AGO1012_REDVET Revision CITOLOGÍA EXFOLIATIVA VAGINAL EN ALPACAS (Vicugna pacos) Y LLAMAS (Lama glama): POSIBLES USOS RESUMEN La utilización de la citología exfoliativa vaginal esta muy difundida en mascotas y especies silvestres, mediante esta técnica se puede revelar los cambio del epitelio vaginal causados por las oscilaciones hormonales, en especial a las concentraciones de estrógeno. No existen trabajos previos sobre este tema en camélidos sudamericanos, pero luego de evaluaciones entre alpacas y llamas vacías y preñadas a diferentes estadios de gestación, se encontró que las diferencias del índice de maduración podrían ser útiles como métodos de diagnostico de gestación e incluso para determinar la dominancia estrogénica en programas de biotecnologías reproductivas. INTRODUCCIÓN La citología exfoliativa vaginal es una herramienta muy simple, que se viene utilizando con mucha eficacia para determinar el estadío del ciclo estral que presenta en especies como el perro, gato y otros mamíferos más, se correlaciona este estudio citológico con la concentración de estrógenos sanguíneos, los cuales producen variaciones morfológicas en las células planas del epitelio vaginal (Thrall y Olson, 2003). La vagina es un órgano muscular cubierto internamente de epitelio estratificado plano queratinizado (Dellman y Brown 1980), esta compuesta por tres capas: mucosa, muscular y adventicia; la luz esta revestida por epitelio estratificado plano no queratinizado, el cual sufre variaciones en el numero de capas que lo conforman debido a cambios hormonales del animal, estos cambios producen la muerte de las células de las capas superficiales con su consecuente queratinizacion y descamación (Feldman y Nelson 2000), puesto que se observó que estrógenos exógenos inducen queratinizacion epitelial en la vagina, no ocurriendo lo mismo en caso de progestagenos o andrógenos (Jones, and Edgren, 1973). La lamina propia esta compuesta por tejido conectivo laxo con abundante riego sanguíneo, la capa muscular esta conformada por dos capas de músculo liso, una interna circular y una externa longitudinal, por fuera se encuentra una delgada capa de células mesoteliales que conforman la túnica adventicia (Gartner, y Hiatt, 2002; 1 Xelhuantzi, et al. 2004). Cambios en la estructura histológica de la vagina suceden a causa de la edad y la multiparidad del animal, incrementándose también la irrigación sanguínea (Rodriguez, et al. 2004). La correlación entre la histología vaginal a través del ciclo estral y la citología exfoliativa vaginal en ovinos demuestra que ocurren cambios marcados, sobre todo en él numero de capas del epitelio vaginal, la actividad mitótica del estrato basal se incrementa a medida que se acerca el momento de la ovulación y luego decrece, así también la descamación de células superficiales, al momento del diestro se encuentran muy pocas células superficiales descamadas y el epitelio no presenta estrato superficial queratinizado (Hawkins, and Darlow, 1934). Las células encontradas en frotices vaginales han sido clasificadas como células parabasales (Redondas con poco citoplasma), células intermedias pequeñas y grandes (células mas grandes, núcleo grande, ligeramente ovaladas) y células superficiales (anucleadas y con núcleo picnotico, citoplasma irregular) (Thrall, y Olson, 2003; Piñeiro, et al. 1995). Las dimensiones de los diferentes tipos de células encontradas en frotices vaginales de gatos dieron los siguientes resultados: 68.5, 44.7 y 18.6 µ de largo para células superficiales, intermedias y parabasales en promedio y 7.8, 10.0 y 8.3 µ de diámetro nuclear para células superficiales, intermedias y parabasales respectivamente (Mills, et al. 1979). El índice de maduración es el porcentaje de células parabasales, intermedias y superficiales encontradas en frotices vaginales, los cuales se relacionan a los diferentes estadíos del ciclo reproductivo del animal en estudio (Mills et. al. 1979). El estudio de la colpocitologia se presenta como un método sencillo, barato, no invasivo y de utilidad en la clínica en caninos, en los cuales se observan células superficiales en valores superiores al 80 % cuando los animales se encuentran en la fase de estro, disminuyendo este porcentaje a cerca del 20 % en el diestro, en el anestro se observan solo células parabasales e intermedias pequeñas (Stornelli et al. 2005), mientras en especies como el pecari de collar (Tayassu tajacu) el porcentaje de células superficiales superiores al 60 % es un indicador del estro (Mayor et al. 2004), en gatos, el índice de maduración se observa con 0.3, 11.6, 88.1 % y de 9.7, 87.4 y 2.9 % de células parabasales, intermedias y superficiales para el estro y el anestro respectivamente (Mills et. al. 1979); durante el puerperio temprano se observa que el perfil citológico esta dominado por células parabasales en su mayoría y existe una alta presencia de leucocitos 2 Existen diversos métodos de tinción de frotices vaginales, mono, bi y tricromicas, de todos estos la técnica mas fácil, barata y efectiva es la tinción monocrómica de Wright (Tala, 2002) La crianza de alpacas es una actividad importante para el poblador andino, pero dicha crianza se ve afectada por la baja eficiencia reproductiva en condiciones de altura (Novoa y Leyva, 1996). Existen muchos métodos de diagnostico de gestación, pero los únicos métodos que pueden ser utilizados tempranamente son la ecografía y la determinación de progesterona (Bravo, 2002), estas técnicas aun que muy efectivas, resultan difíciles de aplicar por su alto costo y la necesidad de contar con equipo y personal necesario, lo cual reduce su accesibilidad al criador promedio. La fisiología ovárica en alpacas demuestra que luego de la dominancia ovárica y la ovulación, el cuerpo lúteo inicia su crecimiento y es dominante recién al día 4 post copula, y si no existe gestación este cuerpo lúteo regresiona a partir del día 11, por lo que al día 12 existe un cuerpo lúteo de gestación verdadera, con la consiguiente dominancia de la progesterona (Bravo, 2002). El diagnostico de gestación mediante colpocilologia exfoliativa esta reportado en especies de laboratorio como en monos del genero Aotus sp., donde se reporta que los animales con mas de 70 % de células superficiales están vacías y en fase folicular (Rios, et al. 1999) y Callitrix sp. (Mitchell and Jones 1975) así como también en la chinchilla y el hurón (> 90 % de células superficiales en estro), donde las diferencias entre los índices de maduración de hembras vacías y preñadas es evidente (Bekyürek, et al. 2002; Williams, et al. 1992). La diferencia del epitelio vaginal entre hembras vacías y preñadas se puede determinar al encontrar 4 o menos capas de células en el epitelio vaginal de marranas a los 25 días de gestación, mayor cantidad de capas indica que el animal no se encuentra gestante (Diehl, and Day, 1973). En alpacas el método del ultrasonido revela una seguridad del 89 % a partir de los 70 días de gestación (Alarcón, et al. 1989) y de 92 % a los 80 días (Ampuero, et al., 1989), por el método de la ecografía con un transductor de 5 MHz se puede encontrar la vesícula embrionaria desde el día 17 y la presencia del embrión desde el día 30 en llamas (Cárdenas, et al 2003). En los camélidos sudamericanos, en especial en las alpacas no se han realizado investigaciones ni existen reportes relacionados a la colpocitologia exfoliativa, Una alternativa de diagnostico temprano de gestación podría constituir la utilización de la colpocitologia exfoliativa. 1. Descripción citologica de células vaginales de alpacas y llamas 3 Las muestras fueron tomadas de 10 alpacas y 10 llamas vacías, adultas y durante la estación reproductiva de la especie; fueron tomadas utilizando un hisopo de 10 cm, el cual se introdujo a la vagina aproximadamente 7 cm y se realizó raspajes rotatorios a la pared vaginal, inmediatamente después se hizo rodar suavemente el hisopo en una lamina portaobjetos, se fijo con alcohol de 90º y se dejo secar, posteriormente se trasladó al laboratorio donde se realizó la tinción con colorante Wright por 5 min., luego se adicionó agua tamponada por 3 minutos y se lavo con agua corriente, se dejo secar y se llevo a su observación en microscopio óptico a diferentes aumentos. La medición de las células se realizó utilizando un microscopio de proyección a 400 aumentos. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Ji-Cuadrado (X2) Se reveló la existencia de formas celulares similares a las reportadas en otras especies como en gatos y perros (Thrall, y Olson,. 2003; Piñeiro, et al. 1995). Las células parabasales se observan de forma redondeada, con un núcleo de gran tamaño y escaso citoplasma, estas células generalmente se encuentran formando columnas celulares agrupadas, se puede observar algunas células parabasales multinucleadas (Fig. 1). Célula parabasal célula intermedia pequeña Fig. 1.- Células parabasales e intermedia pequeña Las células intermedias pequeñas se presentan como células de forma redondeada, de mayor tamaño que las células parabasales y con mayor cantidad de citoplasma pero con el núcleo de igual tamaño que estas últimas, (Fig. 1). Las células intermedias grandes se muestran como células de mayor tamaño que las células intermedias pequeñas, son de forma ovalada y la presencia de mayor cantidad de citoplasma es notorio al poseer un núcleo mas pequeño, en algunas células se observa inicio de picnosis, pudiéndose confundir con células superficiales de núcleo picnotico (Fig. 2). Célula intermedia pequeña Célula intermedia grande Fig. 2.- Células intermedias pequeñas y grandes. 4 Las células superficiales se presentan como células grandes de forma irregular, angulosas y en algunos casos se muestran plegadas, pueden ser células superficiales con núcleo picnotico, en este caso el núcleo se encuentra fragmentado, débilmente teñido y en franca degeneración, también existen células anucleadas, en este caso la tinción es menos intensa por estar altamente queratinizada (Fig. 3). Célula superficial anucleada Fig 3.- Células superficiales También se encontraron células blancas en los frotices, generalmente neutrofilos, (Fig 4), se observo muy pocas células rojas. neutrofilos Célula superficial con núcleo picnotico Fig. 4.- célula superficial y neutrofilos En frotices de dos llamas se encontró un tipo singular de célula, se trata de células pequeñas, redondeadas y con la presencia de varios núcleos y/ó de núcleos polimorfos, se asume que se trate de células parabasales en mitosis, (fig 5). Fig. 5.- Células multinucleadas y con núcleos polimorfos. Las dimensiones encontradas de las células del epitelio vaginal de alpacas y llamas se encuentran en la tabla 1. 5 Tabla 1.- Diámetros celulares encontrados en células y núcleos epiteliales de alpaca y llama (µm) Célula parabasal ESPECIE Célula Célula intermedia intermedia pequeña grande Célula superficial célula núcleo Célula núcleo célula núcleo célula Alpaca 15.8 9.8 20.4 9.0 33.67 11.6 51.4 Llama 15.2 9.6 20.8 9.6 29.33 11.33 47.0 Las dimensiones celulares encontradas para alpacas y llamas llevadas a un análisis de Ji-cuadrado (X2) demuestran que no existe diferencia significativa (P≤0.05) entre ambas especies de camélidos domésticos; estas dimensiones son inferiores a las dimensiones reportadas en frotices vaginales en gatas (Mills, et al. 1979). 2. Citología exfoliativa vaginal de la alpaca (vicugna pacos) en diferentes estados reproductivos Las muestras fueron tomadas de 10 alpacas vacías (5 aceptan la copula y 5 rechazan la copula), 10 alpacas preñadas y 12 alpacas de post parto temprano (2-5 días PP), adultas y durante la estación reproductiva de la especie; se realizo la tinción utilizando la técnica descrita anteriormente. El índice de maduración indica un comportamiento similar a otras especies, con incremento de células superficiales durante la dominancia estrogenica (Tabla 2), presentando un porcentaje de 66.8 %, similar a lo descrito en pecaris pero inferior a lo reportado en gatos, el comportamiento de las alpacas frente al macho es atribuido al nivel de estrógenos presentes en la hembra (Bravo, 1997), este comportamiento podría explicar la diferencia entre alpacas con conducta de aceptación al macho y rechazo durante la cópula, siendo esta diferencia no significativa (P≥ 0.05). Tabla 2.- Índice de maduración en alpacas hembras vacías. η Promedio Promedio Promedio general Células superficiales Células intermedias Células parabasales Glóbulos blancos Glóbulos rojos % % % % % 54.08 79.52 29.14 15.42 8.04 1.86 5.94 0.0 2.68 0.0 Comportamiento. rechaza acepta 66.8 22.28 4.86 2.97 1.34 100 6 TOTAL El porcentaje de células superficiales disminuye mientras el porcentaje de células parabasales e intermedias se incrementa durante la gestación (Tabla 3), presentando valores similares al anestro en otras especies (Stornelli, et al. 2005; Mayor, et al. 2004; Mills, et. al. 1979), donde se puede observar que las células superficiales muestran un porcentaje inferior al 20 %, este dato podría ser utilizado en diagnostico de gestación. Tabla 3.- Índice de Maduración en alpacas hembras preñadas η promedio Células superficiales % 12.6 Células Intermedias % 58.4 Células parabasales % 26.86 Glóbulos blancos % 2.14 Glóbulos rojos % 0.0 Durante el post parto temprano, el epitelio vaginal presenta un alto porcentaje de células intermedias (Tabla 4), con muy bajos porcentajes de células superficiales, indicando la no existencia de niveles estrogenicos que permitan la maduración de estas células (Mills, et. al. 1979), se puede observar la alta cantidad de neutrofilos presentes en la vagina al segundo día post parto, debido probablemente a la inflamación del canal de parto, los cuales disminuyen bruscamente a partir del tercer día post parto (Arthur, et al. 1991) Tabla 4.- Índice de maduración en alpacas hembras de post parto temprano Días postparto Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Células superficiales % 18.76 21.03 21.4 27.7 Células intermedias % 14.57 63.62 67.1 67.56 Células basales % 1.48 7.96 6.65 4.06 Glóbulos blancos % 64.9 7.04 5.4 0.64 Glóbulos rojos % 3.3 0.3 0.0 0.0 Se observan células similares a las reportadas en otras especies, por lo que los protocolos de tinción y evaluación de otras especies se pueden utilizar también en evaluaciones de frotices vaginales en alpacas; también podemos concluir que los datos obtenidos a partir de frotices vaginales en alpacas nos indican el estadío del epitelio vaginal, el cual cambia marcadamente de acuerdo al estado reproductivo del animal, observando marcadas diferencias entre alpacas vacías y alpacas preñadas, pudiendo ser útil como un método complementario de diagnostico de gestación, puesto que al ser una técnica no invasiva, no produce estrés en el animal, también nos permite encontrar diferencias entre alpacas con comportamiento de rechazo y aceptación al macho, lo cual podría servir en empadre controlado así como en inseminación artificial donde no se cuente con macho detector; en cuanto a las 7 Total % 100 observaciones post parto, observamos que existe una gran cantidad de neutrofilos en los frotices y esto estaría indicando la inflamación que se produce en el canal de parto hasta en segundo día, desde donde se observa una dominancia de células intermedias. 3. Citología exfoliativa vaginal en llamas (lama glama) en diferentes estados reproductivos Las muestras fueron tomadas de 10 llamas vacías y 10 llamas preñadas, adultas y durante la estación reproductiva de la especie Se evaluaron los frotices de acuerdo a la técnica anteriormente descrita. La evaluación estadística fue hecha mediante la prueba de t de Student (SAS). Se encontró en frotices vaginales de llamas preñadas y vacías, células parabasales, intermedias y superficiales, similar a lo reportado en otros mamíferos (Thrall, y Olson,. 2003; Piñeiro, et al. 1995). El índice de maduración en llamas vacías en fase folicular demuestra una dominancia de células intermedias, con un promedio de 65.3 % superior a las células superficiales, las cuales solo se encontraron en 28 % (Tabla 5), este comportamiento es diferente a lo reportado en pecaria, gatos, hurones y alpacas (Mayor, et al. 2004; Mills, et al. 1979; William, et al. 1990), en dichas especies, existe una dominancia de células superficiales durante la dominancia estrogenica, lo cual no sucede en caso de llamas, pero este comportamiento es similar a lo reportado en ovejas (Porto, et. al. 2007), en donde se encuentra solo un 29.56 % de células superficiales durante el estro, la diferencia entre células superficiales y las células intermedias es significativa (P< 0.05); las células parabasales se encuentran en un 6.3%, superior a lo reportado en ovejas, los eritrocitos estuvieron ausentes y los leucocitos solo estuvieron en un 0.4%. Tabla 5.- Índice de maduración en llamas hembras vacías. η Promedio Células Células superficiales intermedias % % 28 65.3 Células parabasales % 6.3 Leucocitos Eritrocitos % 0.4 % 0.0 TOTAL % 100 En llamas preñadas existe una dominancia de células intermedias (Tabla 6), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (P<0.05), este comportamiento es similar a lo reportado en otras especies de mamíferos, en los cuales se indica que el epitelio vaginal detiene su crecimiento y no permite la maduración y el incremento de células superficiales durante la gestación (Mayor, et al. 2004; Mills, et.al. 1979; William, et al. 1990), estos datos concuerdan con lo reportado en alpacas, donde se indica que 8 existe dominancia de células intermedias durante la gestación, las células parabasales se encuentran incrementadas en relación a las llamas vacías y no se encontraron leucocitos ni eritrocitos en frotices vaginales. Tabla 6.- Índice de Maduración en alpacas hembras preñadas η promedio Células superficiales % 4.4 Células Intermedias % 81.2 Células parabasales % 14.4 leucocitos % eritrocitos % Total % 0.0 0.0 100 El análisis estadístico de t de Student para células superficiales de llamas vacías y llamas preñadas presenta alta diferencia significativa (P < 0.05), lo que nos indica que estas células están incrementadas durante la fase folicular, pero que este índice disminuye durante la fase lutea; mientras la misma prueba para células intermedias no evidencia diferencia estadística significativa (P > 0.01), este comportamiento es diferente a lo reportado en alpacas, en las cuales esta diferencia es altamente significativa, pudiéndose diferenciar alpacas preñadas de alpacas vacías mediante la evaluación de frotices vaginales y la observación del índice de maduración, lo que no sucede en llamas. La evaluación del índice de maduración de células epiteliales obtenidas por frotices vaginales en llamas evidencian una dominancia continua de las células intermedias, mientras que las células superficiales a pesar de ser diferentes entre ambos estados fisiológicos, no se encuentran mas allá del 28 %, este comportamiento podría estar indicando que las concentraciones de estrógenos sanguíneos durante la fase folicular no son suficientes para lograr un incremento de la cornificacion y descamación de células superficiales, así como sucede en otras especies en las cuales estas diferencias posibilitan utilizar esta técnica para determinar la fase del ciclo estral o del estado fisiológico en que se encuentra, e incluso ser utilizado como una técnica de diagnostico de gestación, por lo que esta técnica no tendría importancia clínica en esta especie. 4. Modificaciones estructurales en vagina de alpacas (vicugna pacos) en diferentes estadios reproductivos Las muestras histológicas fueron tomadas de 2 hembras vacías y 2 hembras preñadas post mortem, realizando la fijación con Paraformaldehido y luego se realizaron cortes histológicos de 7 micras, coloreadas con Hematoxilina y Eosina y evaluadas en microscopia óptica. 9 Las observaciones de cortes histológicos de vagina (fig. 6) en hembra vacía revelan la presencia de la mucosa cubierta con epitelio plano estratificado homogéneo con apariencia pavimentosa en la mayor parte de su extensión (Feldman, y Nelson, 2000), con 7 capas o más de células, observándose zonas con descamación celular, las que estarían siendo influenciadas por los altos niveles de estrógenos circulantes, puesto que se observo la presencia de un folículo preovulatorio en dichos animales, mientras que el numero de capas celulares estaría confirmando la dominancia estrogénica (Jones, and Edgren, 1973; Hawkins, and Darlow, 1934; Diehl, and Day, 1973), posee pliegues, algunos pronunciados a manera de criptas, la submucosa esta organizada en fibras regulares y de manera laxa con bastante irrigación y presencia de acumulaciones linfociticas (Gartner, y Hiatt, 2002; Xelhuantzi, et al. 2004; Rodríguez, et al. 2004), la capa muscular se encuentra organizada en dos capas delgadas y cubiertas por células mesoteliales al exterior(Gartner, y Hiatt, 2002). Fig 6.- Corte histológico de vagina de hembra vacía En el caso de hembra preñada (Fig. 7), se observa la mucosa con epitelio estratificado plano (Feldman, y Nelson, 2000) con una notoria disminución del numero de capas celulares a 5 o menos indicando la ausencia de estrógenos capaces de producir proliferación celular (Jones, and Edgren, 1973; Diehl, and Day, 1973), pero en algunas zonas se observa la apariencia de un epitelio pseudoestratificado con células cilíndricas y zonas con engrosamiento con células cúbicas hipertrofiadas y pocas células descamadas queratinizadas, lo cual seria un comportamiento celular sui generis en esta especie; el epitelio se observa delgado, con numerosas criptas o pliegues a manera de rugosidades (Xelhuantzi, et al. 2004; Rodríguez, et al. 2004), existen células grandes y globosas y células caliciformes, la submucosa tiene tejido conectivo poco vascularizado y con contenido linfocitarios delgado, la capa muscular se encuentra aumentada en grosor y la disposición de las fibras se observa desordenada, posiblemente debido a que fueron hembras preñadas multiparas (Gartner, y Hiatt, 2002; Rodriguez, J. et al. 2004). Fig 7.- Corte histologico de vagina de hembra preñada. La relación entre la evaluación histológica y los frotices vaginales en hembras vacías y preñadas es evidente, siendo consistente con lo mencionado en otras especies, en las cuales, los frotices vaginales reflejan la acción estrogénica sobre el epitelio vaginal y a 10 su vez se estaría reflejando la actividad ovárica, estos resultados podrían permitirnos utilizar la técnica de la colpocitologia y la determinación del índice de maduración para ser utilizada como una técnica alternativa de diagnostico de gestación en alpacas, 5. Diagnostico de gestación mediante frotices vaginales y ecografía en alpacas (vicugna pacos) Se realizo el muestreo de 15 alpacas (3 por día) con diferentes días post copula (0, 3, 6, 9 y 12 días), comparándose luego a la necropsia mediante los hallazgos de presencia de cuerpo lúteo, embrión o hembra vacía (experimento I). Se realizo el diagnostico de gestación mediante ecografía, utilizando un ecógrafo Medical con transductor transrectal de 5 MHz, se dividió en dos grupos de alpacas, el primer grupo de 22 alpacas gestantes con 3 meses post copula y el segundo grupo de 37 alpacas gestantes con 4 meses post copula, al mismo tiempo se obtuvo los frotices vaginales y luego se comparó los resultados contrastándolos con los resultados de ecografía (experimento II). El análisis estadístico se realizó mediante un diseño completamente al azar y se obtuvo las medidas de tendencia central y la prueba de Chi-Cuadrado para determinar la diferencia entre los resultados entre los dos tiempos de muestreo y las dos técnicas utilizadas. Al día 0 las tres alpacas estuvieron vacías, a los 3 y 6 días todas las alpacas presentaron cuerpo lúteo por lo que estaban en fase lútea, a los 9 y 12 días, todas las alpacas tuvieron la presencia de embrión además de la presencia de cuerpo lúteo, los resultados promedio hallados se resumen en la tabla 7: Tabla 7.- Porcentajes de los Índices de maduración en promedio encontrados en alpacas a los 0, 3, 6, 9 y 12 días post copula. Tipos celulares Día 0 Día 3 Día 6 Día 9 Día 12 Superficiales 32.3 65.3 56.9 42.4 28.0 Intermedias 60.9 32.8 37.6 52.2 59.4 parabasales 6.8 1.9 5.5 5.4 12.4 Total (%) 100 100 100 100 100 De acuerdo a estudios previos, el índice de maduración de células del epitelio vaginal refleja la actividad ovárica de fase folicular, presentándose un alto porcentaje de células superficiales en hembras vacías (>60%) y valores menores a este 11 corresponden a hembras preñadas o en fase lutea; el comportamiento de este índice en este experimento I demuestra una baja cantidad de células superficiales al día 0, donde se hallo folículos preovulatorios (> a 7 mm), y se estaría debiendo a que estas alpacas tuvieron a esa fecha un promedio de 20 días post parto y que el mayor porcentaje de células intermedias encontradas corresponden a un cambio epitelial de una gestación anterior y que aun no existió el recambio celular completo de la mucosa vaginal; al día 3 las células superficiales llegan a su mas alto nivel, pero tomando en cuenta que al día 3, el cuerpo lúteo esta aun en crecimiento y no es dominante (Bravo, 2002), podría estar reflejando una descamación acelerada debido a la alta concentración de estrógenos producidos por el folículo que ovuló 3 días antes, estas células van descendiendo gradualmente en los días 6, 9 y 12 de muestreo, demostrando al día 12 una dominancia de las células intermedias, lo cual es compatible con un estado de gestación. las células parabasales se encuentran en baja cantidad durante todos los días de observación. Luego de la realización de la evaluación colpocitologica en 22 alpacas de 3 meses post copula las cuales fueron determinadas como gestantes mediante ecografía, los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8 y en alpacas de 4 meses post copula se muestran en la tabla 10: Tabla 8.- Comparación de diagnósticos de gestación hallados mediante citología exfoliativa vaginal y ecografía a los 3 meses post copula. condición preñadas diagnostico por ecografía 22 (100 %) diagnostico por citología exfoliativa vaginal 19 (86.4 %) De los resultados encontrados, se encontró 22 alpacas preñadas mediante ecografía, de estas 22 alpacas, 19 hembras fueron diagnosticadas como gestantes mediante la técnica de citología exfoliativa vaginal, las cuales tuvieron 30.67 % de células superficiales en promedio, y las tres alpacas vacías tuvieron como promedio 75.3 % de células superficiales (Tabla 9); lo cual representa el 86.4 % de confiabilidad de esta nueva técnica propuesta; las 3 alpacas que restan representan un 13.6 % de error de esta técnica. Tabla 9.- Índices de maduración para alpacas vacías y preñadas encontradas mediante frotices vaginales en alpacas a los 3 meses post monta. células alpacas vacías alpacas preñadas (%) (%) superficiales 75.3 30.67 intermedias 23.4 66.8 12 parabasales 1.3 3.25 Tabla 10.- Comparación de diagnósticos de gestación hallados mediante citología exfoliativa vaginal y ecografía de 4 meses post copula. diagnostico por ecografía 37 (100 %) condición preñadas diagnostico por citología exfoliativa vaginal 27 (73.0 %) De los resultados hallados, se encontró 37 alpacas preñadas mediante ecografía, de estas 37 alpacas, 27 hembras fueron diagnosticadas como gestantes mediante la técnica de citología exfoliativa vaginal, las cuales presentaron un promedio de 27.8 % de células superficiales, mientras que las alpacas vacías tuvieron 74.03 % de células superficiales (Tabla 11), lo cual representa el 73.0 % de confiabilidad de esta nueva técnica propuesta; las 10 alpacas que restan representan un 27.0 % de error de esta técnica. Tabla 11.- Índices de maduración para alpacas vacías y preñadas encontradas mediante frotices vaginales en alpacas a los 4 meses post monta. alpacas vacías alpacas preñadas (%) (%) superficiales 74.03 27.8 intermedias 24.7 68.8 parabasales 1.27 3.4 células Luego de realizar una prueba de Ji-cuadrado con corrección de Yates entre los porcentajes encontrados a los 3 (86.4 %) y 4 (73.0 %) meses, no se encontró diferencia estadística entre ambos resultados (P>0.05), lo cual nos indica que estos resultados son consistentes con un comportamiento similar en ambos meses de muestreo. Estos resultados son ligeramente inferiores a los porcentajes de gestación obtenidos por ecografía reportados por Alarcón, et al 1989 y por Ampuero, et al 1989, puesto que estos autores realizaron el diagnostico de gestación de manera mas temprana, a los 70 y 80 días respectivamente. En todos los casos, las alpacas vacías presentaron mas del 60 % de células superficiales, similar a lo reportado en otras especies, existiendo antecedentes de utilización de la colpocitologia exfoliativa para el diagnostico de gestación en otras especies (Rios, et al. 1999; Callitrix sp; Mitchell and Jones 1975), estos resultados representan una nueva posibilidad de realizar el diagnostico de gestación en la alpaca, así como se realiza en especies como la chinchilla y el hurón (Bekyürek, et al. 2002; Williams, et al. 1992). 13 Se puede concluir que existe un cambio del epitelio vaginal en alpacas preñadas, lo cual puede ser evaluado mediante frotices vaginales y teñidos con Whrigt para obtener el índice de maduración en estadios tan tempranos como en los primeros 12 días de gestación; en el experimento II, en ambas observaciones a los 3 y 4 meses de gestación, comparando con la técnica de ecografía, se puede concluir que el porcentaje de confiabilidad para la técnica de diagnostico de gestación mediante frotices vaginales es aceptable, puesto que en promedio de las dos observaciones se tiene un 79.7 %, por lo cual se podría recomendar esta técnica como una alternativa de diagnostico de gestación. 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