El descubrimiento de Lawsonia intracellularis

SIMPOSIO EUROPEO SOBRE ENTERISOL® ILEITIS | 13-15 DE OCTUBRE DE 2005 | BARCELONA
Steven McOrist, Connie Gebhart
El descubrimiento de Lawsonia intracellularis
Dr. Steven McOrist
QAF Industries, Corowa, NSW 2646, Australia
Dr. Connie Gebhart
Facultad de Veterinaria, Universidad de Minnesota, St. Paul, EE.UU
abcd
Introducción
observados en el intestino de los cerdos mediante microscopía electrónica y técnicas de tinción especiales.
El agente etiológico de la enteropatía proliferativa porcina
(EP, ileítis) es la bacteria intracelular obligada Lawsonia
intracellularis, que crece preferentemente en el citoplasma
de las células epiteliales del intestino. El crecimiento de
esta bacteria se ve acompañado invariablemente por la
proliferación localizada de las células inmaduras de las
criptas que son infectadas. Hasta el momento no se ha
logrado cultivar a Lawsonia en un medio sin células, probablemente porque depende de los trifosfatos sintetizados en las mitocondrias celulares o de una fuente de
energía similar localizada en la célula hospedadora para
satisfacer sus necesidades metabólicas. Este fenómeno de
“parasitismo energético” es similar al de otras bacterias
intracelulares obligadas como algunas especies de clamidias y rickettsias, aunque Lawsonia no está emparentada
con dichas bacterias.
Historia de la investigación de la ileítis
Harry Biester y otros investigadores del Veterinary Medical
Research Institute de Ames, Iowa, EE.UU., fueron los primeros en describir allá por los años treinta las lesiones de la
enteropatía proliferativa en los cerdos. Sus trabajos facilitaron una descripción anatomopatológica de las lesiones y
planteaban la hipótesis de que podían estar asociadas con
las dietas ricas en grano y pobres en vitaminas, comunes en
la época. Los trabajos publicados a partir de entonces y
hasta la década de 1950 aportaron una serie de descripciones de casos en Escandinavia y otros lugares, también centrados en los aspectos anatomopatológicos. A finales de la
década de los años sesenta, los métodos de explotación
intensiva irrumpieron con fuerza en la industria porcina y
con ellos los antibióticos incorporados en el pienso como
la tilosina, cambios que probablemente propiciaron un
aumento del contagio de Lawsonia y la aparición de poblaciones de cerdos sensibles a ella. Esto potenció un mayor
número de descripciones clínicas y anatomopatológicas,
fruto de los trabajos de
varios investigadores de la
Universidad de Edimburgo,
Allan Rowland, Giles
Rowntree y Gordon Lawson,
que investigaban los grandes brotes acontecidos en el
Reino Unido. Como parte de
esta labor, dichos investigadores desarrollaron un programa de investigación
productiva y examinaron los
cambios proliferativos
Allan Rowland
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Rowland, Rowntree y Lawson descubrieron la presencia
habitual de pequeñas bacterias curvas en el interior de las
células proliferativas anómalas al examinar la ultraestructura
de las lesiones o emplear tinciones de plata (ver Rowland y
Lawson 1974). Estas bacterias eran bacilos vibrioides gramnegativos, curvados o rectos, de extremos puntiagudos o
romos, y 1,25-1,75 µm de largo y 0,25-0,43 µm de ancho.
Las bacterias permanecían normalmente libres en el citoplasma apical de las células epiteliales infectadas y no aparecían unidas a la membrana durante las etapas principales
de la infección. Un primer experimento de transmisión con
mucosa homogeneizada afectada por la enteropatía proliferativa, extraída de un caso natural y administrada como un
inóculo oral, arrojó resultados positivos (ver Roberts et al
1977), indicando que dichas bacterias eran los agentes causantes de las lesiones. Sin embargo, posteriores intentos
para repetir el experimento, incluso con el mismo inóculo
por parte de los citados investigadores, resultaron infructuosos. Este problema de inóculos fallidos, recurrente en varios
estudios posteriores realizados en el marco de la enteropatía
proliferativa en EE.UU., Australia y otros lugares, se atribuyó
a la pérdida de título infeccioso durante la permanencia en
los contenedores de muy baja temperatura de la época.
Algunos de estos primeros trabajos citan a la bacteria intracelular como organismo afín a Campylobacter, una designación basada exclusivamente en la similitud morfológica con
este género. A lo largo de muchos años de trabajo, diversas
especies de Campylobacter, en particular C. mucosalis, C.
hyointestinalis, C. jejuni, “C. hyoilei” (después considerada
una variante de C. jejuni) y C. coli, fueron aisladas de las
lesiones proliferativas en cultivos puros por distintos grupos
de investigación que perseguían la identificación del presunto agente causal. Las lesiones proliferativas características o
la colonización intracelular, empero, no aparecían tras inocular estas bacterias a los cerdos. Todos los ensayos realizados con una amplia gama de cerdos (de distintas edades,
individuos gnotobióticos, libres de patógenos específicos,
etc.) y de técnicas de exposición a las bacterias no produjeron resultados significativos. Esta larga cadena de experimentos fallidos se prolongó durante los años setenta y
ochenta y dio rienda suelta a hipótesis sobre la implicación
de virus, especies de Chlamydia o agentes infecciosos
dobles. En realidad, las especies de Campylobacter eran
agentes secundarios oportunistas que aprovechaban las
condiciones alteradas del intestino para colonizarlo, de ahí
su aumento en las lesiones de la enteropatía proliferativa.
Este fenómeno de colonización por bacterias oportunistas
no es exclusivo de la enteropatía proliferativa y puede observarse en otras enfermedades intestinales que afectan al
cerdo como la disentería porcina.
El descubrimiento de la bacteria intracelular en el marco de
la enteropatía proliferativa porcina condujo a los investigadores a detectar la presencia de agentes infecciosos afines
en lesiones similares de la ileítis proliferativa observada en
hámsters de laboratorio en EE.UU. (ver Frisk y Wagner 1977).
Los estudios de exposición subsiguientes realizados en
hámsters culminaron con éxito. Los hámsters eran afectados
por las bacterias intracelulares obtenidas de las lesiones
provocadas por la enteropatía proliferativa tanto en cerdos
como en individuos de su propia especie, un claro indicio de
que ambos hospedadores se veían afectados por el mismo
agente causal. Por desgracia, los estudios de cultivo y de
otro tipo realizados con estos roedores durante los años
setenta y ochenta y destinados a identificar el microorganismo correcto, Lawsonia, resultaron tan infructuosos como los
estudios realizados en cerdos.
El descubrimiento de Lawsonia intracellularis
Los estudios de antígenos y los estudios de exposición fallidos de finales de los años ochenta descartaron que la bacteria intracelular causante de la enteropatía proliferativa
fuera una especie de Campylobacter de vida libre. El claro
ciclo de vida intracelular que mostraba el microbio llevó a
pensar en la posibilidad de que se tratara de una bacteria
intracelular obligada, con ciertas semejanzas con algunas
especies de rickettsias, una hipótesis que se materializó en
diversos intentos de cultivar las bacterias intracelulares en
células de cultivo a partir de inóculos obtenidos de las
lesiones de la enfermedad. El primer informe de cocultivo
de Lawsonia en una estirpe celular cultivada se remonta a
1978, en concreto al grupo de Robert Jacoby, que investigaba la enteropatía proliferativa en hámsters. Después del fracaso de los trabajos con Campylobacter de los años
ochenta, este trabajo pionero de cultivo celular fue redescubierto y retomado a principios de los noventa por Hal Stills
y Connie Gebhart en EE.UU. y por Gordon Lawson y Steven
McOrist en Escocia. Stills publicó la primera descripción de
un cultivo de bacterias Lawsonia a partir de casos de enteropatía proliferativa en hámsters en 1991, pero por desgracia una clamidia no patógena sin ninguna relación con el
patógeno de interés contaminó los cultivos, por lo que no
se pudieron practicar inoculaciones a los animales y realizar
los trabajos taxonómicos con el auténtico agente causal. La
identidad de la bacteria y su papel etiológico en la enteropatía proliferativa porcina se resolvieron finalmente en
1993 gracias al cultivo del microorganismo intracelular en
células cultivadas y a la reproducción de la enfermedad en
cerdos mediante un cultivo puro de este agente infeccioso
(ver Lawson et al. 1993, y McOrist et al. 1993). Ese mismo
año se dilucidó también su posición taxonómica (ver
Gebhart et al. 1993), la bacteria recibió el nombre de
Artículo publicado en Nature en
1973.
Bacteria intracelular y de morfología curva asociada a la proliferación de las células epiteliales en la
enteropatía proliferativa.
Reseña de uno de los primeros trabajos
Lawsonia intracellularis y fue incluida en la familia
Desulfovibrionaceae (ver McOrist et al., 1995). El nombre de
Lawsonia se escogió para honrar la labor y la perseverancia
del veterinario escocés Gordon Lawson, cuya contribución
resultó fundamental para su descubrimiento. El desarrollo
del cocultivo de Lawsonia exigió especial precaución en la
localización de la fuente del material de enteropatía proliferativa y en las técnicas de extracción, así como en la atmósfera y las técnicas de mantenimiento, las técnicas de pase y
la reducción de contaminaciones en el cultivo celular, amén
de muchos otros detalles. El desarrollo de los estudios de
exposición requirió considerar detalladamente el origen de
los cerdos y de su flora bacteriana, etc. Y dada la naturaleza
endémica del agente infeccioso entre las piaras que podían
utilizarse como fuente de los cerdos de los estudios, los
ensayos de exposición tuvieron que realizarse bajo un control minucioso para detectar los casos espontáneos de
enteropatía proliferativa entre los controles negativos.
Características de Lawsonia intracellularis
Lawsonia intracellularis presenta una morfología bacilar
vibrioide, curva o recta, con extremos puntiagudos o
romos, y mide 1,25 – 1,75 µm de largo y 0,25-0,43 µm de
ancho. La pared celular trilaminar es típica de las bacterias
gramnegativas y no se han observado fimbrias o esporas.
Algunas cepas cultivadas en estirpes celulares presentan un
único flagelo polar, largo y de motilidad pulsátil, pero sólo
cuando la bacteria se encuentra en el medio extracelular.
Lawsonia tiene un solo cromosoma circular de pequeño
tamaño y tres megaplásmidos que suman un total de 1,72
millones de pares de bases de ADN y 1324 marcos de lectura abiertos (genes funcionales). El pequeño tamaño del
genoma, la respiración dependiente de la célula hospedadora (“parásito energético”) y el bajo cociente G+C de su
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La explosión de la investigación sobre la
enteropatía proliferativa
Una vez identificado el agente causal de la enteropatía proliferativa a mediados de los años noventa, los grupos citados
y muchos otros grupos de investigación europeos y norteamericanos comenzaron a trabajar con celeridad en aspectos
más prácticos de la enfermedad para la industria porcina.
Cuestiones como la sensibilidad de Lawsonia a diferentes
antibióticos, su epidemiología dentro y entre las explotaciones porcinas y los métodos de diagnóstico en cerdos, por
citar algunas, fueron objeto de investigación (ver Knittel et
al, 1998). En 1994 se iniciaron los trabajos para diseñar una
vacuna contra la ileítis que desembocaron en el registro de
la primera vacuna (Enterisol® Ileitis, Boehringer Ingelheim)
siete años después. Hoy esta eficaz vacuna está registrada
en un gran número de países y se utiliza en todo el mundo
(ver Guedes y Gebhart 2003, y Kroll et al. 2004). El rápido
desarrollo de la vacuna contra la ileítis contrasta con el lento
ritmo de desarrollo de otras vacunas destinadas a importantes enfermedades intestinales del ganado porcino como la
disentería y la colibacilosis porcina.
Fotografía obtenida con microscopía electrónica de transmisión de Lawsonia
intracellularis en el interior de una célula cultivada del epitelio intestinal. Se
observa la pared celular típica de una bacteria gramnegativa y la morfología de
bacilo vibrioide.
ADN, así como la expresión significativa de proteínas de
choque térmico gro EL, son características que comparte
con otras bacterias intracelulares obligadas y simbiontes. El
análisis genómico ha permitido localizar varios genes que
codifican para el flagelo, genes de biosíntesis de folato y
otros genes bioquímicos bacterianos habituales. Los grandes megaplásmidos se han descrito en otras bacterias
intracelulares, como algunas especies de Brucella. A pesar
de su inclusión en la familia Desulfovibrionaceae, realizada
a partir del análisis de la secuencia de ADN, no parece
poseer capacidad sulfatorreductora. Un hecho destacable es
que, a diferencia de las especies del género Desulfovibrio,
parece haber adquirido un mecanismo activo de entrada en
la célula y otro mecanismo para actuar sobre las células
hospedadoras diana in vivo. Las colonias de L. intracellularis
aisladas en cerdos y las de otros orígenes y especies hospedadoras (hámster, caballo, cérvidos) muestran un alto grado
de semejanza (>98%) en las secuencias de ADN de regiones
de importancia taxonómica clave y en las proteínas de la
pared celular, lo que hace factible la existencia de una sola
“cepa” homogénea de L. intracellularis. Estos rasgos indican
que los considerables cambios genéticos producidos a partir de Desulfovibrio o de otros antepasados bacterianos han
tenido lugar recientemente, porque la aparición de distintas
“cepas” requiere cierto tiempo para desarrollarse y ser
detectada.
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La bacteria
Lawsonia intracellularis
Referencias seleccionadas
Frisk, C. S. and Wagner, J. E. (1977):
Experimental hamster enteritis: An electron microscopic study.
Am J Vet Res 38: 1861–1868.
Gebhart, C. J.; Barns, S. M.; McOrist, S.; Lin, G.-F. and Lawson, G. H. K.
(1993):
Ileal symbiont intracellularis, an obligate intracellular bacterium of porcine intestines showing a relationship to Desulfovibrio species.
Int J Syst Bacteriol 43: 533 – 538.
Guedes, R. M. C. and Gebhart, C. J. (2003):
Onset and duration of fecal shedding, cell-mediated and humoral
immune responses in pigs after challenge with a pathogenic isolate or
attenuated vaccine strain of Lawsonia intracellularis.
Vet Microbiol 91: 135 – 145.
Knittel, J. P.; Jordan, D. M.; Schwartz, K. J.; Janke, B. H.; Roof, M. B.;
McOrist, S. and Harris, D. L. (1998):
Evaluation of antemortem polymerase chain reaction and serologic
methods for detection of Lawsonia intracellularis-infected pigs.
Am J Vet Res 59: 722 – 726.
Kroll, J.; Roof, M. B.; and McOrist, S. (2004):
Evaluation of protective immunity in pigs following oral administration
of an avirulent live vaccine of Lawsonia intracellularis.
Am J Vet Res 65: 559 - 565.
Lawson, G. H. K.; McOrist, S.; Sabri, J. and Mackie, R. A. (1993):
Intracellular bacteria of porcine proliferative enteropathy: Cultivation
and maintenance in vitro.
J Clin Microbiol 31: 1136 – 1142.
McOrist, S.; Jasni, S.; Mackie, R. A.; MacIntyre, N.; Neef, N. and
Lawson, G. H. K. (1993):
Reproduction of porcine proliferative enteropathy with pure cultures of
ileal symbiont intracellularis.
Infect Immun 61: 4286 – 4292.
McOrist, S., Gebhart, C. J.; Boid, R. and Barns, S. M. (1995):
Characterization of Lawsonia intracellularis gen. nov., sp. nov., the obligately intracellular bacterium of porcine proliferative enteropathy.
Int J Syst Bacteriol 45: 820 – 825.
Roberts, L.; Rowland, A. C. and Lawson, G. H. K. (1977):
Experimental reproduction of porcine intestinal adenomatosis and
necrotic enteritis.
Vet Rec 100: 12 – 13.
Rowland, A. C. and Rowntree, P. G. M. (1972):
A haemorrhagic bowel syndrome associated with intestinal adenomatosis in the pig.
Vet Rec 91: 235 – 241.
Rowland, A. C. and Lawson, G. H. K. (1974):
Intestinal adenomatosis in the pig: Immunofl uorescent and electron
microscopic studies.
Res Vet Sci 17: 323 – 330.
Stills, H. R. (1991):
Isolation of an intracellular bacterium from hamsters (Mesocricetus
auratus) with proliferative ileitis and reproduction of the disease with a
pure culture.
Infect Immun 59: 3227 – 3236.
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