Objetivos de la clase Definir la resistencia a fungicidas. Resistencia a fungicidas. Conocer los diferentes tipos de resistencia. Conceptos y manejo Curso de Control Químico de enfermedades de plantas. 12 de abril de 2012 Dr. Pedro Mondino Objetivos de la clase Resistencia natural o inherente Conocer que clases o grupos de fungicidas poseen riesgo de desarrollo de resistencia. Conocer en que tipos de enfermedades existe mayor riesgo de desarrollo de resistencia. Comprender como se desarrolla la resistencia en individuos y en poblaciones de hongos. Comprender que el desarrollo de la resistencia es una respuesta al patrón de uso del fungicida. Estar capacitado para retrasar o manejar el desarrollo de resistencia en las enfermedades de alto riesgo. Espectro de acción Benomil (p.a.) Patógeno DE50 mg/l Pythium ultimum 100 Mucor mucedo 100 Penicillium chrysogenum 0,2 Botrytis cinerea 0,4 Fusarium oxysporum 4 Espectro de acción Typhula Blight (Gray) Take-All Patch Snow Molds Microdochium Patch (Pink) Yellow Patch ETRI Summer Patch Waitea Patch Brown Patch Leaf Spot Pythium Blight Fairy Ring Dollar Spot Algae Anthracnose Efectividad Resistencia adquirida Rhizoctonia Diseases mancozeb 1. % P. italicum resistentes a TBZ 50 40 % +++ -- + --- +++ + +++ ? ? --- --- ++ ++ +++ ++ +++ --- ++ --- +++ +++ ++ --- --- ++ ++ 30 20 10 chlorothalonil 0 <0.125 1 16 256 >4096 ppm TBZ Ej. Sclerotinia homoeocarpa, Fuente: Vero, S. et al. 2001. 1 Resistencia La resistencia a fungicidas es consecuencia de la No solo los fungicidas generan resistencia Resistencia a productos biológicos capacidad de adaptación de los seres vivos a condiciones adversas. No es un problema exclusivo del control químico, ni de los fungicidas. Biocontrol de Agalla de corona Producida por Agrobacterium tumefaciens Antagonista :Agrobacterium radiobacter Descubierto por Kerr en 1970 Biocontrol de agalla de corona Biocontrol de agalla de corona Agrobacterium radiobacter K84 produce un antibótico (agrocin 84) activo contra Agrobacterium tumefaciens Esta información genética está codificada en un plásmido Agrobacterium radiobacter K84posee la información necesaria para resistir a agrocin 84 Nuevas variantes capaces de quebrar la resistencia en las plantas. El Fusarium raza 4 amenaza los cultivos Han aparecido cepas de Agrobacterium tumefaciens resistentes al agrocin 84 por transferencia de la información de resistencia Se ha creado por ingeniería genética la cepa Agrobacterium radiobacter K1026 a partir de la cepa K84 impidiendo la transferencia de genes de resistencia al agrocin 84 Está registrada como biopesticida por la EPA Jorge Luis Alonso · 13/08/08 El peligroso hongo Fusarium oxysporum, nueva raza 4, se ha convertido en una amenaza en las zonas sub tropicales de Asia. Investigador Asociado de la CATIE y asistente Coordinador Regional para América Latina y el Caribe de Biodiversity International, responde algunas inquietudes sobre a cómo prevenir el ingreso de este mal a la zona andina. 2 Nuevas variantes capaces de quebrar la resistencia en las plantas. Variedades de tomate pierden resistencia frente a nuevas razas de Fusarium Razas nuevas de la roya del trigo capaces de enfermar a las variedades existentes. Resistencia a fungicidas Origen de la resistencia Es una característica estable y heredable que resulta en una reducción de la sensibilidad a un fungicida en un hongo individual. Origen de la resistencia Fuerzas evolutivas: MUTACIÓN SELECCIÓN Evolución de la resistencia Mutaciones que ocurren en forma azarosa MUTACIÓN Provee las fuentes de la resistencia SELECCIÓN Determina la frecuencia en que se encontrarán los genotipos pueden tener como resultado alguna modificación en las proteínas disminuyendo de ese modo su capacidad de unirse a la molécula del fungicida resultando entonces en una resistencia bioquímica. Esas mutaciones son transmitidas a la siguiente generación. Aplicaciones repetidas del fungicida seleccionan esos mutantes dentro de la población del hongo. Cuando la frecuencia de esos mutantes resistentes es suficientemente grande se está ante lo que se denomina Resistencia Práctica 3 La resistencia sólo ocurre si se aplica un fungicida. La resistencia es un proceso s s s ss s s s ss s s R s s s s s s s s ss s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s ss s s s s s s s s R s s s s R s R s s s R s Rs s s s s R s s s s s s s s s R s R ss s ss s s R s R ss s s s R R ss s ss s s s s R s s R s s s s R s s s s s s s s s s s s s s s Población sensible s s s s s s s s s s s s s s R s s s s s s s s R s s s s s s s s s s s s s s s s s s s EN AUSENCIA DEL FUNGICIDA s s s s R s s s s s s s s s s s s s s Población resistente s s R s s s s R s s sR Rs R s s s s R s s s s s s s s s s s Rs s s s s s s s R s s Rs s R EN PRESENCIA DEL FUNGICIDA Resistencia adquirida a benzimidazoles Evolución de la resistencia Ocurrencia natural de un individuo resistente Población inicial Población resistente POBLACIÓN DE SALTO POBLACIÓN DE MELILLA El desarrollo de la resistencia práctica es un proceso que ocurre paso a paso 9 diámetro de la colonia (cm) diámetro de la colonia (cm) n uc ció ro d Re p n uc ció ro d Re p n uc ció ro d Re p uc ció ro d a a a a Re p d ici ng Fu d ici ng Fu d ici ng Fu d ici ng Fu Población sobreviviente n 9 6 3 0 6 3 0 0 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm 0 ppm 0,1 ppm 1 ppm 10 ppm Leoni, C., 2004 Resistencia práctica Resistencia práctica. Hablamos de resistencia práctica cuando las dosis indicadas en la etiqueta del fungicida no logran brindar un control comercialmente aceptable de la enfermedad. 4 Resistencia práctica Desarrollo de la resistencia Como resultado de mutaciones ocurridas al azar Comisión técnica de producción integrada de Brasil informa de resistencia a estrobilurinas. Riesgo de resistencia Varios factores contribuyen al riesgo de algunas proteínas pueden ser modificadas en su capacidad de unirse al fungicida en lo que se denomina resistencia bioquímica. Estas mutaciones se transmiten a la siguiente generación. Las aplicaciones repetidas del fungicida seleccionan a los mutantes en la población. Cuando la frecuencia de la mutación es suficientemente alta se alcanza lo que se denomina resistencia práctica Riesgo de resistencia Riesgo de resistencia asociado al fungicida. resistencia Riesgo de resistencia asociado al patógeno. Modo de Biología del Acción del Patógeno fungicida Riesgo Combinación de ambos riesgos nos indica el riesgo real o riesgo asociado a la enfermedad. A este riesgo hay que sumarle el riesgo asociado al Patrón de uso Riesgo inherente o asociado al fungicida padrón de uso del fungicida. Fungicidas de alto riesgo Benzimidazoles Clase o grupo al que pertenece el fungicida Sitio de acción (unisitio o multisitio) Estrobilurinas Antibióticos Inhibidores de la biosíntesis del ergosterol http://www.frac.info/frac/publication/anhang/FRAC-Code-List2011-final.pdf 5 Acción de un fungicida sitio específico Fungicidas con sitio de acción específico Biosíntesis de lípidos Síntesis de Aminoácidos y Proteínas. Anilinopyrimidinas Inhibidores de la biosíntesis del ergosterol IBEs Respiración (complejo III) Estrobilurinas Respiración desconocido) Phenylpyrroles sustrato Dicarboximidas producto Síntesis de ARNm producto sustrato Fenilalaninas Division nuclear Bencimidazoles enzima enzima enzima Cambios en la forma de una proteína impiden que el fungicida actúe. Acción de un fungicida sitio específico sustrato sustrato sustrato producto producto sustrato sustrato F F F enzima enzima F enzima enzima enzima enzima F F Fungicidas de bajo riesgo Riesgo inherente o asociado al patógeno Con que rapidez se reproduce? Cúpricos Azufrados Dithiocarbamatos Corto ciclo de vida abundante esporulación Cuan variable es? Mutaciones Presencia de reproducción sexual Se dispersa fácilmente? Aislamiento de la población 6 Riesgo asociado a la enfermedad Riesgo asociado a la enfermedad Concentración de conidios de 5x105 esporas por mL 50 manchas 50 mL de agua destilada 500.000 conidios de Venturia inaequalis por mancha. Una sola mancha produce más de ½ millón de esporas. Bajo Riesgo inherente al Fungicida Alto Riesgo de resistencia Riesgo asociado al patógeno Bencimidazoles Estrobilurinas Zona de riesgo Mutaciones ocurren continuamente IBEs Dicarboximidas Dithiocarbamatos Azufre Cúpricos Rizoctonia Sclerotium rolfsii Bajo Alternaria Mildius Penicillium Botrytis Venturia Oidios Riesgo inherente al patógeno en frecuencia de 1 x 10-6 a 1 x 10-9 Los problemas comienzan cuando la frecuencia sube a 1 x 10 -2 Se detecta evaluando 300 individuos Alto Riesgo asociado al patógeno Mutaciones expontáneas por resistencia a Benomil en Guignardia citricarpa agente causal de la mancha negra de los citrus suceden en una frecuencia de 1,25 x10-7. La proporción de mutantes resistentes se incrementa por: extensa área tratada. efectiva aplicación o dosis. alta población del patógeno previa. alta producción de propágulos. alta frecuencia de los tratamientos. menor tiempo de generación 7 Efectividad del fungicida vs. Selección Extensión del área tratada Una aplicación de fungicida a un cultivo: 50% efectiva 80% efectiva los resistentes quedarán distribuidos en el 20% de sobrevivientes A mayor área tratada – mayor presión de selección su frecuencia se habrá incrementado 5 veces. Cuanto más efectivo sea el tratamiento más rápida será la selección. Efectividad vs. evolución de la resistencia Efectividad vs. evolución de la resistencia Fungicida 50 % eficiente Fungicida 80 % eficiente Población sobreviviente Población sobreviviente 5% 5% 10% Una aplicación 50% efectiva duplica el porcentaje de resistentes Nº de aplicaciones vs. evolución de la resistencia de resistentes Perdida de la efectividad de un fungicida (resistencia cualitativa) Fungicida 80 % eficiente Control de la enfermedad Fungicida 80 % eficiente 25% Una aplicación 80% efectiva quintuplica el porcentaje 5% 25% Población sobreviviente 100% Población sobreviviente 2 aplicaciones 80% efectivas solo dejan resistentes Repetición de las aplicaciones caída teórica de la eficiencia de un fungicida 8 Tamaño de la Población vs. evolución de la resistencia. Tipos de Resistencia Cualitativa paso simple discreta disruptiva discontinua Cuantitativa pasos múltiples continua direccional progresiva Resistencia cualitativa Los individuos resistentes son inmunes al fungicida. Sensible % P. italicum resistentes a TBZ Tolerante 50 40 % Inmune 30 20 10 0 ppm 10 ppm 1000 ppm 0 <0.125 Resistencia cualitativa 1 16 ppm TBZ Concentraciones crecientes de fungicida 256 >4096 Fuente: Vero, S. et al. 2001. Resistencia cualitativa Carbendazim 60 Nº de aislamientos 50 Arándano 40 Eucalyptus Frutilla 30 Rosa Tomate 20 Vid 10 Testigo S/F 0 <4 16 32 64 >128 Concentración m ínim a inhibitoria (ppm ) 0,1 ppm 10 ppm Colletotrichum sensible a benomil. Resistencia de Botrytis cinerea en diferentes cultivos en Uruguay. (Gepp et al 2012) 9 Resistencia cuantitativa Resistencia cuantitativa Crecimiento de Fusarium graminearum en diferentes concentraciones de difenoconazole (Rekanovic et al., 2010) Venturia creciendo en diferentes concentraciones de difenoconazole Resistencia cualitativa Resistencia cuantitativa 30 Frecuency of isolates (%) 25 40 20 35 15 30 10 25 5 20 0 0,00010,0018 0.00180,0032 0,00320,0058 0,00580,0105* 0,01050,0189 0,01890,034 0,0340,0612 0,06120,1102 0,11020,1984 0,19840,357 0,3570,6427 0,64271,1568 1,15682,0823 2,08233,7481 3,74816,7466 ED50 difenoconazole 15 30 10 5 20 0 07 -0 ,0 00 86 0,0 * 00 86 -0 ,0 10 5* 0,0 10 5-0 ,0 18 9 0,0 18 9-0 ,0 34 0,0 34 -0 ,0 61 2 0,0 61 2-0 ,1 10 2 0,1 10 2-0 ,1 98 4 0,1 98 4-0 ,3 57 0,3 57 -0 ,6 42 7 0,6 42 7-1 ,1 56 8 1,1 56 8-2 ,0 82 3 2,0 82 3-3 ,7 48 1 3,7 48 1-6 ,7 46 6 6,7 46 6-1 2,1 44 15 10 6,8 61 28 13 20 11 77 E- Frecuency of isolates (%) 25 5 0 0,00010,0018 0.00180,0032 0,00320,0058 0,00580,0105* 0,01050,0189 0,01890,034 0,0340,0612 0,06120,1102 0,11020,1984 0,19840,357 0,3570,6427 0,64271,1568 1,15682,0823 2,08233,7481 3,74816,7466 ED50 difenoconazole Resistencia de dos poblaciones de Venturia inaequalis a difenoconazole en Uruguay (Mondino et al., 2012) Resistencia a difenoconazole en tres poblaciones de Venturia inaequalis en Uruguay Resistencia a Iprodione en Botrytis Perdida de la efectividad de un fungicida (resistencia cuantitativa) 100 Nº de aislamientos 25 Arándano 20 Eucalyptus Frutilla 15 Rosa Tomate 10 Vid 5 Control de la enfermedad Iprodione 30 80 60 40 20 0 <1 2 4 8 >16 Concentración m ínim a inhibitoria 10 Resistencia de poblaciones de Botrytis cinerea a Iprodione en Uruguay (Gepp et al., 2012) 20 30 40 50 Repetición de las aplicaciones caída teórica de la eficiencia de un fungicida 10 Evolución de la resistencia Frecuencia en la población Bajo Aplicaciones repetidas del fungicida Estrobilurinas, bencimidazoles Tipos de resistencia Inhibidores de la biosíntesis del ergosterol Alto Resistencia Resistencia cruzada Resistencia cruzada negativa Resistencia múltiple Bajo Resistencia Alto Resistencia cruzada La selección por resistencia a un principio activo implica automáticamente resistencia a otros principios activos. Ocurre generalmente entre fungicidas que tienen el mismo sitio de acción. Resistencia cruzada Hablamos de resistencia cruzada cuando un patógeno resistente a un fungicida exhibe resistencia a otros fungicidas del mismo grupo, aún aunque nunca haya estado expuesto a esos otros fungicidas. Benomil, Carbendazim, TBZ Iprodione, Proximidione Krexosim metil trifloxystrobin azoxystrobin Resistencia cruzada Resistencia cruzada Los fungicidas del mismo grupo poseen similar modo bioquímico de acción. El mecanismo bioquímico de resistencia impedirá que todos los fungicidas del grupo puedan unirse al sitio de acción. Por ejemplo: Individuos resistentes a Krexosim metil también serán resistentes a Trifloxystrobin y a azoxystrobin. Individuos resistentes a benomil lo serán también a Carbendazim o a Methiltiofanato. 11 Resistencia cruzada negativa Resistencia múltiple Cuando en una población resistente aparecen ¿Cómo evitar la resistencia? No utilizar fungicidas. Utilizar fungicidas de bajo riesgo. Minimizar el uso de fungicidas de alto riesgo.( ej. estrobilurinas) Utilizarlos solamente cuando es indispensable. No enfrentar al fungicida con altas poblaciones de patógeno. Integrar al control químico con otras medidas que mantengan baja la población del patógeno. Monitorear la población resistente. Fungicidas de bajo riesgo La resistencia sólo ocurre en presencia del fungicida s ss s s s R s s s s s s s s s s s s s s s R s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s R s s s s s s s EN AUSENCIA DEL FUNGICIDA La única manera 100% efectiva para evitar el desarrollo de resistencia es NO USAR EL FUNGICIDA Minimizar el numero de aplicaciones Población resistente n uc ció ro d Re p n uc ció ro d Re p uc ció ro d a a Re p d ici ng Fu d ici ng Fu a a probable que el hongo encuentre maneras de evitar los múltiples formas de ataque d ici ng Fu d ici ng Fu Población sobreviviente n Población inicial Cuando el fungicida actúa en múltiples sitios es muy poco s s s s s s s s s s s s n Carbendazim y Diethofencarb uc ció ro d activo implica automáticamente susceptibilidad a otro principio activo. Solamente se conoce un caso. individuos con resistencia a un segundo principio activo de diferente modo de acción. Es una resistencia debida a mutaciones independientes y que ha sido seleccionada por exposición a uno y luego a otro de los fungicidas. Ej. Botrytis con resistencia a Benzimidazoles y dicarboximidas. Re p La selección por resistencia a un principio El desarrollo de la resistencia práctica es un proceso que ocurre paso a paso 12 Riesgo de resistencia está asociado al patrón de uso Cada aplicación es un evento de selección. El camino más rápido hacia la resistencia es la repetición de las aplicaciones. Fungicidas de alto riesgo no deben aplicarse mas una vez en la temporada. Recomendación de etiqueta de Iprodione Evitar enfrentar grandes poblaciones Recomendaciones de etiqueta de estrobilurinas Se debe evitar aplicar cuando las poblaciones del patógeno son grandes recomendaciones….. Recomendaciones de etiqueta de estrobilurinas Evitar alta presión de enfermedad Recomendaciones de etiqueta de estrobilurinas 13 Integrar el uso de fungicidas en sistemas de Manejo Integrado Fungicidas Se puede hacer algo luego del proceso de selección por resistencia? ¿Qué sucede cuando dejamos de aplicar el fungicida? ¿Es posible volver a utilizar un fungicida Métodos biológicos luego de algún tiempo? ¿Es conveniente aplicarlo en mezcla con otro fungicida? Métodos culturales Variedades resistentes Riesgo de resistencia asociado al tipo de mutación Habilidad competitiva de los genotipos resistentes Cuando las mutaciones no afectan el normal Cuando los individuos resistentes no ven funcionamiento del elemento mutado el riesgo de resistencia es alto. Cuando el elemento mutado sufre algún cambio en el funcionamiento, el riesgo es medio. Cuando la mutación hace que el individuo sea menos apto el riesgo es bajo. Realizar un manejo anti-resistencia Debemos saber que la población sensible es un recurso a conservar. Es necesario hacer un balance entre el objetivo de controlar la enfermedad evitando pérdidas y conservar la población sensible del patógeno. afectada su capacidad competitiva frente al resto de la población no disminuirán su número en la población cuando se retira el fungicida. Cuando los individuos resistentes ven afectada su habilidad competitiva en ausencia de la presión de selección comienzan a retroceder en número en la población. Estrategias de manejo 1) No aplicar el fungicida en forma aislada. Aplicar mezclas de fungicidas de modos de acción diferentes Aplicar el fungicida en rotaciones o alternándolo con otros de modos de acción diferentes 14 Alternar fungicidas Uso de mezclas El uso de una mezcla de dos fungicidas con modo de acción diferente retarda el proceso de resistencia. La probabilidad inicial de encontrar un doble resistente (individuo con dos mutaciones) es la multiplicación de ambas probabilidades. Fungicida A Fungicida B 1x10-6 X 1 x 10-6 = 1 x 10-12 Cada fungicida control sin discriminar los resistentes al otro Mezcla de fungicidas Mezclas de fungicidas Fungicida A + Fungicida B Fungicida B + Fungicida A Resistentes a B Resistentes a A Doble resistentes AB Si luego de seleccionar por resistencia a un Cada fungicida control sin discriminar los resistentes al otro ¿Altas dosis de fungicida? fungicida comienzo a mezclar, se seleccionará la poblacion de dobles resistentes ¿Bajas dosis de fungicida? % P. italicum resistentes a TBZ 50 40 % 30 20 10 0 <0.125 1 16 256 >4096 ppm TBZ Altas dosis nos aseguran eliminar por completo a los sensibles..... Bajas dosis solo eliminan a los más sensibles..... 15 Monitoreo de la resistencia Se trata de la toma de muestras de la población de campo de un patógeno para medir el grado de sensibilidad a uno o más fungicidas. Monitoreo de la resistencia Debe ser realizado lo más temprano posible a efectos de poder tomar medidas para evitar la situación de resistencia. La resistencia monogénica solo es detectable cuando alcanza niveles mayores al 1%. N = 300 para detectar con 95% de confianza Monitoreo de la resistencia Monitoreo de la resistencia Otro objetivo es analizar el funcionamiento de las estrategias de manejo antiresistencia. Es necesario realizar monitoreos periódicos. Grandes áreas en donde se aplica el producto. Tamaño de muestra y area necesarios para detectar la presencia de resistentes Monitoreo de la resistencia Para investigar las causas de fallas en el control. Guiar con que producto realizar el próximo tratamiento. 16 Monitoreo de la resistencia Los métodos utilizados para testar resistencia deben ser: reales, cuantitativos, reproducibles y sus resultados fácilmente entendibles. FRAC ha publicado métodos recomendados Ejemplo: Venturia inaequalis OBJETIVOS Determinación de los niveles de resistencia “in vitro” a trifloxystrobin en poblaciones de Venturia inaequalis. Temporada 2007-2008 existieron grandes pérdidas por esta enfermedad en manzanos. OBJETIVOS OBJETIVOS Obtención de una colección de aislamientos de Venturia inaequalis de diferentes montes con diferente historial de uso a IBEs (Difeconzole). Determinación de los niveles de resistencia en planta a Difeconzole y Trifloxistrobin en poblaciones de Venturia inaequalis. Determinación de los niveles de resistencia “in vitro” a Difeconzole en poblaciones de Venturia inaequalis. . 17 Determinacion de la resistencia a trifloxystrobin Puntos de muestreo Se realizo un muestreo de predios con diferentes historiales de uso de estrobilurina en la temporada 2010, ubicados en las zonas de Melilla, Juanicó y Sayago. El método de evaluación de resistencia a trifloxystrobin se realizo siguiendo el protocolo del test de germinación de esporas de los Dres. Gerd Strammler y Kristin Klappach, recomendado por el FRAC (Fungicide Resistanse Action Committee). El procedimiento se llevo a cabo en el laboratorio de fitopatología en la Facultad de Agronomía. METODOLOGÍA Muestreo de hojas con síntomas Concentración de conidios de 5x105 esporas por mL Solo alguna hoja presenta síntomas en la rama. En algunos montes solo a caída de hoja se pudo muestrear Contar 100 esporas 24 horas a 20ºC TESTIGO 2ppm 20ppm Cálculo del porcentaje de resistencia Nº de esporas germinación con fungicida x 100 Nº de esporas germinación sin fungicida 18 Resistencia práctica Resultados 2010 Predio % de esporas resistentes 1 94,97 4 67,51 2 60,49 3 54,14 10 36,18 5 13,75 6 12,66 8 10,13 9 8,55 7 3 Comisión técnica de producción integrada de Brasil informa de resistencia a estrobilurinas. Puntos de muestreo METODOLOGÍA 24 hs a 20 º C • • Los aislamientos fueron conservados en papel de filtro a una temp. de -20º C. Se obtuvieron 33 aislamientos de cada monte. 19 aislamientos Determinación de la resistencia a difenoconazole aislamientos Se utilizaron 33 aislamientos de cada monte, los cuales fueron obtenidos de los aislamientos conservados. Cada aislamiento fue sembrado en PDA y fueron colocados en estufa( aprox. 20días) a 20ºC. Las concentraciones utilizadas fueron:0, 0.05, 0.1, 5 y 10 ppm Para cada concentración se hicieron 4 repeticiones por aislamiento. Metodología Experimento 3 montes X 33 aislamientos = 99 99 aislamientos X 5 concentraciones= 495 24hs antes se preparo el medio (PDA) con diferente concentración de fungicidas Todo repetido 4 veces 495 x 4 = 1980 placas 30 días a 20 ºC 20 Facultad Moizo Cirefice Resistencia Resultados DISTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONES DE DIFERENTES MONTES 40 35 Frecuencia en % 30 M.F 25 M.M M.C 20 15 10 5 0 SF 0,05 0,1 5 10 6,86E-070,00086 0,000860,0105 0,01050,0189 0,01890,034 0,0340,0612 0,06120,1102 0,11020,1984 0,19840,357 0,3570,6427 0,64271,1568 1,15682,0823 2,08233,7481 3,74816,7466 6,746612,144 DL50 en ppm Preguntas? 21