Validación de la hibridación de ácidos nucleicos múltiple quimioluminiscente en la detección de viroides de cítricos y su aplicación en áreas citrícolas de Cuba. Autores: K. Velázquez¹, J. M. Pérez¹, L. Batista¹, E. López¹, S. Yepe¹, J. Cueto 1, M. Alvarez¹, R. Pérez¹, D. Rodríguez¹, I. Peña 1 y N. Duran-Vila². ¹Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Playa. C. Habana. Cuba. C.P 11300. ²Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. Valencia. España. C.P 46113. Resumen Los viroides en los cítricos son causantes de dos enfermedades de importancia económica, la exocortis y la cachexia. Las pérdidas en este cultivo dependerán entre otros factores, de las especies de viroides presentes, así como de los patrones y cultivares empleados. Debido a esto, resulta necesario disponer de técnicas de diagnóstico confiables que garanticen la calidad de la certificación del material de propagación. En este trabajo se validó la hibridación de ácidos nucleicos quimioluminiscente para la detección simultánea de todos los viroides identificados en los cítricos. Se determinó que los porcentajes de eficacia, sensibilidad, especificidad, repetibilidad y reproducibilidad fueron superiores al 97%. La aplicación de dicha técnica en la detección de viroides permitió determinar que el Banco de Germoplasma y los viveros multiplicadores se encontraron libres de viroides, lo que confirma la calidad del sistema de producción de material de propagación certificado. Sin embargo, en áreas citrícolas se detectó la presencia de viroides, con porcentajes de plantas infectadas entre 10 y 37.5%. Palabras claves: cítricos, viroide, NASH y quimioluminiscente. Introducción Los viroides son los fitopatógenos más pequeños que existen, compuestos únicamente por una molécula de ácido ribonucleico (ARN) de pequeño tamaño, que carece de proteína de cubierta (Flores et al., 1998). En cítricos se ha informado la presencia de cinco especies de viroides, que han sido catalogadas según sus propiedades biológicas y moleculares. De ellas, el viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd) y variantes específicas de cítricos (variantes tipo CVd IIb) del viroide del enanismo del lúpulo (HSVd) son responsables de las enfermedades exocortis y cachexia de los cítricos, respectivamente. Otra variante del HSVd (variante tipo CVd IIa), el viroide de la hoja curvada de los cítricos (CBLVd), el viroide enanizante de los cítricos (CDVd) y el viroide IV de los cítricos (CVd IV) se asocian a efectos enanizantes en combinaciones sensibles (Duran-Vila, 2000). Posteriormente, se informó en Japón un nuevo viroide al que se le denominó CVd-OS (Viroide de los cítricos original sample) (Ito et al., 2001). En la mayoría de las áreas citrícolas del mundo, las pérdidas económicas debido a viroides no han sido muy importantes ya que la citricultura se ha basado mayoritariamente en el empleo del patrón naranjo agrio (Citrus aurantium L.), que es tolerante a los viroides. Sin embargo, luego de la aparición de la tristeza de los cítricos, muchos países han reemplazado este patrón, por otros que, si bien toleran a esta enfermedad, algunos resultan sensibles a los viroides. Esto ha ocasionado pérdidas considerables en varios países, como Belice y Venezuela debido al establecimiento de plantaciones con material no certificado contaminado con viroides (Ochoa et al., 1995; Roistacher et al., 1996). En Cuba a finales de los años 70 fueron afectadas plantaciones establecidas con yemas infectadas con viroides sobre los patrones citrange Troyer y Carrizo (Poncirus trifoliata x Citrus sinensis L. (Obs.)) (del Valle et al., 1978). Para evitar estas pérdidas, resulta imprescindible disponer de técnicas de diagnóstico rápidas, sensibles y confiables en los sistemas de producción de material de propagación certificado de cítricos. Por tal motivo en el presente trabajo se validó la hibridación de ácidos nucleicos múltiple para la detección de viroides en áreas citrícolas de Cuba. Materiales y Métodos Determinación de los parámetros de desempeño de la NASH. Las evaluaciones se realizaron utilizando mezclas de las sondas correspondientes a cinco especies de viroides de cítricos (CEVd, CBLVd, HSVd, CDVd y CVd IV) (Palacio et al., 1999). Los indicadores de desempeño se determinaron siguiendo la metodología de Peralta y Villoch, (1999). Controles de plantas sanas e infectadas. Se utilizaron 135 controles negativos, que incluyeron plantas de cidro sanas e infectadas con el virus de la psorosis de los cítricos (CPsV), virus de la tristeza de los cítricos (CTV), Concave Gum, así como extractos de ARN del viroide de la mancha soleada del aguacate (ASBVd), el viroide del enanismo del crisantemo (CSVd) y el viroide del tubérculo ahusado de la papa (PSTVd). La confirmación de la presencia del CTV y CPsV se determinó mediante ensayos inmunoenzimáticos ELIS A-DASI con el empleo de anticuerpos específicos para cada patógeno (Alioto et al., 1999; Batista, 2001). Mientras que la presencia de Concave gum se determinó por ensayos biológicos en naranjo dulce Pineapple (Citrus sinensis Obs.) (Pérez y Vega, 1986) y o l s viroides mediante sPAGE (Rivera-Bustamante et al., 1986). Los 200 controles positivos comprendían 189 plantas de cidro Etrog Arizona 861 S1 injertados sobre el patrón Citrus volkameriana o citrange Troyer, de ellas 126 fueron inoculadas con aislados de composición de viroides conocida y el resto con muestras procedentes de árboles de campo infectados. La presencia de viroides en los controles se determinó mediante síntomas en cidro y análisis de los ácidos nucleicos por sPAGE. Además, se incluyeron 11 plásmidos con la secuencia completa de cada especie de viroide, comprobada por secuenciación. Purificación de ácidos nucleicos. La extracción de los ácidos nucleicos totales se realizó según el procedimiento de Semancik et al. (1975). Hibridación de ácidos nucleicos. El procedimiento de hibridación de ácidos nucleicos utilizado fue el descrito por Palacio et al. (1999). Estimación preliminar de la repetibilidad. Se realizaron dos ensayos en días diferentes, donde se analizaron 13 controles infectados y seis controles no infectados replicados tres veces en cada membrana. Se determinó la densidad óptica (DO) de la señal de cada muestra con el programa Molecular AnalystTM, Versión 1.4.1, Biorad Laboratories 19921995. Los valores de DO obtenidos se analizaron mediante un análisis de varianza para la comparación de medias (ANOVA) empleando el paquete estadístico SPSS (Statistical Package for Social Science, versión 9.0, 1998) y se determinaron los coeficientes de variación (Netter et al., 1996). Se evaluó además la distribución de los viroides en las plantas para analizar su influencia en la repetibilidad. Para ello se muestrearon 6 plantas infectadas y se tomaron de cuatro a cinco ramas en cada una. En todos los casos la muestra de una de las ramas estaba compuesta exclusivamente por hojas, otra sólo por corteza y el resto contenían corteza y hojas. Las muestras fueron evaluadas por NASH individualmente y se replicaron dos veces en cada ensayo. Determinación de la sensibilidad analítica. Se utilizaron cinco extractos purificados a partir de cidros infectados, uno por cada especie de viroide independiente, así como uno con la mezcla de todas ellas y uno no infectado. Se emplearon extractos de ácidos nucleicos puros y diluidos siete veces hasta 5x10-4 y de cada dilución se realizaron dos repeticiones en dos membranas. Se midió la DO de la señal obtenida para cada muestra con el programa Molecular AnalystTM. Se analizó la normalidad de los datos mediante un gráfico de percentiles de los residuos con respecto a la distribución normal, se realizó un análisis de varianza de clasificación simple y se aplicó el método de comparaciones múltiples HSD-Tukey para determinar la última dilución que mostró diferencias significativas con el control negativo mediante el programa Stadistica 5.1. Además, se realizaron curvas de mejor ajuste mediante un análisis de regresión. Especificidad analítica. Se evaluó la posible reacción cruzada de las sondas con otros patógenos empleando en el análisis plantas de cidro infectadas con el CPsV, concave gum y el CTV, así como extractos de ARN del PSTVd, ABSVd y del CSVd, replicados dos veces en una membrana. Precisión del ensayo. Para evaluar la repetibilidad se realizó un ensayo donde se analizaron 12 controles de plantas infectadas con viroides y uno no infectado, replicados dos veces en la membrana. Los extractos se analizaron en dos ensayos realizados en días diferentes. Se evaluó la reproducibilidad en dos ensayos realizados por laboratorios y operarios diferentes. Para ello, se analizaron 11 controles de plantas infectadas, así como cinco controles negativos, replicados tres veces por membrana. Se midió la DO de la señal con el programa Molecular AnalystTM, los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante un ANOVA utilizando el paquete estadístico SPSS y se determinaron los coeficientes de variación (Netter, et al., 1996). Parámetros de desempeño. Se determinaron los indicadores de validación propuestos por Peralta y Villoch (1999). Se realizaron análisis independientes para los resultados obtenidos con la población (todos los controles), las especies de viroides individuales y las combinaciones presentes en los aislados. En los cálculos de los indicadores se emplearon las siguientes fórmulas: w w w w w Sensibilidad diagnóstica: D-SN=Vp/(Vp+Fn). Especificidad diagnóstica: D-SP=Vn/(Vn+Fp). Eficacia: E=Vp+Vn/(Vp+Vn+Fp+Fn). Valor predicitivo de positividad: Vpp=Vp/(Vp+Fp). Valor predicitivo de negatividad: Vpn=Vn/(Vn+Fn). Donde Vp: Verdaderos positivos, Vn: Verdaderos negativos, Fp: Falsos positivos, Fn: Falsos negativos. Determinación de la presencia de viroides en áreas citrícolas de Cuba. Se realizó un muestreo para la detección de viroides en siete empresas citrícolas del país. Para ello se seleccionó un cuadrante de 400 plantas de un campo de cada empresa y se muestreó al azar el 10% de los árboles. Se analizaron además, el 100% de los cultivares cítricos de la colección de variedades de la Estación de Jagüey Grande y el Banco de Germoplasma Protegido del IIFT, ubicado en la Estación de Alquízar, así como el 10 % de las diferentes variedades presentes en los viveros multiplicadores de las empresas Cítricos Ceiba, Troncoso, Victoria de Girón y la Estación de Alquízar. En la Tabla 1 se muestran datos de las áreas evaluadas. Tabla 1. Descripción de las áreas citrícolas analizadas. Empresa Cítricos Ceiba Patrón naranjo agrio Variedad pomelo Ruby Red (Citrus paradisi Macf.) Guane Jesús Montané UCTB Alquízar (Germoplasma) UCTB Jagüey Grande (Colección) Cítricos Ciego América Libre Arimao Victoria de Girón naranjo agrio citrange Carrizo Varios pomelo Marsh naranjo Valencia 121 (Citrus sinensis (L.)) Varios Varios Varios naranjo agrio naranjo agrio citrange Troyer citrange Carrizo naranjo Olinda limero Persa (Citrus limonia Osb.) naranjo Valencia 121 naranjo Valencia Vivero multiplicador Victoria de Girón Vivero multiplicador Cítricos Ceiba Vivero multiplicador Enrique Troncoso Vivero multiplicador UCTB Alquízar Citrus volkameriana naranjo Valencia criolla y Olinda Valencia, pomelo Ruby Red y Marsh Jibarito, Limero Persa Citrus volkameriana naranjo Valencia Criolla, 121 y Olinda Valencia Citrus volkameriana naranjo Valencia 121 Citrus volkameriana naranjo Valencia criolla, 121, ENMC 27, pomelo Henderson, Ruby Mejorado En los viveros multiplicadores se injertaron yemas certificadas de cidro en dos plantas de cada variedad cítrica. En el caso de los árboles de campo y colecciones se inocularon en plantas de cidro Etrog Arizona 861 S1, injertado sobre el patrón Citrus volkameriana. A los tres meses después de su inoculación estas plantas se purificaron según el procedimiento de Semancik et al. (1975). Los extractos de ácido nucleicos obtenidos se analizaron mediante NASH múltiple y los que resultaron positivos con la mezcla de sondas fueron analizados con sondas específicas para cada especie de viroide (Palacio et al., 1999). La presencia de viroides se determinó teniendo en cuenta el porcentaje de plantas de cidro positivas detectadas con respecto al total de las analizadas. Resultados y Discusión Estimación preliminar de la repetibilidad. Los resultados obtenidos en los ensayos realizados para determinar la repetibilidad intra e intermembrana de los diferentes controles se muestran en la Figura 1. Como se aprecia, por la longitud de las cajas, en general se observó poca variabilidad, que fue ligeramente superior el día 2. Además, al comparar los coeficientes de variación que se muestran en la Tabla 2 se observó que las réplicas del mismo día mostraron valores menores al 10% para todos los controles y en días diferentes inferiores al 20%. Estos límites se encuentran dentro de los establecidos por Jacobson (1996), por lo que los valores obtenidos en este ensayo indican que la técnica presenta una buena repetibilidad. Esta alta concordancia de los análisis de hibridación ya había sido planteada por González et al. (2001) al validar la NASH para la detección de PSTVd. 70 60 50 40 30 DIA P/N 20 1 10 2 N= 3 3 1 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 5 6 7 8 3 3 3 3 9 10 3 3 3 3 3 3 11 12 13 CONTROLES POSITIVOS Figura 1. Evaluación de la repetibilidad preliminar de la NASH múltiple con 13 controles positivos en días diferentes. Los resultados están expresados como relaciones positivo/negativo. Tabla 2. Resultados de la evaluación de la repetibilidad preliminar de la NASH múltiple en días diferentes. Control Día 1 Día 2 Media S CV Media S P/N P/N E-L-1 151 26.76 2.38 8.88 22.92 1.74 E-9 195 16.50 0.09 0.55 13.45 0.69 E-1036 178 56.95 1.27 2.23 51.61 0.71 E-937 169 29.04 0.96 3.31 25.91 1.99 E-937 141 66.95 1.38 2.06 52.56 0.33 E-937 173 25.09 0.27 1.08 20.20 1.94 Cl 14-24 144 46.62 0.83 1.79 37.15 0.52 Cl 14-24 21 15.49 0.33 2.11 14.07 0.03 E-1036-T-I.4 67.88 1.32 1.95 53.71 0.69 Val 18-15 18 27.78 0.09 0.33 24.04 0.16 E-937 149 23.31 0.11 0.47 22.06 0.04 E-9 196 53.86 2.01 3.74 42.64 0.56 E-937 172 45.29 0.27 0.60 35.86 0.85 S: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación. P/N: Relación positivo/negativo. CV 7.60 5.16 1.37 7.68 0.62 9.59 1.41 0.19 1.29 0.65 0.18 1.32 2.37 Días 1 y 2 Media P/N S 24.84 14.98 54.28 27.47 59.76 22.65 41.88 14.78 60.80 25.91 22.69 48.25 40.58 2.72 2.15 3.77 2.21 10.17 3.45 6.69 1.00 10.02 2.65 0.88 7.93 6.67 CV 10.93 14.38 6.95 8.06 17.02 15.26 15.98 6.76 16.48 10.22 3.87 16.44 16.44 Los resultados de la evaluación de la distribución de los viroides en las plantas de cidro mostraron un porcentaje elevado de detección de los viroides en las ramas (75-100%). No obstante, se encontraron tres casos con ramas negativas, correspondientes a los aislados E-1020, E-10 y E-937. Estos resultados pudieran deberse a la distribución irregular de los viroides en la planta y al tipo de muestra analizada, debido a que en estos casos el material vegetal estuvo constituido por hojas a diferencia del resto que contenían además, corteza. Varios autores han informado que los viroides en árboles cítricos se encuentran en mayor concentración en la corteza que en las hojas, donde en algunas ocasiones no se ha sido detectado viroides en una planta infectada (Palacio, 1999; Barbosa et al., 2001). En el caso de los aislados E-9 y E-L-1 las muestras de hojas resultaron positivas, lo cual probablemente se deba a que estos aislados contenían al viroide CEVd. En estudios previos se determinó que este viroide alcanza concentraciones elevadas en cidro que posibilitan su detección a partir de hojas (Li et al., 1995). Determinación de la sensibilidad analítica. En la Figura 2 se muestran los resultados de la sensibilidad analítica de todas las especies de viroides y la mezcla de ellas en la NASH múltiple. Como se puede apreciar con el aumento de la dilución, disminuyen los valores de DO. Los valores de los coeficientes de determinación obtenidos para cada especie y la mezcla de ellas estuvieron cercanos a 1, lo que indica una buena calidad en el ajuste de los datos. LD Mezcla y = 0,285Ln(x) + 3,26 DO 4 MEZCLA 2 R = 0,9945 CN 2 Logarítmica (MEZCLA) 0 0 0,5 1 1,5 1/Dilución Figura 2. Resultados del límite de detección (LD) de la NASH múltiple para la mezcla de los cinco viroides. El análisis de varianza de clasificación simple entre los niveles de log DO de las diluciones, mostró diferencias significativas entre ellas para P< 0.01, y el método de comparaciones múltiples HSD-Tukey permitió definir que la dilución 10-2 fue la máxima que mostró niveles significativamente distintos del control negativo. Estos resultados corroboraron que la hibridación posee un límite de detección que resulta suficiente para el diagnóstico de rutina en material vegetal de cidro, similar al determinado por otros autores (Romero et al., 1995). El límite de detección se encontró en la dilución 10-2, tanto para el aislado que contenía la mezcla de los cinco viroides, como los que tenían cada viroide individual, excepto para el CEVd, que pudo ser detectado hasta la dilución 10-3. Estos resultados confirman lo señalado por Palacio (1999) con respecto a que esta especie alcanza concentraciones superiores en cidro, en comparación con el resto que en general alcanzan concentraciones similares una vez que la infección está establecida. Especificidad analítica. El sistema evaluado no detectó reacción positiva de las sondas frente a patógenos que se encuentran en el cultivo de los cítricos como CTV, CPsV y Concave gum. Igualmente mostró su especificidad de reacción frente a los viroides ASBVd y CSVd. La especificidad de algunas de las sondas de estas especies de forma independiente ha sido demostrada por otros autores (Astruc et al., 1996; Nakahara et al., 1999). En el caso de PSTVd, existió una reacción positiva aunque muy débil, que se debe a la alta homología de secuencia compartida entre el CEVd y el PSTVd. Esta reacción cruzada ha sido determinada por Schwnghamer y Broadbent (1987) y Albanese et al. (1988) al evaluar sondas de ADNc de PSTVd y CEVd frente a estos viroides. Precisión del ensayo. Los resultados obtenidos al evaluar la repetibilidad mostraron que la variabilidad entre las réplicas en la misma membrana es mínima como se puede apreciar por los coeficientes de variación, que se muestran en la Tabla 3, que resultaron inferiores al 7%. Sin embargo, se encontraron diferencias entre los días para algunos controles, lo que provocó que existieran valores superiores al 10%, que es lo recomendado por Jacobson (1996) para esta fase de la validación. No obstante, estos coeficientes de variación fueron cercanos al 10%, con la excepción de un control cuyo valor fue de 18.3. Estos resultados pudieran deberse a las variaciones en el fondo de las películas como ha sido determinado por Caciagli y Bosco (1996). Tabla 3. Resultados de la evaluación de la repetibilidad de la NASH múltiple en días diferentes. Día 1 Día 2 Media S CV Media S CV (P/N) (P/N) M 1-1 40.55 0.62 1.53 41.80 0.67 1.60 M 1-2 13.85 0.18 1.26 15.00 0.20 1.35 M 1-3 7.93 0.00 0.03 10.29 0.02 0.18 M 1-4 5.90 0.40 6.71 7.25 0.43 5.94 E-1024-1 36.15 0.26 0.71 37.07 0.28 0.74 E-1024-2 15.24 0.37 2.40 16.61 0.43 2.56 E-1024-3 14.69 0.38 2.57 17.73 0.18 1.00 E-1024-4 10.39 0.36 3.48 11.24 0.31 2.78 E-937-1 115.54 0.15 0.13 121.89 0.16 0.13 E-937-2 127.26 0.36 0.28 144.31 0.38 0.26 E-937-3 86.34 0.25 0.29 103.94 0.49 0.47 E-937-4 42.93 0.24 0.56 45.93 1.21 2.64 S: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación. P/N: Relación positivo/negativo. Control Día 1 y 2 Media S (P/N) 41.17 0.88 14.43 0.81 9.11 1.67 6.58 0.96 36.61 0.65 15.92 0.96 16.21 2.15 10.82 0.60 118.72 4.49 135.78 12.06 95.14 12.45 44.43 2.12 CV 2.15 5.61 18.30 14.53 1.79 6.05 13.26 5.55 3.78 8.88 13.08 4.78 Por otra parte, se determinó que la NASH presentó alta reproducibilidad, como se puede apreciar en el diagrama de caja en la Figura 3. Los coeficientes de variación obtenidos en este ensayo, que se muestran en la Tabla 4, fueron inferiores al 9% en las réplicas intramembranas. No obstante, el operario 2 de forma general obtuvo mayores valores en la relación P/N, lo que indicó variabilidad entre los operarios, obteniéndose valores cercanos a 20% en uno de los controles. Sin embargo, el análisis de varianza no mostró diferencias significativas entre ellos. La variación en los valores obtenidos en algunos de los controles, probablemente se deba a diferencias en el fondo seleccionado para medir la DO de los controles en las películas. 140 120 100 80 60 40 20 OPERARIO P/N 0 1 2 -20 N= 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 2 3 4 5 6 7 3 3 8 3 3 3 3 3 3 9 10 11 CONTROLES POSITIVOS Figura 3. Evaluación de la reproducibilidad de la NASH múltiple. Los resultados están expresados como relaciones positivo/negativo (P/N). Tabla 4. Resultados de la evaluación de la reproducibilidad de la NASH múltiple. Operario 1 Operario 2 Operarios 1 y 2 Media S CV Media S CV Media S CV (P/N) (P/N) (P/N) E-9 93.71 0.13 0.14 111.52 1.24 1.11 102.62 12.59 12.27 E-1036 37.34 1.04 2.79 41.91 3.76 8.97 39.62 3.23 8.14 E-10 6.60 0.24 3.62 6.88 0.43 6.25 6.74 0.20 2.94 E-2 71.31 1.54 2.16 82.23 3.57 4.34 76.77 7.72 10.05 E-1020 91.42 2.53 2.76 103.75 0.77 0.74 97.59 8.72 8.94 MS 62.15 2.61 4.20 73.27 0.57 0.78 67.71 7.87 11.62 E-265 30.11 0.41 1.36 30.64 0.35 1.13 30.38 0.37 1.22 E-9 213 31.89 0.12 0.39 30.38 0.06 0.21 31.13 1.07 3.44 E-7 4.37 0.38 8.60 5.66 0.23 4.14 5.01 0.92 18.26 E-9 456 48.12 0.32 0.66 46.29 0.27 0.58 47.20 1.29 2.73 E-L-1 109.28 2.60 2.38 123.11 1.22 0.99 116.19 9.78 8.42 S: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación. P/N: Relación positivo/negativo. Control Parámetros de desempeño. Los resultados de la evaluación de los controles de la hibridación dot-blot múltiple, tanto de la población general, como de las especies individuales y las diferentes combinaciones presentes en los aislados se presentan en la Tabla 5. Como se puede apreciar no existen falsos positivos, sin embargo, se detectaron tres falsos negativos, que correspondieron a un aislado de HSVd (E-10), uno de CVd IV (E-1020) y otro de la combinación HSVd y CDVd (E-937). Tabla 5. Resultados de la evaluación de una población de controles positivos y negativos mediante NASH múltiple. Resultados Positivo NASH Negativo Controles de Referencia Infectado No infectado 197 (Vp) 0 (Fp) 3 (Fn) 135 (Vn) Vp: Verdaderos positivos, Vn: Verdaderos negativos, Fp: Falsos positivos, Fn: Falsos negativos. La presencia de falsos negativos pudiera deberse no sólo al desempeño de la técnica, sino a la dificultad del diagnóstico de viroides cuando éstos se encuentran en bajas concentraciones o se distribuyen irregularmente, lo que coincide con los resultados de otros autores (Duran-Vila et al., 1991; Roistacher, 1991). Los indicadores de validación determinados para la NASH con la mezcla de las cinco sondas se muestran en la Tabla 6. Los resultados obtenidos demostraron una alta eficacia de la técnica para el diagnóstico de todos los viroides de cítricos evaluados, tanto para las especies independientes como para las mezclas entre ellas, con parámetros evaluativos estimados por encima del 97 % para la población en general. Tabla 6. Parámetros de desempeño obtenidos para la NASH quimioluminiscente en la detección de viroides de cítricos. Indicadores de desempeño Sensibilidad diagnóstica (D-SN) Especificidad diagnóstica (D-SP) Eficacia (E) Valor predictivo de positividad (Vpp) Valor predicitvo de negatividad (Vpn) NASH Múltiple 98.5% 100% 99.1 100% 97.82 Al evaluar las especies de viroides CEVd, CBLVd, CDVd, las combinaciones CEVd-CDVd, HSVd-CVd IV, CEVd-HSVd-CDVd y la mezcla de todos los viroides se obtuvo un 100 % para todos los parámetros evaluados. Mientras que, al analizar los viroides HSVd, CVd IV y la combinación HSVd-CDVd los indicadores fueron superiores al 92 %. Los resultados obtenidos permiten la aplicación de la técnica en el diagnóstico de rutina de los viroides con alta confiabilidad y con valores en los indicadores comparables a los obtenidos por otros autores (Batista, 2001; González et al., 2001). El análisis de muestras inoculadas con aislados que contenían un único viroide o mezclas de ellos, así como plantas no infectadas demostró que la mezcla de las cinco sondas ADN fue capaz de discriminar entre plantas infectadas y plantas libres de viroides, lo que había sido demostrado previamente por Palacio et al., (1999). Determinación de la presencia de viroides en áreas citrícolas de Cuba. En la Tabla 7 se muestran los resultados de la determinación de la presencia de viroides en las áreas citrícolas del país que fueron evaluadas. Como se puede apreciar, a excepción del Banco de Germoplasma Protegido y los viveros multiplicadores, en el resto de las áreas se detectó la presencia de diferentes especies de viroides. Tabla 7. Resultados del análisis mediante NASH múltiple de plantas procedentes de diferentes áreas citrícolas. Empresa Jesús Montané Guane Cítricos Ceiba UCTB de Jagüey Grande (Colección) Victoria de Girón Arimao Cítricos Ciego América Libre UCTB de Alquízar (Germoplasma) Viveros multiplicadores* TOTAL Mezcla 10 17.5 7.89 18.38 Porcentaje de plantas infectadas CEVd CBLVd HSVd CDVd 0 0 0 10 7.5 0 12.5 5 0 0 5.26 5.26 9.56 2.21 11.76 9.56 CVd IV 0 2.5 2.63 4.41 37.5 17.5 20 34.21 0 2.5 2.5 7.5 21.05 - 0 0 0 0 - 22.5 7.5 15 15.79 - 12.5 5 2.5 13.16 - 5 2.5 5 2.63 - 0 14.39 5.09 0.53 8.25 5.96 2.46 *Comprende los viveros multiplicadores de la Estación de Alquízar, Empresa Cítricos Ceiba, Victoria de Girón y Enrique Troncoso). El 14.39% del total de los árboles analizados estaban infectados con viroides. Los mayores porcentajes de infección se encontraron en los campos correspondientes a las Empresas Victoria de Girón (37.5%) y América Libre (34.21%). El resto de los campos, presentaron porcentajes más bajos (10-20%), correspondiendo el menor porcentaje al campo de la Empresa Jesús Montané. Los viroides identificados en las áreas citrícolas fueron CEVd, CBLVd, HSVd, CDVd y CVd IV, de ellos los más frecuentes fueron CEVd (35.37%), HSVd (57.32%) y CDVd (41.46%). Los viroides CBLVd y CVd IV se detectaron en menor porcentaje (3.66 y 17.07, respectivamente). Este constituye el primer informe de la presencia del viroide CBLVd en áreas citrícolas de Cuba. Los estudios realizados en áreas citrícolas de otros países coinciden con lo determinado en este trabajo. Por ejemplo, Villalobos et al. (1997) y Škoric et al. (2001) determinaron que en áreas citrícolas de Costa Rica y Croacia más del 60% de las muestras analizadas contenían viroides y los más ampliamente diseminados fueron el CEVd, HSVd y CDVd. Los resultados obtenidos en el presente trabajo permitieron contar con un sistema de diagnóstico con indicadores de validación superiores al 97%, lo que permite validar el trabajo de las empresas citrícolas del país. La aplicación de este sistema de diagnóstico ha permitido identificar las especies de viroides presentes, así como detectar por primera vez al viroide CBLVd en el país. El conocimiento de la presencia de viroides en las plantaciones es indispensable para el manejo de estos patógenos, cuya importancia se ha incrementado con la introducción de nuevos patrones, que si bien toleran al CTV, algunos resultan sensibles a los viroides. Referencias Bibliográficas. 1. Albanese, G.; La Rosa, R.; Davino, M.; Hammond, R. W.; Smith, D. R. And Diener, T. O. 1988. A viroid different from citrus exocortis viroid found in commercial citrus in Sicily. In: Proc. 10th Conf of IOCV. Timmer, L. W.; Garnsey, S. M. and Navarro, L. (Eds). Riverside, California. p. 165-172. 2. Alioto, D.; Gangemi, M.; Deaglio, S.; Sposato, P.; Noris, E.; Luisoni, E. y Milne, R. G. 1999. Improved detection of citrus psorosis virus using polyclonal and monoclonal antibodies. Plant Pathology 48: 735-741. 1. 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Raidel Rodríguez del CIGB los ensayos de reproducibilidad. Al equipo de trabajo del laboratorio de Virología Vegetal del CIGB por su apoyo en la realización de las hibridaciones. Al Lic. Leonardo Gómez del CIGB por su ayuda en las mediciones de las películas. Al Lic. Luis Izquierdo por el procesamiento estadístico. A Ana María Aldana y María del Carmen Torres por su ayuda en el procesamiento de las muestras.