CLONAMIENTO, EXPRESION Y PURIFICACION DEL GEN DE LA NUCLEOPROTEINA DEL VIRUS RESPIRATORIO SINCICIAL. (Cloning, expression and purification of nucleoprotein gene from respiratory syncytial virus) Vásquez A(1),Manzur M(2), Rivero B (1), González P (1), Maldonado E (3), Avendaño LF (2), Fernández JA(2). (1)Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de Salud Pública. Programas de (3)Biología Celular y Molecular y (2)Virología, ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile. <jfernandez_virol@yahoo.com> Introducción: El VRS es el principal agente causal de bronconeumonia en lactantes menores de 2 años. El análisis de la respuesta inmune contra antígenos definidos del virus es fundamental para estudios epidemiológicos y de inmunoprofilaxis contra esta infección viral. El VRS posee 2 antígenos inmunodominantes en su envoltura (glicoproteínas GyF). Sin embargo, la variabilidad antigénica de estas proteínas puede ser un obstáculo en el análisis de la respuesta inmune contra el VRS. El gen N es el más conservado entre todos los aislados virales de VRS descritos y estudios recientes indican que la proteína que codifica este gen es reconocida por anticuerpos y linfocitos T de sujetos inmunes contra el VRS Objetivo: Clonar, expresar y purificar la proteína del gen codificante de la nucleoproteína (N) del VRS, grupo A Mon3/88, cepa prototipo de aislados VRS del Cono Sur. Métodos: Se diseñaron partidores complementarios a los extremos 5' y 3' del gen N del VRS A2 (GenBank). Se obtuvo el cDNA por RT-PCR utilizando como templado RNA de células Hep-2 infectadas con VRS A Mon3/88. El cDNA fue clonado en el vector PUC19 y analizado en secuenciador automático. El gen N fue posteriormente subclonado en el vector de expresión pET15b y transformado en E.coli BL21. La proteína expresada fue purificada en columna Ni-NTA y analizada por SDS-PAGE y Western Blot Resultados. El secuenciamiento parcial del gen ( 60% extremo 5') revela un 97% de homología con el gen N de cepas VRS obtenidas en otras zonas geográficas. La proteína fue expresada después de 2 horas de inducción a 30°C en presencia de ITPG. El análisis mediante SDS-PAGE mostró una banda de 45 Kda aprox. La proteína fue soluble bajo las condiciones utilizadas en la expresión y purificada utilizando los residuos de histidina ubicados en el extremo N-terminal de la proteína. Sueros de sujetos hiperinmunes para el VRS reaccionan con la proteína recombinante en Western-Blot. Conclusiones: El análisis de secuenciación indica que el gen clonado corresponde al gen N del VRS. La purificada posee propiedades bioquímicas e inmunológicas concordantes con la proteína previamente descrita. Esta proteína será utilizada en estudios de respuesta inmune (celular) contra el VRS. El uso de la nucleoproteína N en estos estudios podría respresentar una ventaja sobre las glicoproteínas G y F, en las cuales la extensa varianción antigénica representa una limitante para la detección de respuesta inmune contra el VRS. IDENTIFICACION DEL EXPOSITOR Abel Eduardo Vásquez Veloso Centro de Investigación y Desarrollo, Departamento de Producción, Instituto de Salud Pública de Chile. Av. Marathon 1000, Ñuñoa. Santiago. tel: 3507516 avasquez@ispch.cl Modalidad: Panel