4. INMUNODETECCIÓN DE bcl-2 EN CÉLULAS DEL EPITELIO UTERINO DE RATAS APAREADAS DURANTE EL CICLO ESTRAL. Mirielle Espinosa Carmona Tutor: Dr. Marco Antonio Cerbón Cervantes Departamento de Biología Se sabe que durante el ciclo estral de la rata los epitelios del endometrio sufren cambios morfológicos en respuesta a los cambios hormonales que se presentan durante el ciclo. Los epitelios luminal y glandular proliferan en las etapas de metaestro al proestro y posteriormente sufren degeneración celular por apoptósis en la etapa del estro (Butcher et al., 1974; Spornitz et al., 1994; Mendoza-Rodríguez et al., 2003). La homeostasis de este tejido es el resultado del balance entre la proliferación celular, la diferenciación y la apoptósis la cuál involucra la participación de más de 100 genes, incluyendo la familia del gen bcl-2. La familia de la proteína Bcl-2 esta integrada por más de 16 homólogos que se han dividido en tres grupos funcionales (Adams y Cory, 1998; Antonsson y Martinou, 200). Grupo I. Se caracterizan por tener cuatro dominios conservados homólogos a Bcl-2 (Dominios BH1-BH4), aunque algunos miembros carecen del dominio BH4. Todos los miembros de este grupo tienen actividad antiapoptótica y son: Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1 (Bfl-1) y Boo, entre los mas importantes. Grupo II. Consiste en miembros con actividad pro-apoptótica e incluye a proteínas como Bax, Bak, Bad, Mtd (Bok), Diva. Estas proteínas tienen una estructura muy similar a las proteínas del primer grupo, ya que comparten una secuencia homóloga en BH1, BH2 y BH3 pero no tienen homología en el dominio BH4, aunque se ha encontrado un dominio similar a BH4 entre algunos miembros de esta familia como Bcl-rambo (Kataoka et al., 2001). Grupo III. En éste se encuentran proteínas que sólo tienen una característica en común, la presencia del dominio BH3 que consiste de 12-16 aminoácidos (Adams y Cory, 1998). Estas 21 proteínas tienen una actividad pro-apoptótica e incluye a Bik, Bid, Bim, Hrk (DP5), Blk y Bnip3, Bnip3L. Estudios recientes de nuestro laboratorio han reportado la expresión de Bcl-2 y Bax en las etapas del proestro y estro en ratas intactas, por medio de inmunohistoquímica. Se ha observado una disminución en la expresión de Bcl-2 en la transición del proestro al estro (21:00h del proestro a las 5:00h del estro) y un aumento de Bax en este mismo intervalo de tiempo, lo cual muestra un incremento significativo en la relación pro-apoptótica Bax/Bcl-2 (Mendoza-Rodríguez y col, 2003). Estos resultados indican que el proceso apoptótico de los epitelios del endometrio uterino puede estar mediado por los genes de la familia de Bcl-2. Sin embargo, se desconoce si los patrones de muerte celular son afectados por el estímulo del apareamiento-fecundación de los animales. Por lo tanto, en el presente estudio se evaluó el efecto que tiene el apareamiento de los animales sobre la expresión de Bcl-2 y Bax en las células epiteliales del útero de ratas apareadas, por medio de inmunohistoquímica durante las etapas del proestro y estro. MATERIAL Y MÉTODO. Animales de experimentación. Para este estudio se utilizaron ratas hembras adultas de la cepa Wistar apareadas y no apareadas con 200-250g de peso, las cuales se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad 12:12 con agua y comida ad libitum. Se utilizaron las ratas que presentaron por lo menos 3 ciclos regulares con una duración de cuatro días, los cuales se determinaron por medio del análisis microscópico de frotis vaginales diarios. Se sacrificaron por decapitación a diferentes horas durante la transición de la fase del proestro al estro: 13:00 y 21:00 horas del proestro, y 0:00, 3:00, 6:00, 9:00 y 13:00 horas del estro. Se usaron 3 animales por cada hora de estudio. Inmediatamente después de sacrificar al animal se disecaron ambos cuernos uterinos para su inclusión en parafina. Procesamiento del tejido. Una vez que se disecaron los tejidos, se fijaron en paraformaldehido al 4% en PBS durante 2 horas. Posteriormente se sometieron a un proceso de deshidratación, con soluciones de etanol al 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% preparadas con agua DEPC, y en etanol y xilol al 100%. Se 22 impregnaron en parafina a 60°C durante 30 minutos y toda la noche; posteriormente fueron incluidos en parafina. Preparación del tejido para IHQ Se realizaron cortes de 5 m de grosor en micrótomo y se colocaron en laminillas tratadas con PoliL-lisina (Sigma). Los cortes histológicos se desparafinaron durante 15 minutos a 60°C y se rehidrataron. Inmunohistoquímica. Para recuperar el antígeno de interés, los tejidos se trataron en citrato de sodio 10 mM pH 6 hirviendo durante 20 minutos con un descanso intermedio de 5 minutos entre cada 10 minutos. Se bloqueó la peroxidasa endógena con H2O2 al 3% durante 30 minutos. Posteriormente se permeabilizó con triton X-100 al 0.5 % durante 30 minutos. Entre cada tratamiento se realizaron 2 lavados de 5 minutos con PBS. Se bloqueó durante media hora con albúmina bovina al 5% en solución de H2O2 al 1% en PBS. Posteriormente se incubó con el anticuerpo primario en una dilución 1:300 en PBS-Tritón 3%, dirigido contra la proteína investigada, (Bcl-2: sc-492, Bax: sc-526, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) por 24 h a 4oC. Para obtener el control negativo, se omitió el anticuerpo primario de Bcl-2 y Bax .El anticuerpo primario se detectó por un anticuerpo secundario biotinilado que se incubó por 2 h en una dilución 1:100 y después con el complejo avidina-biotina por 1 h. La reacción se reveló con diaminobencidina y se contratiñó con hematoxilina. Las células marcadas se observaron en un microscopio de luz. La intensidad de reacción inmunopositiva obtenida en el epitelio luminal y glandular se determinó con ayuda del programa Zeiss, capturando las imágenes de tres úteros diferentes por cada hora estudiada y analizando todas las células de los epitelios asignando un valor de densidad en una escala de 0 - 255 (0 = blanco, 255 = negro) a la intensidad de la tinción. 23 RESULTADOS. Las ratas apareadas presentan una mayor expresión de Bcl-2 en las últimas horas del proestro (21:00h) y primeras del estro (0:00, 3:00 y 6:00 h) en contraste con las ratas no apareadas que presentan una menor expresión de la proteína en este mismo intervalo de tiempo. En las ratas apareadas Bcl-2 mostró una localización citoplasmática y nuclear; mientras que en las no apareadas sólo se expresa en el citoplasma. La expresión de Bax se mostró disminuida en las ratas apareadas respecto con las no apareadas y en ambas su localización fue principalmente citoplasmática. 24 25 CONCLUSIONES. Las diferencias que muestran Bcl-2 y Bax a nivel de su expresión y localización en el epitelio uterino de las ratas apareadas y las no apareadas, indican que el apareamiento de los animales induce un cambio en la expresión de ambas proteínas, lo cual podría influir en el patrón de muerte celular de los epitelios uterinos durante el periodo estudiado y puede participar de manera importante durante la fertilización del huevo fecundado. En el caso de Bcl-2 ya que se observó una localización nuclear, también podría estar participando en otros procesos moleculares dentro del núcleo. BIBLIOGRAFÍA. -Adams JM y Cory S (1998). The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281, 1322. -Antonsson B y Martinou JC (2000). The Bcl-2 protein family. Exp Cell Res 256, 50. -Butcher RL, Collins WE y Fugo NW (1974). Plasma concentrations of LH, FSH, prolactin, progesterone and estradiol-17 throughout the 4-day estrous cycle of the rat. Endocrinology 94, 1704. 26 -Kataoka T, Holler N, Micheau O, Marinon F, Tinel A, Hofmann K y Tschopp J (2001). Bclrambo, a novel Bcl-2 homologue that induces apoptosis via its unique C-terminal extension. J Biol Chem 276, 19548. -Mendoza-Rodríguez CA, Merchant-Larios H, Segura-Valdez ML, Moreno-Mendoza N, Cruz ME, -Arteaga-López P, Camacho-Arroyo I, Domínguez R, Cerbón M (2002). Expression of p53 in luminal and glandular epithelium during the growth and regression of rat uterus during the estrous cyle. Mol Reprod Develop 61, 445. -Mendoza-Rodríguez CA, Monroy-Mendoza G, Morimoto S, Cerbón MA. Pro-apoptotic signals of the bcl-2 gene family in the rat uterus occurs in the night before the day of estrus and precedes ovulation. Mol Cell Endocrinol. 2003 Oct 31;208(1-2):31-9. -Spornitz UM, Rinderknecht BP, Edelmann A, Scheidegger B, Cairoli F (1994). Ultrastructure as a basis for dating of rat endometrium. Anat Rec 238, 163. 27