Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida

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Electroforesis de ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida
Introducción
La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de bajo peso
molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el trabajo con microsatélites
o SSR en la construcción de mapas de ligamiento, estudios poblacionales y en la selección
asistida por marcadores moleculares (MAS). Adicionalmente es una herramienta útil para el
aislamiento de pequeñas secuencias cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolución,
geles de agarosa.
La técnica consiste en la elaboración de una fina capa de gel de acrilamida adherida a una
lámina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la migración
responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y la concentración del gel. Las
secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad mientras que las grandes se
quedan atrás.
La técnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cámara de electroforesis, la
preparación de la solución de poliacrilamida y el llenado de la cámara, la pre-corrida del gel, la
corrida de las muestras y la tinción del gel.
Los geles de poliacrilamida pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son, se utilizan para
la corrida de microsatélites. Estos presentan altas concentraciones de urea (5M) y son corridos
a elevadas temperaturas (50-55oC), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan separadas
durante la electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los productos de PCR son
desnaturalizados, a fin de incrementar la resolución de la separación, mediante calentamiento a
95oC y tratamiento con formamida.
La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con bromuro de etidio
(geles de agarosa) o nitrato de plata, a través de autoradiografía utilizando “iniciadores”
marcados con radioisótopos en la reacción de PCR o mediante fluorescencia cuando se utilizan
geles de secuenciación. La detección mediante fluorescencia es el método analítico con mayor
sensibilidad, mientras que la detección radioactiva y mediante tinción con AgNO3 tienen
sensibilidad equivalente (Comincini et al. 1995, Christensen et al. 1999, Creste et al. 2001).
La detección en geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata ofrece, según nuestra
experiencia, la mejor relación costo-beneficio. Aunque laboriosa esta metodología ofrece una
alta resolución, requiere de equipos “poco” sofisticados. La detección mediante fluorescencia,
en contraste, es costosa pues requiere de equipos sofisticados, cuya adquisición sólo se justifica
en aquellos laboratorios que manejan grandes volúmenes de muestras. La detección radiactiva
requiere P32, el cual es costoso. Adicionalmente, este radioisótopo representa riesgos para la
salud por lo que su manejo en el laboratorio requiere de equipamiento de seguridad que
aumentan los costos de la detección.
Existen diversos protocolos para la tinción del ADN en geles de poliacrilamida con AgNO3
(Beidler et al. 1982, Bassam et al. 1991, Sanguinetti et. al. 1994). En este protocolo se sigue el
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método propuesto por Beidler et al. 1982, con pequeñas modificaciones. Estudios comparativos
han demostrado que este método tiene una alta sensibilidad de detección y exhibe poco
problemas de “background” en relación a otras metodologías (Creste et al. 2001). La tinción con
AgNO3 consta de varias etapas o pasos cuyos tiempos de incubación son críticos para la
obtención de buenos resultados. La preparación de soluciones para la tinción requiere agua de
excelente calidad (bidestilada y desionizada). Estas soluciones pueden ser reutilizadas un
número limitado de veces. Los pasos de lavado de los geles también requieren de agua
bidestilada.
De especial cuidado con la metodología de tinción con AgNO3 es todo lo relativo a la limpieza y
manejo de las cámaras de electroforesis utilizadas. El manejo de estas cámaras requiere de un
espacio de trabajo bien estructurado a fin de minimizar accidentes que podrían ocurrir durante
la preparación y corrida de los geles, el lavado de los vidrios, o los distintos pasos del proceso de
tinción. Aquí describimos el ensamblaje y preparación de dos modelos comerciales de cámaras
de electroforesis. Sin embargo, los principios son aplicables a otros modelos.
El tratamiento de desechos luego de los procesos de electroforesis y tinción son de vital
importancia a fin de evitar la contaminación de los espacios de trabajo y del personal. La
solución de AgNO3 debe ser precipitada con sales y filtrada antes de ser descartada en el
lavaplatos. Los restos de poliacrilamida, luego del desprendimiento de geles, al igual que todos
aquellos desechables en contacto con ella (servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser
depositados en bolsas plásticas aptas para incineración debidamente etiquetadas.
1. Montaje de la cámara de electroforesis preparación de la solución de poliacrilamida,
llenado del gel y pre-corrida del gel
En este segmento se explica el montaje de dos tipos de cámaras de electroforesis, una es de BioRad modelo Sequi-Gen® GT Systems, que a diferencia de la segunda tiene un compartimiento
detrás del vidrio al que no se adhiere el gel, el cual va lleno del buffer de corrida TBE. Esto
permite que la corriente circule a través del sistema y caliente el vidrio a una temperatura
controlada y homogénea en toda su superficie. El segundo modelo es una cámara de
secuenciación dual de CBF Scientific, esta es una cámara de electroforesis tradicional compuesta
por dos vidrios que se unen mediante cinta adhesiva a los que se le ajusta una lámina de
aluminio que permite el calentamiento controlado del gel. Ambas cámaras comparten el
tratamiento de los vidrios pero se diferencian en el ensamblaje y corrida del gel.
La preparación de las cámaras y geles debe hacerse utilizando siempre guantes ya que la
acrilamida en una substancia neurotóxica que se absorbe por la piel.
Lo ideal es trabajar en espacios separados, uno donde se trabaja el vidrio donde va adherido el
gel un espacio diferente para trabajar el otro vidrio.
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1.1. Materiales
- Baldes de 8 L
-Bandejas plásticas con tapa (70cm largo, 60cm ancho,10cm de profundidad)
-Beakers (250 mL, 500mL, 1L, 2L, 4L)
-Cinta adhesiva para cubrir las placas de PCR
-Embudos
-Frascos ámbar (4L)
-Gafas de protección
-Gaza
-Gradillas
-Guantes de látex
-Guantes de nitrilo
-Magnetos
-Papel filtro Whatman 1 y 2
-Peines tiburón 68 pozos y 100 pozos
-Probetas (10 mL, 100mL, 500mL, 1L, 2L)
-Soporte para pipetas
-Tapas para placas flexibles
-Termómetro
-Toallas Kimwipe
-Tubos de micro-centrifuga (1-2 mL)
-Vidrios adicionales para cámaras de electroforesis vertical
1.2. Equipos
-Balanza analítica
-Balanza digital
-Baño María
-Bloque térmico
-Bomba de vacío
-Campana de extracción
-Cámara de electroforesis vertical
-Escáner
-Congelador -20 °C
-Congelador -80 °C
-Nevera 4°C
-Fuente de poder 3000 V
-Horno microondas
-Microcentrifuga
-Máquina de hielo
-Ph-metro digital
-Pipetas 0.2-2 uL, 1-10 uL, 20-200 uL, 100-1000 uL
-Pipeta multicanal (Hamilton) para servir muestras en el gel de acrilamida (1-Placa de agitación
-Termociclador
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1.3. Reactivos
-Acido acético glacial
-Ácido bórico
-Acetato de potasio
-Acetato de sodio
-Acrilamida
-Agua deionizada, agua bidestilada
-Azul de bromofenol
-Bind silane
-Bis-acrilamida
-EDTA
-Etanol grado molecular
-Etanol técnico
-Formaldehido (37%)
-Formamida redestilada
-Nitrato de plata
-Persulfato de amonio
-SIGMACOTE o Repel-silane
-TBE 10X
-TEMED
-Tiosulfato de sodio
-Trizma base
-Urea
-Xylene Cyanol
1.4 Preparación de Soluciones
A) Soluciones de poliacrilamida
Acrilamida 6%, 5 M de urea (1 L)
Reactivo
Cantidad
Acrilamida
57 g
Bis Acrilamida
3 g
TBE 10X
50 ml
Urea
300,3 g
Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 4% , 5 M urea (1L)
Reactivo
Cantidad
Aclilamida y bisacrilamida
40 g
TBE 10X
50 ml
Urea
300,3 g
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Acrilamida:bisacrilamida (19:1) al 6% , 5 M urea (1 L)
Reactivo
Cantidad
Aclilamida y bisacrilamida
60 g
TBE 10X
50 ml
Urea
300,3 g
Notas:
En todos los casos, disuelva la acrilamida en 500 ml de agua doblemente deionizada tibia y agregue el
TBE, después agregue la urea y complete el volumen.
Filtre la acrilamida con papel Whatman 2
Prepare la solución en la campana de extracción con máscara de protección y guantes.
Evite exponer a la luz
Almacene la solución a 4 °C.
B) Etanol-Ácido Acético (50 ml)
Reactivo
Cantidad
Etanol grado molecular 95%
Acido acético glacial
50 mL
Notas:
Agregue el ácido acético a la solución en la campana de extracción.
Almacene la solución a temperatura ambiente.
C) Persulfato de amonio 10% (50 ml)
Reactivo
APS (NH4)2 S2O8
H2O deionizada
Cantidad
5g
50 ml
Notas:
Evite exponer la solución a la luz.
Almacene a 4 °C.
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D) TBE 10X (1L)
Reactivo
Trizma Base
Ácido bórico
EDTA 0.5M
Cantidad
108 g
55 g
40 mL
Notas:
Ajuste el volumen con agua destilada.
Almacene la solución a temperatura ambiente.
Cámara de electroforesis modelo Sequi-Gen® GT System (Bio-Rad)
Figura 1. Cámara de electroforesis modelo Sequi-Gen GT System (BioRad)
I. LAVADO DE LA CÁMARA
Lavado del vidrio
1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabón (detergente líquido diluido o ALCONOX).
2. Deje secar a temperatura ambiente.
3. Limpie la cara donde irá adherido el gel con etanol técnico al 96%, 2 veces con toallas
comunes, 1 vez con toallas Kimwipe.
Lavado de la cámara
1. Limpie con agua el vidrio de la cámara.
2. Deje secar el agua.
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3. Limpie con etanol al 96%, 2 veces con toallas de papel comunes, 1 vez con toallas
Kimwipe.
Preparación del vidrio
1. Mezcle 1 mL de solución de etanol-ácido acético (etanol 95% y acido acético 0,5%) con 3
uL de Bind Silane (Pharmacia Biotech, código No 17-1330-01).
2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherirá el gel, utilizando una
toalla Kimwipe.
3. Deje secar durante 5 min.
Preparación de la cámara
1. Distribuya 100 uL de Sigmacote o, en su defecto, 300 uL de Repel Silane sobre el vidrio
de la cámara, utilizando una toalla Kimwipe.
2. Deje secar durante 5 min.
II. ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA Sequi-Gen® GT System (Bio-Rad)
1. Limpie los separadores con etanol al 96% y colóquelos en los bordes laterales del vidrio
de la cámara.
2. Coloque el vidrio (cara tratada) sobre la cámara.
3. Coloque los brazos, cuidando que queden al mismo nivel de la base de la cámara y el
vidrio.
4. Coloque la base.
III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA
1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extracción) :
- 100 mL de solución de acrilamida (4% o 6%)
- 600 uL de persulfato de amonio al 10%
- 100 uL de TEMED (GibcoBRL, No. catálogo 15524-010)
La mezcla debe hacerse rápidamente y con suavidad para evitar la formación de burbujas.
2.
3.
4.
5.
Llene la jeringa y elimine las burbujas
Conecte la manguera a la jeringa, e inyecte rápidamente la solución de acrilamida.
Introduzca el peine entre el vidrio y la cámara, y ajuste con ganchos metálicos.
Deje polimerizar por 1 hora.
IV. PRE-CORRIDA DEL GEL
1.
2.
3.
4.
Retire la base de la cámara.
Lave el vidrio, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo.
Coloque la cámara sobre la cubeta y llénela con TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE).
Retire el peine.
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5. Conecte la cámara a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 mA) y espere hasta alcanzar
45 ºC de temperatura.
6. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de
poliacrilamida.
7. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajústelo con
ganchos metálicos.
8. Limpie nuevamente el frente de corrida
9. Sirva entre 1 y 2 uL de solución Stop en varios de los pozos.
10. Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 mA) durante 20 min o hasta alcanzar 50oC,
observando el recorrido de la solución Stop.
Cámara de secuenciación Dual de altura Ajustable (CBS Scientific).
Figura 2. Cámara de electroforesis CBS Scientific
I. LAVADO DE LA CÁMARA
Lavado del vidrio sin pestaña
1. Lave el vidrio por ambos lados con gasa y jabón (Detergente líquido, diluido o
ALCONOX).
2. Deje secar el vidrio.
3. Limpie la cara donde se adherirá el gel 3 veces con etanol al 96%.
Lavado del vidrio con pestaña
1. Limpie con agua.
2. Deje secar el agua.
3. Limpie con etanol al 96%, tres veces.
Preparación del vidrio sin pestaña
1. Mezcle 1 mL de solución de etanol-ácido acético (etanol 95% y acido acético 0,5%) con 3
uL de Bind Silane (Pharmacia Biotech, código No 17-1330-01).
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2. Distribuya la mezcla por la cara del vidrio en la que se adherirá el gel, utilizando una
toalla Kimwipe.
3. Deje secar durante 5 min.
Preparación del vidrio con pestaña
1. Distribuya 100 uL de Sigmacote o, en su defecto, 300 uL de Repel Silane sobre el vidrio
de la cámara, utilizando una toalla Kimwipe.
2. Deje secar durante 5 min.
II. ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE SECUENCIACIÓN DUAL DE ALTURA AJUSTABLE (CBS
SCIENTIFIC)
1. Limpie los separadores con etanol al 96% y póngalos en los bordes laterales del vidrio
con pestaña.
2. Coloque el vidrio sin pestaña (cara tratada) sobre el vidrio con pestaña.
3. Selle con cinta adhesiva los lados y el borde inferior de los vidrios. Hágalo con una sola
tira de cinta, reforzando la parte inferior.
4. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 a cada lado).
III. PREPARACION DEL GEL DE ACRILAMIDA
1. Mezcle (preferiblemente en la campana de extracción)
- 100 mL de solución de acrilamida (4% o 6%)
- 600 uL de persulfato de amonio al 10%.
- 100 uL de TEMED (GibcoBRL, No. catálogo 15524-010)
La mezcla debe hacerse rápidamente y con suavidad para evitar la formación de
burbujas.
2. Acueste los vidrios sobre la mesa.
3. Presione los vidrios a los lados con los ganchos (3 de cada lado).
4. Recline los vidrios sobre el borde inferior derecho con una inclinación de 45o y
lentamente vierta la acrilamida entre los vidrios.
5. Introduzca el peine entre los vidrios, y presione con ganchos.
IV. PRE-CORRIDA DEL GEL
1. Retire la cinta adhesiva de la base (borde inferior).
2. Lave los vidrios, a nivel del frente de corrida, con gasa o esponja de brillo.
3. Coloque la placa metálica sobre el vidrio con pestaña (antes de esto determine el nivel
al que debe ir la placa).
4. Coloque los vidrios (+ placa) sobre la cubeta de buffer inferior y ajústelos a la cubeta
superior con ganchos.
5. Llene las cubetas de TBE 0,5X (prepare 2 L de TBE).
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6. Retire el peine.
7. Conecte el dispositivo a la fuente de poder (110 W, 3000 V, 400 mA) y espere hasta
alcanzar 45ºC de temperatura.
8. Detenga la fuente de poder y limpie el frente de corrida de urea y restos de
poliacrilamida.
9. Coloque el peine con los dientes hacia abajo para formar los pozos, y ajústelo con
ganchos metálicos.
10. Limpie nuevamente el frente de corrida.
11.
12. Realice pre-corrida (110 W, 3000 V, 400 mA) durante 20 min observando el recorrido de
la solución Stop.
2. Corrida del gel (se aplica a los dos modelos de cámara)
2.1. Preparación de soluciones
A) Solución Stop
Solución Stop
Formamida redestilada
EDTA (0,5 M)
Azul de bromofenol
Xylene Cyanol
H2O deionizada
Concentración en
solución de trabajo
95%
20 mM
0,05%
0,05%
Volumen para 200 mL
190 mL
8 mL
0,1 g
0,1 g
2 mL
Notas:
1. Utilice guantes.
2. Almacene la solución a 4 °C.
2.2. Protocolo
1. Agregue 5 uL de solución Stop a cada uno de los productos de PCR (producto con un
volumen final de 10 a 20uL).
2. Desnaturalice las muestras (productos PCR) a 95 ºC durante 2 min.
3. Colóquelas sobre hielo inmediatamente.
4. Detenga la pre-corrida.
5. Retire la urea que se ha acumulado en los pozos utilizando una jeringa (sin la punta
metálica) llena de buffer. Inyecte rápidamente el buffer en los pozos teniendo en cuenta
de no introducirles burbujas.
6. Coloque entre 2,5 a 3 uL de muestra por pozo. En caso dado de que los pozos se vuelvan
a llenar de urea, límpielos individualmente utilizando una pipeta de 100uL.
7. Retire el peine, una vez que las muestras han recorrido 2 cm dentro del gel.
8. Corra las muestras (110 W, 3000 V, 400 mA) durante aproximadamente 2h.
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Notas:
1. Toda manipulación de acrilamida debe hacerse con guantes.
2. La solución de Stop también se trabaja con guantes pues contiene sustancias tóxicas.
3. Los PCR con solución Stop pueden ser almacenados a -4°C y reutilizados para otras electroforesis en geles de acrilamida e incluso en geles de agarosa.
4. El calor daña los peines, por esto es importante retirarlos a tiempo del gel.
3. Tinción de geles con Nitrato de plata
3.1. Soluciones de trabajo
A) Solución Fijadora y de Parada (cantidades para preparar 3,5 L)
Reactivo
Cantidad
Ácido Acético
Agua deionizada
350 ml
3,65 L
Notas:
Prepare la solución en la campana de extracción,
Utilice guantes de látex.
Almacene la solución a temperatura ambiente.
B) Solución de tinción (cantidades para preparar 3,5 L)
Reactivo
Cantidad
Nitrato de plata
Formaldehído (37%)
Agua deionizada
3,5 g
4,5 ml
3,5 L
Notas:
Evite exponer la solución de AgNO3 a la luz.
Prepare la solución en la campana de extracción.
Utilice guantes de látex.
Almacene la solución a temperatura ambiente.
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C) Revelador (cantidades para preparar 3,5 L)
Reactivo
Cantidad
Carbonato de sodio
Formaldehido (37%)
Tiosulfato de sodio
Agua deionizada
105 g
4,5 ml
650 ul
3,5 L
Notas:
Evite exponer la solución a la luz.
Agregue el formaldehído a la solución en la campana de extracción.
Almacene a 4 °C.
D) Tiosulfato de sodio (10 ml)
Reactivo
Tiosulfato de sodio
H2O deionizada
Cantidad
0,1 g
10 ml
Notas:
Evite exponer la solución a la luz.
Almacene a 4°C.
3.2. Protocolo
La tinción del gel con nitrato de plata consiste de 7 pasos sucesivos:
1. Fijación: Sumerja el gel durante 20 min en solución fijadora (ácido acético 10%).
Nota. En este punto el gel puede permanecer un poco más de tiempo, hasta una hora.
2. Lavado con dH2O: Espere a que escurra bien el gel del paso anterior y sumérjalo en agua
bidestilada o deionizada y agítelo suavemente. Repita esto tres veces con cambio de
agua entre lavado. Cada lavo tiene una duración de 2 minutos, si en el último lavado
nota restos de ácido acético (manchas grasosas sobre el gel) repita una vez más el
lavado.
3. Tinción: Escurra bien el agua del gel y sumérjalo en la solución de nitrato de plata
durante 30 min. Es importante que el gel permanezca tapado durante este paso por que
la luz oscurece el gel.
4. Lavado con dH2O: Escurra bien el gel, sin tardarse y sumérjalo en agua bidestilada o
deionizada durante 10 segundos. Este es un paso crítico pues aquí se está retirando el
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exceso de nitrato de plata, si no lo lava bien la tinción saldrá muy oscura, si lo lava
mucho se pierde la nitidez de las bandas.
5. Revelado: Escurra un poco el gel y sumérjalo en la solución reveladora (Carbonato de
sodio + formaldehído 37% + Tiosufato de sodio). Esta solución debe estar entre 18 y
20°C. Agite suavemente hasta que aparezcan las bandas de ADN (3 a 5 min). Este paso
es crítico, el gel se va oscureciendo lentamente y se empiezan a ver las bandas de ADN,
después se hace más rápida la tinción y se hace más difícil de frenar.
6. Fijación/Parada: Escurra el gel y sumérjalo en la solución de parada (ácido acético 10%).
En este paso el gel puede permanecer un par de horas.
7. Lavado con dH2O: Escurra bien el gel y sumérjalo en agua bidestilada o deionizada
durante 5 min, hasta eliminar los rastros del ácido acético.
Notas:
1. Los distintos pasos de la tinción se realizan en bandejas plásticas con tapas plásticas o de
madera. El nitrato de plata es sensible a la luz por esto las bandejas y las tapas deben ser
opacas.
2. Las soluciones de fijación y tinción pueden usarse hasta 10 veces, mientras que la de revelado
solo 4.
3. La solución de revelado debe almacenarse en frio, 4°C. Las otras soluciones se guardan a
temperatura ambiente.
4. Esta técnica es muy sensible a los tiempos de incubación de cada paso y a la temperatura y
calidad de la solución de revelado.
5. La tinción con plata involucra la manipulación de reactivos tóxicos como lo es el nitrato de
plata, el formaldehido y el ácido acético, por ello se deben emplear guantes, mascarilla para la
boca y gafas. También es una buena alternativa trabajar las soluciones peligrosas en cámara de
extracción.
4. Desprendimiento de geles
Los vidrios de las cámaras de electroforesis son reutilizables, por esto después de extraer los
datos del gel (llenar planillas de microsatelites con datos de alelos por ejemplo y escanear el gel
para tener un soporte gráfico), se desprenden los geles del vidrio utilizando una solución de
NaOH altamente concentrada. Este proceso debe hacerse en cámara de extracción y con
guantes pues los vapores del NaOH son peligrosos.
4.1. Reactivos
-Hidróxido de sodio
-Agua deionizada
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4.2. Preparación de soluciones
A) NaOH 5% (para 4 litros)
Reactivo
NaOH
H2O deionizada
Cantidad
200 g
4L
Notas:
Complete el volumen con agua destilada y esterilice en el autoclave.
Almacene la solución a 4°C.
4.3. Protocolo
1. Sumerja el vidrio en NaOH al 5% durante un par de horas.
2. Remueva el gel pasando suavemente la mano por el vidrio.
3. Lavar el vidrio inmediatamente con abundante agua. Esto se puede hacer fuera de cámara.
Nota: no olvide usa guantes y trabajar en cámara de extracción.
5. Tratamiento de desechos
5.1. Precipitación de la solución de plata
5.2. Protocolo
1.
2.
3.
4.
Agregue a la solución de plata 5 g de NaCl por litro de solución.
Incube durante 24 h.
Filtre con papel de filtro Whatman 1.
Descarte la solución acuosa en el lavaplatos y el precipitado en los desechos de
poliacrilamida.
Nota: El resto de las soluciones, ácidos y el revelador se pueden desechar en el lavaplatos.
6. Tratamiento de cámaras contaminadas
6.1 Protocolo
1. Cubra la zona contaminada con un pedazo de gasa empañado en NaOH al 10%.
2. Espere 20 min y lave la cámara con abundante agua.
3. Cubra el vidrio de la cámara con una fina capa del producto que esté utilizando para
repeler el gel (Sigmacote, Repel u otro) un par de veces.
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7. Anexos
7.1. Anexo1: Cuidado a tener con el manejo de la poliacrilamida
Protección personal
Todo el personal que ingrese al laboratorio debe tener bata y zapatos cerrados.
La manipulación de soluciones y equipos del laboratorio (utensilios que estén en contacto con la
poliacrilamida, cámaras de electroforesis, lavaplatos) se debe hacer con guantes de látex.
Es recomendable utilizar guantes de nitrilo para la manipulación de la poliacrilamida y la solución
de NaOH.
La preparación de la solución de poliacrilamida se debe hacer en la campana de extracción con
máscara y guantes de nitrilo.
En caso de contaminación con poliacrilamida se deben hacer lavados con abundante agua.
Notificar al responsable del laboratorio. Acudir al médico si se presenta malestar.
Área de trabajo para la preparación de geles de poliacrilamida
Debe estar separada del área de trabajo donde se hacen PCR, extracciones y preparan reactivos y
debe estar identificada.
Debe permanecer limpia. Se recomienda hacer jornadas de limpieza frecuentes, según el uso que
se le de al laboratorio.
No deben ponerse libros, cuadernos, etc., en las superficies donde se trabaje con poliacrilamida.
Cuidados a tener con la solución de poliacrilamida.
La solución de poliacrilamida debe almacenarse en una nevera a 4 °C en botellones de vidrio
opaco. El botellón debe etiquetarse con el tipo de solución (relación de acrilamida: bis-acrilamida,
% de la solución, concentración de urea), la fecha de preparación y el responsable de la
preparación.
Desechos
Los desechos de poliacrilamida y todo material desechable que esté en contacto con ella se
descartan en bolsas plásticas, debidamente etiquetadas, que son selladas con cinta adhesiva y
llevadas a incineración.
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7.2. Anexo 2: organización del área de trabajo
El área de trabajo debe contar con:
-Dos mesones, uno para el tratamiento de las cámaras de electroforesis y otro para los vidrios.
Esto con el fin de evitar la contaminación de las cámaras. Los mesones deben cubrirse
preferiblemente con plástico para evitar la contaminación y facilitar la limpieza de los mismos.
-Un lavaplatos, con dimensiones apropiadas para el lavado de los vidrios y cámaras de
electroforesis. El desagüe debe estar provisto de una rejilla para evitar el paso de poliacrilamida
sólida a la tubería.
-Una campana de extracción para colocar permanentemente la bandeja con NaOH para el
desprendimiento de geles; para manipular el SIGMACOTE, el TEMED (en la mezcla de reactivos
para la polimerización del gel), el ácido acético glacial (preparación del etanol –ác. acético y de las
soluciones fijadora y de parada) y el formaldehído 37% (para la preparación del revelador).
-Un agitador, con las dimensiones apropiadas para poner en agitación las bandejas de tinción
(opcional).
-Una plancha de calentamiento para la desnaturalización del ADN.
-Una bomba de vacío para filtrar las soluciones de poliacrilamida.
8. Bibliografía
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Como citar este protocolo:
Duina Posso Duque y Thaura Ghneim. Electroforesis de ácidos nucléicos en geles de poliacrilamida.
Protocolos de laboratorio UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). 2009. Instituto Venezolano
de Investigaciones Científicas, Altos de Pipe- Venezuela.
Protocolos de laboratorio UEG 2009
Por: Duina Posso Duque y Thaura Ghneim