima málica o la citrato liasa. Se muestran también en la Tabla 1 los inhibidores representativos
9
ES 2 182 888 T3
de estas enzimas. Las consideraciones para la selección del inhibidor particular son las mismas que se
discutieron arriba para los inhibidores de la SAG.
5
En la Patente de Estados Unidos 5.143.907, incorporada aquı́ a modo de referencia, se enseñan los
ensayos de la acetil-CoA carboxilasa y los expertos pueden usar estos ensayos para determinar las constantes de inhibición para los inhibidores de la ACC mediante procedimientos bien conocidos.
Los propanoatos los cuales inhiben las acetil CoA carboxilasas de diversos organismos son inhibidores
preferidos. Los inhibidores se pueden representar mediante la estructura general mostrada debajo:
10
15
20
R puede ser hidrógeno, alquilo o arilo. La configuración en el átomo de carbono asimétrico puede ser R,
S, o racémico.
La acetil CoA carboxilasa de plantas es a menudo más susceptible al isómero R. R1 es frecuentemente
aril-oxi-arilo:
25
Ar—O—Ar—
30
Los anillos aromáticos pueden ser benceno, piridina, etc. Se permiten sustituyentes halo y otros
sustituyentes en los anillos aromáticos. Los ejemplos de propanoatos se muestran debajo y/o se listan en
la Tabla 1:
35
40
Fluazifop
45
50
Diclofop
55
60
Diclorprop
10
ES 2 182 888 T3
Algunos homólogos de los propanoatos son buenos inhibidores. Un ejemplo es el TOFA, ácido 5(tetradeciloxi)-2-furoico, un potente inhibidor de la acetil CoA carboxilasa. La estructura se muestra
debajo:
5
10
15
El C-2 en este caso no es quiral. El grupo R es una cadena lateral de 14 átomos de carbono saturada
lineal. La Patente de Estados Unidos 4.146.623, incorporada aquı́ a modo de referencia, enseña procedimientos de sı́ntesis de este compuesto y compuestos relacionados que también se contemplan en esta
invención.
Otro ejemplo de un homólogo de los propanoatos es el TDGA o ácido tetradecilglicı́dico:
20
R = CH3 (CH2 )-13
25
30
El carácter hidrófobo y un átomo carboxı́lico beta respecto a un oxı́geno éter son rasgos estructurales comunes. Otros propanoatos 2-sustituidos relevantes incluyen compuestos tales como ibuprofeno,
ibuproxam y derivados de los mismos.
35
40
Ibuprofeno
R = Isobutilo
45
Ibuproxam
R = Isobutilo
Los cetociclohexenos representan otra clase de inhibidores de la acetil CoA carboxilasa. Un ejemplo
es setoxidim:
50
55
Setoxidim
En donde R es un grupo etiltiopropilo.
60
Otra clase de compuestos los cuales inhiben a las acetil CoA carboxilasas se representan mediante la
estructura general:
11
ES 2 182 888 T3
CO2 H
|
R
|
CO2 H
5
Los ejemplos especı́ficos tales como el ácido glutárico y ácido pentenodioico se listan en la Tabla 1.
10
Además de la acetil CoA carboxilasa y la SAG, otras enzimas objetivo incluyen la citrato liasa y la
enzima málica. Estas enzimas proporcionan acetato y NADPH para la biosı́ntesis de lı́pidos por medio
de la SAG. Las reacciones respectivas son como sigue:
Citrato + ATP + CoA
→ Ac-CoA + ADP + Oxaloacetato
15
Citrato liasa
Malato + NADP
→ Piruvato + CO2 + NADPH
20
Enzima Málica
25
30
35
40
45
Los compuestos terapéuticos también se podrı́an basar en estos inhibidores dado que la privación de
acetil CoA o NADH también detendrı́a la sı́ntesis de lı́pidos.
De las enzimas en la ruta sintética de los ácidos grasos, la SAG es el objetivo preferido para la inhibición porque actúa solamente dentro de la ruta de los ácidos grasos, mientras que las otras tres enzimas
están implicadas en otras funciones celulares. Por lo tanto, la inhibición de una de las otras tres enzimas
afectará más probablemente a las células humanas normales. No obstante, donde un inhibidor para una
de estas enzimas puede mostrar tener un ı́ndice terapéutico alto como se describió arriba, se puede usar
el inhibidor terapéuticamente. El médico experimentado será capaz de seleccionar un procedimiento de
administración y administrar los inhibidores de cualquier enzima en la ruta sintética para los ácidos grasos
para tratar a los pacientes infectados identificados arriba, basándose en las enseñanzas de abajo.
Esta invención no contempla el uso de inhibidores que son inhibidores generalmente para un gran
número de sistemas enzimáticos celulares y rutas diferentes, tales como los fosfito-boranos descritos en la
Patente U.S. 5,143,907, o iodoacetamida a menos que el inhibidor particular se pueda hacer relativamente
especı́fico para la biosı́ntesis de lı́pidos según se muestra mediante un ı́ndice terapéutico alto (por ejemplo,
como parte de una combinación sinérgica discutida arriba).
La elongación y oxidación de los ácidos grasos puede ser crı́tica para la producción de los lı́pidos de
membrana necesarios. Para este propósito, los pasos de elongación y oxidación y cualesquiera otros pasos
de tratamiento para los ácidos grasos serán objetivos moleculares terapéuticos probables. Por ejemplo,
M. tuberculosis alarga los ácidos grasos usando la SAG; por consiguiente, la SAG es también un objetivo
preferido.
D. Administración de inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos
50
55
60
Los inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos se formulan preferiblemente en composiciones farmacéuticas que contienen al inhibidor y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición
farmacéutica puede contener otros componentes en tanto en cuanto los otros componentes no reduzcan la efectividad del inhibidor de la sı́ntesis de tal forma que se anule la terapia. Los portadores
farmacéuticamente aceptables son bien conocidos, y un experto en la técnica farmacéutica puede seleccionar fácilmente los portadores adecuados para las rutas de administración particulares (Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985). Las composiciones farmacéuticas que
contienen cualquiera de los inhibidores de esta invención se pueden administrar por la ruta parenteral (de
forma subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intrapleural, intravesicular o intratecal),
tópica, oral, rectal, o nasal, según se necesite a la vista de la elección del fármaco, tipo de infección, etc.
La concentración del agente activo en los portadores farmacéuticamente aceptables puede variar desde
0,1 µg/ml hasta 100 µg/ml. La dosis usada en una formulación o aplicación particular se determinará
12
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por los requerimientos del tipo particular de infección y las restricciones impuestas por las caracterı́sticas
y capacidades de los materiales portadores.
5
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15
20
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50
La dosis y duración de la terapia dependerá de una variedad de factores, incluyendo el ı́ndice terapéutico de los fármacos, el tipo de infección, la edad del paciente, el peso del paciente, y la tolerancia
a la toxicidad. La dosis se elegirá en general para conseguir concentraciones séricas desde alrededor de
0,1 µg/ml hasta alrededor de 100 µg/ml. Preferiblemente, los niveles de dosis iniciales se seleccionarán
basándose en su capacidad para alcanzar concentraciones ambientales que han mostrado ser eficaces contra el organismo objetivo in vitro, tal como el sistema modelo usado para determinar el ı́ndice terapéutico,
y modelos in vivo y en ensayos clı́nicos, hasta los niveles tolerados máximos. Más preferiblemente, la
terapia antimicrobiana se adaptará al paciente individual y la concentración circulatoria del agente antimicrobiano se seguirá de forma regular. Un médico experto podrá determinar la dosis de un fármaco
particular y la duración de la terapia para un paciente particular usando enfoques farmacológicos convencionales a la vista de los factores de arriba. La respuesta al tratamiento se puede seguir mediante análisis
de sangre o fluidos corporales para cultivo del organismo, detección del antigen, ensayos de hibridación
de ácidos nucleicos directos tales como PCR, o detección microscópica de organismos en biopsias tisulares
o en fluidos corporales. El médico experimentado ajustará la dosis o duración de la terapia basándose en
la respuesta al tratamiento revelada por estas mediciones.
En un modo preferido, el inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos se formula en una composición
farmacéutica y se aplica en una superficie accesible externamente del animal infectado. Las enfermedades
las cuales causen lesiones en las superficies accesibles externamente pueden tratarse mediante la administración no invasiva de un inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos. La administración no invasiva
incluye (1) aplicación tópica en la piel en una formulación, tal como una pomada o crema, la cual retendrá
al inhibidor en un área localizada; (2) administración oral; (3) administración nasal como aerosol; (4)
aplicación intravaginal del inhibidor formulado en un supositorio, crema o espuma; (5) administración
rectal por medio de un supositorio, irrigación u otros medios adecuados; (6) irrigación de la vejiga; y
(7) administración de una formulación aerosolizada del inhibidor al pulmón. La aerosolización se puede
conseguir mediante procedimientos bien conocidos, tales como los medios descritos en la Publicación de
Patente Internacional WO 93/12756, páginas 30-21, incorporada aquı́ a modo de referencia.
Una estrategia preferida es administrar estos compuestos local o tópicamente en geles, pomadas,
disoluciones, apósitos y vendajes impregnados, liposomas, o microcápsulas biodegradables. Las composiciones o formas de dosificación para aplicación tópica pueden incluir disoluciones, lociones, pomadas,
cremas, geles, supositorios, pulverizadores, aerosoles, suspensiones, polvos, apósitos y vendajes impregnados, liposomas, polı́meros biodegradables, y piel artificial. Los portadores farmacéuticos tı́picos los
cuales pueden completar a las composiciones anteriores incluyen alginatos, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, agarosa, pectinas, gelatinas, colágeno, aceites vegetales, aceites minerales, ácido esteárico, alcohol
estearı́lico, petrolato, polietilenglicol, polisorbato, polilactato, poliglicolato, polianhı́dridos, fosfolı́pidos,
polivinilpirrolidona, y similares.
Una formulación particularmente preferida para la sı́ntesis de los ácidos grasos es en liposomas. Se pueden preparar liposomas que contienen inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos según esta invención
mediante cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica para la preparación de liposomas que
contienen inclusiones moleculares pequeñas. En la Publicación de Patente Internacional WO 93/12756,
páginas 25-29, incorporada aquı́ a modo de referencia, se describen liposomas que son particularmente
adecuados para la aplicación en forma de aerosol a los pulmones.
Las composiciones descritas arriba se pueden combinar o usar juntas o en coordinación con otra sustancia antibiótica, antifúngica o antiviral.
E. Procedimiento quimioterapéutico selectivo
55
60
En una realización preferida, el uso de esta invención también protege a las células normales de los
pacientes tratados con los inhibidores de la sı́ntesis de los ácidos grasos. Para proteger los tejidos animales normales tales como el hı́gado (el cual expresa normalmente intervalos bajos de actividad de la
ácido graso sintasa) de la toxicidad potencial, el nivel de la enzima SAG y/o la actividad sintética de los
ácidos grasos puede infrarregularse antes y/o durante la terapia. La infrarregulación se puede conseguir
suministrando los ácidos grasos esenciales en la dieta, reduciendo la toma calórica o mediante otros procedimientos eficaces, tales como la administración de glucagon.
Dado que la SAG es una enzima inducible en los tejidos animales normales, la reducción de la toma
13
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5
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20
calórica tendrá como resultado una menor expresión de la SAG por las células del paciente. Las células
microbianas susceptibles generalmente expresan la SAG completamente. En un paciente con una toma
calórica limitada, la expresión de la SAG está limitada a las células microbianas, y el efecto citotóxico
de los inhibidores de la SAG se limitará de igual modo. La infrarregulación de la expresión de la SAG
está normalmente acoplada a la terapia con un inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos mediante la
reducción de la toma calórica del paciente antes y durante la administración del inhibidor.
Otro procedimiento adecuado para reducir la expresión de la SAG es la administración exógena de
ácidos grasos, preferiblemente, ácidos grasos esenciales. Estos ácidos grasos se pueden formular de cualquier forma que tenga como resultado la infrarregulación de la expresión de la SAG de las células del
paciente. Esto podrı́a lograrse incluyéndolos en la dieta del paciente o formulándolos en la misma composición farmacéutica que el inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos, o cualquier otro procedimiento
adecuado.
Las dietas adecuadas para reducir la expresión de la SAG en el tejido del paciente están fácilmente
dentro de la destreza de un médico ordinario. Cualquier procedimiento de reducción de la expresión de la
SAG por las células del paciente está contemplada en el procedimiento de esta invención, siempre que el
nivel de SAG en las células de paciente se reduzca durante el tiempo en el que el inhibidor de la sı́ntesis de
los ácidos grasos esté presente en el paciente en niveles que serı́an citotóxicos para las células microbianas
susceptibles.
Ejemplos
25
Los siguientes Ejemplos se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos. No tienen la intención
de limitar la invención descrita arriba, la cual sólo se limita por las reivindicaciones que se adjuntan.
Ejemplo 1
Susceptibilidad de M. tuberculosis
30
35
40
45
La susceptibilidad o resistencia farmacológica se determina mediante la versión modificada del procedimiento de proporción convencional. La proporción crı́tica para la resistencia se toma como 1 % para
todos los fármacos antituberculosis. La resistencia se determina mediante la comparación de la velocidad
de crecimiento en viales de control que contienen un inóculo del 1 % y viales de caldo que contienen el
fármaco de ensayo especı́fico. Se ha encontrado que este procedimiento es comparable al procedimiento
proporcional convencional o el procedimiento de la tasa de resistencia. De la misma forma se han obtenido
excelentes resultados en la exactitud y reproducibilidad de este procedimiento.
Se realizó la determinación de la actividad de cerulenina frente a M. tuberculosis utilizando un sistema
radiométrico disponible comercialmente el cual se basa en el mismo principio que se utiliza en los ensayos
de susceptibilidad de antibióticos convencionales de M. tuberculosis. La diferencia significativa respecto
a los procedimientos convencionales es que se usa un medio lı́quido y más que contar colonias tras aproximadamente 3 semanas de incubación, se sigue el crecimiento mediante la medición del metabolismo de
ácido palmı́tico marcado con 14 C a 14 CO2 radiométricamente estando disponibles los resultados en 3 a 5
dı́as.
Organismos
50
Se usó un organismo de control M. tuberculosis H37RV a lo largo de los estudios. Debido a la velocidad de crecimiento relativamente baja de M. tuberculosis H37RV, se usó una cepa de Candida albicans
la cual se sabe que es susceptible a cerulenina para controlar la concentración antibiótica ası́ como M.
tuberculosis H37RV. Los aislados restantes de M. tuberculosis fueron aislados clı́nicos de esta institución
o se refieren aquı́ como parte de un estudio de susceptibilidad cooperativo en cepas de M. tuberculosis
obtenidas de pacientes estudiados en Haitı́.
55
Procedimiento de ensayo de susceptibilidad para micobacterias
60
Se realizó el ensayo de susceptibilidad usando un medio de caldo Middlebrook 7H12 disponible comercialmente que contiene palmitato marcado con 14 C como sustrato indicador. Se determina el crecimiento
en este sistema mediante la medición de la generación de 14 CO2 . Se preparó una disolución inicial de
1 mg/ml de cerulenina y se diluyó hasta las siguientes concentraciones (µg/ml): 1.000, 500, 250, 125,
62,5. Después se añadieron 0,1 ml de las concentraciones iniciales a botellas Bactec de 4,0 ml indivi14
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5
10
15
duales resultando las siguientes concentraciones finales (µg/ml): 25, 12,5, 6,25, 3,0, 1,5. Para cada cepa
ensayada se añadieron 0,1 ml del organismo a cada botella a cada concentración ensayada, un control
directo (botella que contiene diluyente, DMSO, pero no antibiótico), y una disolución 1:100 de organismo
la cual también se añade a la botella de caldo que no contiene antibiótico. Se incubaron todas las botellas
de caldo a 35◦ C y se observaron diariamente las lecturas del Índice de Crecimiento (IC proporcional a
la cantidad de 14 CO2 generado). Se registraron los resultados hasta que el IC del control 1:100 alcanzó
30. En este momento, se determinó la mı́nima concentración inhibitoria del aislado. Los organismos de
control para cada serie de susceptibilidad incluyeron Candida albicans (CIM de cerulenina ≤ 1,5 µg/ml).
Se prepara una suspensión de 0,5 McFarland de C. albicans y se añadieron 0,1 ml de esta suspensión a
cada concentración de cerulenina en las botellas 12B Bactec.
Se determinó la concentración inhibitoria mı́nima de cada aislado usando los siguientes criterios. Una
vez que el ı́ndice de crecimiento (IC) de la botella de control 1:100 habı́a alcanzado un valor de 30, se
calculó el cambio (∆) en el ı́ndice de crecimiento para un perı́odo de un dı́a ası́ como el cambio del ı́ndice
de crecimiento (∆) a cada concentración ensayada durante el mismo perı́odo de 24 horas. Se definió la
CIM como la concentración de cerulenina mı́nima que produjo un cambio del ı́ndice de crecimiento menor
que el de la botella de control 1:100.
Resultados
20
25
Las tablas 2 y 3 muestran los resultados representativos de los ensayos de susceptibilidad de aislados
de M. tuberculosis susceptibles (H37RV) y multirresistentes (H389) a fármacos. La Tabla 4 muestra los
resultados de susceptibilidad de los aislados recuperados de pacientes haitianos usando la misma metodologı́a, frente a fármacos primarios y secundarios usados actualmente en el tratamiento de M. tuberculosis.
Como se puede ver cerulenina, en este sistema de ensayo de sensibilidad, tiene una actividad inhibitoria
frente a M. tuberculosis tanto susceptible como multirresistente a fármacos con concentraciones inhibitorias mı́nimas que varı́an desde <1,5 µg/ml hasta 6,25 µg/ml.
Ejemplo 2
30
Ensayo de susceptibilidad de toxoplasma
35
Se determinó la actividad de cerulenina frente a T gondii usando un sistema de cultivo tisular. Se
hicieron crecer taquizoitos de T. gondii en fibroblastos pulmonares humanos (lı́nea celular MRC-5) hasta
una concentración de ∼107 organismos/ml. Se realizó el ensayo de susceptibilidad en placas de cultivo
tisular de 24 pocillos que contenı́an fibroblastos de prepucio humanos (lı́nea celular ATCC Hs68) y concentraciones diluidas en serie de cerulenina y pocillos de control adecuados. Se determinó la concentración
inhibitoria mı́nima de T gondii como el pocillo que contenı́a la menor concentración de cerulenina en el
cual no hubo crecimiento de T. gondii en las 72 horas siguientes a la incubación.
40
Organismos
Se usó la cepa Toxoplasma gondii RH en todos los experimentos. Los taquizoitos de T. gondii RH se
mantuvieron congelados a -70◦ C y a través de paso en serie en células MRC-5.
45
Procedimiento de ensayo de susceptibilidad
50
55
60
Se hicieron crecer taquizoitos de T. gondii RF en fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5) en tubos
con tapón roscado de 12X150 mm en medio esencial mı́nimo (MEM) (Whittaker) complementado con 100
µg/ml de penicilina, 0,01 % de glutamina, 50 µg/ml de gentamicina, 0,01 % de tampón Hepes y 0,02 %
de suero bovino fetal. Tras la lisis visual (3-4 dı́as), se recogieron los sobrenadantes que contenı́an ∼107
taquizoitos y se usaron como inóculo para el ensayo de susceptibilidad. Se realizaron los ensayos en placas
de cultivo tisular de 24 pocillos que contenı́an fibroblastos de prepucio humanos (ATCC Hs68) en MEM
complementado. Se disolvió cerulenina (1 mg) inicialmente en DMSO y se disolvió posteriormente en
agua estéril para proporcionar concentraciones de 100 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, y 12,5 µg/ml. Para el
ensayo se añadieron 100 µl de cada concentración de cerulenina a un pocillo de cultivo tisular separado
que contenı́a 0,8 ml de MEM complementado más 100 de los taquizoitos de T. gondii (∼106 organismos)
crecidos como se describió previamente para un volumen final de 1 ml. Se incluyeron en cada serie de
ensayo los pocillos de control, uno sin contener cerulenina y otro conteniendo 10 % de DMSO-agua (100
µl). Se realizaron todos los ensayos de susceptibilidad por cuadruplicado. Se incubaron los paneles de
ensayo a 37◦ C y se observó diariamente la toxicidad, lisis de fibroblastos, y crecimiento de T. gondii de
los mismos.
15
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Resultados
5
Los ensayos repetidos de T. gondii en el sistema de susceptibilidad de fibroblastos descrito demostraron
una inhibición constante del crecimiento de taquizoitos de T. gondii en los pocillos de cultivo tisular que
contenı́an 2,5 µg/ml de cerulenina.
TABLA 2
Susceptibilidad de M. tuberculosis a Cerulenina
10
Lectura del ı́ndice de crecimiento
Organismo
Concentración
de Cerulenina
Dı́a
CIM
(µg/ml)
15
H155
Control 1:100
20
25
30
1
2
3
4
5
0
1
7
18
39
95
1,5
167
597
721
657
611
3,0
143
481
603
559
475
6,25
151
525
693
660
539
12,5
144
483
668
658
597
25
102
381
578
617
643
1
2
3
4
5
6
0
0
12
55
143
182
178
1,5
0
0
0
0
0
0
3,0
0
0
0
0
0
0
6,25
1
0
0
0
0
0
12,5
0
0
0
0
0
0
25
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
1
0
0
0
0
2
7
15
32
63
1,5
8
24
26
27
35
40
57
89
150
265
3,0
6
18
21
21
23
25
30
39
52
81
6,25
6
20
26
25
26
26
28
31
37
45
12,5
8
28
32
21
32
31
33
34
39
44
25
5
28
32
21
32
31
33
34
39
43
C. albicans
Control 1:100
35
6
7
8
9
10
≤ 1,5
7
8
9
10
≤ 1,5
40
45
H37RV
Control 1:100
50
55
60
16
3
ES 2 182 888 T3
TABLA 3
Susceptibilidad de M. tuberculosis a Cerulenina
Lectura del ı́ndice de crecimiento
5
Organismo
10
Concentración
de Cerulenina
8H31
Control 1:100
15
Dı́a
CIM
(µg/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
3
8
20
54
130
223
439
758
999
1,5
284
479
437
514
703
707
999
999
999
3,0
249
434
417
448
554
517
676
905
999
6,25
246
464
437
454
503
431
547
707
948
12,5
216
449
442
439
477
440
468
542
655
25
146
367
487
511
563
505
536
569
664
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
5
15
65
75
456
215
429
716
999
1,5
420
730
746
855
999
876
950
906
774
3,0
369
642
626
622
694
943
726
815
903
6,25
331
591
572
544
624
534
588
680
744
12,5
291
577
603
550
592
490
525
590
725
25
143
452
622
671
650
525
529
545
615
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0
4
13
36
82
193
291
568
912
999
1,5
154
338
371
437
629
661
986
999
999
3,0
166
368
375
381
494
479
665
954
999
6,25
141
311
303
322
377
347
439
607
869
12,5
167
441
457
460
505
441
502
588
761
25
86
302
409
452
532
478
539
617
745
10
3
20
25
2H339
Control 1:100
30
35
40
H389
45
Control 1:100
10
3
10
50
55
60
17
3
ES 2 182 888 T3
TABLA 4
Susceptibilidad de Mycobacterium tuberculosis a la cerulina y otros antibióticos antituberculosis
5
Aislado de
M. tuberculosis
INH 0,1
0,1 µg/ml
INH 0,4
0,4 µg/ml
STREP
2 µg/ml
ETH
2,5 µg/ml
RIF
2 µg/ml
PZA
100 µg/ml
CER
6,25 µg/ml
H37RV
S
S
S
S
S
S
S
8H31
R
R
S
S
R
S
S
2H339
S
S
R
S
S
S
S
Morgan JH1
S
S
S
S
S
S
Monkey JH2
S
S
S
S
S
S
H389
R
R
R
R
R
R
S
H433
R
R
S
S
S
S
S
S
S
10
15
20
25
H441
H039,5
30
35
S
6H32
R
H155
R
R
S
R
S
S
S
S
S
S
S = Susceptible
R = Resistente
40
45
50
55
60
18
ES 2 182 888 T3
REIVINDICACIONES
5
10
1. Uso de un inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos en la preparación de un medicamento para la
inhibición del crecimiento de células microbianas invasivas seleccionadas del grupo constituido por Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis y Toxoplasma sp. multirresistentes a los fármacos en un animal,
siendo las citadas células dependientes de los ácidos grasos sintetizados de forma endógena, en donde el
citado inhibidor es un inhibidor de la enzima ácido graso sintasa de tipo 1.
2. Uso según la reivindicación 1, en el cual el medicamento se adapta para la administración sustancialmente no sistémica.
3. Uso según la reivindicación 2, en el cual el citado inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos se
formula en una composición farmacéutica adecuada para la aplicación tópica.
15
4. Uso según las reivindicaciones 1, 2, ó 3, en el cual el citado inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos
grasos se formula en liposomas.
5. Uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el inhibidor es la cerulenina.
20
6. Uso según las reivindicaciones 1 a 5, en el cual el citado medicamento se adapta para la administración junto con la reducción de la expresión de la ácido graso sintasa del tejido del paciente.
7. Uso según la reivindicación 6, en el cual la reducción de la expresión de la ácido graso sintasa
consiste en reducir la toma calórica del citado paciente.
25
30
8. Uso según la reivindicación 6, en el cual la reducción de la expresión de la ácido graso sintasa
consiste en administrar una composición que contiene un ácido graso libre de cadena larga o acil glicerido
al citado paciente.
9. Uso según la reivindicación 8, en el cual la composición que contiene un ácido graso libre de cadena
larga o acil glicerido suministra los ácidos grasos esenciales al citado paciente.
10. Uso según las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el inhibidor de la sı́ntesis de los ácidos grasos
muestra una Ki para la inhibición de la sı́ntesis de los ácidos grasos menor que 10 µM.
35
40
11. Uso según la reivindicación 1, en el cual el medicamento está adaptado adicionalmente para la
co-administración con un inhibidor de la biosı́ntesis de lı́pidos.
12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual las células microbianas
son Toxoplasma sp.
45
50
55
60
NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE)
y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la
aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a
España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en
la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como
tales.
Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluı́da en la mencionada
reserva.
19