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REBIOL
Revista Científica de la Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú
Vol 32, N° 1, Enero-Junio, 2012, pp. 24-103
Aislamiento y selección de bacterias nativas de
rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de
nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
Isolation and selection of rhizobia native bacteriae nitrogenfixing from Phaseolus vulgaris root nodules.
Eva E. Villanueva Tarazona y Aníbal Quintana Díaz
Departamento de Microbiología y Parasitología. Universidad Nacional de Trujillo. Trujillo. Perú
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo aislar, seleccionar, y conservar bacterias nativas
de rizobios a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris “frijol”, para lo cual se utilizó la
metodología sugerida por Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y la de Somasegaran y
Hoben, los cuales tienen en cuenta las características morfológicas, bioquímicas y metabólicas de los
cultivos, lográndose aislar y seleccionar cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno de
crecimiento rápido y lento con características similares a lo descrito en el manual de bergey's, que
concuerdan con los géneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium. Determinándose la predominancia de
rizobacterias de crecimiento rápido pertenecientes al género Rhizobium en comparación con las de
crecimiento lento del género Bradyrhyzobium. Posteriormente los cultivos obtenidos se conservaron
por el método de subcultivos periódicos en refrigeración, ya que existe una potencial riqueza de
rizobios cuya diversidad no ha sido aún estudiada con un potencial uso agronómico.
Palabras clave: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rizobios
ABSTRACT
The present study aimed to isolate, select, and retain native rhizobia bacteria from root nodules of
Phaseolus vulgaris "bean", for which we used the methodology suggested by the International Center
for Tropical Agriculture (CIAT) and the Somasegaran and Hoben, which take into account the
morphological, biochemical and metabolic crop, achieving isolate and select crops native rhizobia
nitrogen-fixing fast growing and slow with similar characteristics as described in Bergey's Manual's,
consistent with the Rhizobium and Bradyrhyzobium genres. Determining the predominance of rapid
growth rhizobacteria belonging to the genus Rhizobium compared with slow growing
Bradyrhyzobium genus. Subsequently the cultures were maintained by periodic subculturing method
refrigerated, since there is a wealth of potential diversity rhizobia which has not yet been studied with
a potential agronomic use.
Keywords: Rhizobium, Bradyrhyzobium, rhizobia
INTRODUCCIÓN
La necesidad de disminuir el uso de agroquímicos para aumentar las respuestas de la agricultura en
la alimentación humana han orientado las investigaciones hacia el desarrollo de nuevas biotecnologías
y en los últimos años ha habido un interés creciente en el estudio de los microorganismos fijadores de
nitrógeno, que convierten el nitrógeno gaseoso a amonio mediante reacciones enzimáticas; esta es una
característica exclusiva de procariontes y se encuentran distribuidas en muchos géneros de bacterias 1.
Tales microorganismos pueden ser de vida libre o simbiótica como los del género Rhizobium que se
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asocian a leguminosas esta asociación Rhizobium - Leguminosa contribuye entre 1/3 y un 1/2 del
nitrógeno fijado de la atmósfera y se basa en el intercambio de carbono por nitrógeno entre ambos
simbiontes2.
Las leguminosas son ricas como fuente de proteínas tanto para la alimentación humana como para
el ganado. La producción de plantas leguminosas depende en gran medida de la fijación de nitrógeno
molecular que realiza en simbiosis con especies específicas de Rhizobium. Existen cerca de 19,000
especies de leguminosas2, y la mayoría aún no son aprovechadas por el hombre. Solo se conocen los
simbiontes para alrededor del 1% de las leguminosas que forman nódulos fijadores de nitrógeno 3.
El género Rhizobium incluye especies importantes para la agricultura, han sido empleados como
biofertilizante. Fue el primer género bacteriano producido a gran escala para ser utilizado como
inoculante en diversos cultivos agrícolas; esta práctica ha sido realizada durante años. Se estima
además que la biodiversidad de los rizobios que aún no son conocidos, representa un importante
recurso biológico debido a que las leguminosas constituyen un grupo grande y diverso que se
encuentran distribuidas en distintos ecosistemas4.
En el año 2000 se obtuvieron 58 nuevas cepas de Rhizobium aisladas de nódulos de raíces de fríjol
común cultivado en suelos originarios de diferentes áreas agroecológicas en Senegal y Gambia (este
de África)5. En el 2002 se aislaron 28 cepas rizobianas nodulantes del fríjol caupí, en una relación de
1:3 entre la presencia de cepas de crecimiento rápido frente a las de crecimiento lento6; una relación de
1: 9 y 1: 7 entre los aislamientos7,8, lo que habla de la gran diversidad existente según el lugar de
muestreo. Estos datos brindan la factibilidad de aislar Rhizobium spp. a partir de suelos en los que se
cultivan leguminosas.
Se sabe que existen diversos factores que pueden afectar la relación simbiótica impidiendo la
aparición de nódulos y como consecuencia de ello la leguminosa puede morir, salvo en suelos muy
ricos en derivados nitrogenados. Entre los factores químicos destacan la concentración de cloruro de
sodio, metales, pH, niveles tóxicos de aluminio o manganeso y bajos niveles de calcio, magnesio,
potasio y molibdeno8. Entre los factores físicos: la temperatura, la erosión, presencia de malezas,
hidromorfismo y compactación9. Entre los factores biológicos se pueden mencionar la presencia de
virus, y bacterias como Bdellovibrio que inhiben la nodulación10.
La búsqueda de nuevas alternativas ecológicas que ayuden a disminuir los costos de la producción
agrícola, cuidar el ambiente y por ende lograr un desarrollo sostenible obliga a estudiar la posibilidad
de utilizar el potencial que tienen las bacterias que nodulan en las raíces de las leguminosas y en
especial de las que se consideran no especializadas o promiscuas, de suerte que puedan utilizarse para
inducir nodulación y fijar nitrógeno en otras leguminosas que pueden ser de mayor efectividad. El
seleccionar cepas autóctonas con alta capacidad de competencia en lugar de introducir cepas que
aunque competitivas provienen de nódulos o suelos ajenos al sitio en cuestión, constituye una
excelente alternativa. A pesar de la determinante influencia que tiene la población de Rhizobium
autóctona en los campos de cultivo, compite con las cepas foráneas introducidas y da lugar a un menor
rendimiento11,12; entonces, puede ser ventajoso utilizar los rizobios nativos aislados como
biofertilizantes, en cantidades adecuadas. Esto constituye una alternativa para el enriquecimiento de
los suelos agrícolas.
En la actualidad, la taxonomía de los rizobios se basa en un enfoque polifásico que incluye
caracterización morfológica, bioquímica, fisiología, genética y filogenia; no es factible adelantar
estudios de tipo genético si no se han identificado sus propiedades fenotípicas 13. Se estima que los
rizobios no conocidos en el mundo representan un recurso biológico importante porque las
leguminosas constituyen un grupo grande de plantas que se encuentran distribuidas en distintos
ecosistemas4.
Uno de problemas fundamentales que enfrenta la humanidad es la producción de alimentos en
cantidad suficiente para la población que se incrementa en forma progresiva. Para solucionar este
problema se ha recurrido a la llamada revolución verde que se basa en el uso de fertilizantes químicos,
los cuales se aplican cada vez en cantidades mayores generando severos daños ecológicos,
contaminando los suelos y cuerpos de agua. Ello ha motivado a estudiar diversos sistemas biológicos
para poder modificar las prácticas agrícolas y para que la fijación biológica del nitrógeno sea la que
reemplace al nitrógeno extraído del suelo por los cultivos. Por tanto, debido a que existe una potencial
riqueza de rizobios cuya diversidad no ha sido estudiada, se realizó este estudio con el fin de aislar
rizobios a partir de nódulos radiculares de Ph. vulgaris “frijol”, cultivados en el distrito de Laredo y
seleccionar aquellos con el mejor potencial agronómico para ser utilizados como bioinóculos en la
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agricultura, para lo se planteó el problema ¿Qué bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno se
aislarán y seleccionarán a partir de nódulos radiculares de Ph. vulgaris “frijol” cultivados en el distrito
de Laredo, La Libertad, Perú, de enero a julio del 2012? , con los siguientes objetivos generales y
específicos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material Biológico
Raíces, con nódulos, de plantas de frijol Phaseolus vulgaris
Recolección de nódulos radiculares
Las raíces, con nódulos, se colectaron a partir de plantas de frijol en bolsas de primer uso. Cada
muestra se acondicionó y rotuló según el código asignado y fue trasladada al laboratorio para su
posterior procesamiento.
Procesamiento de las muestras
Las raíces se procesaron en primer lugar, contando el número de nódulos de cada una de ellas.
Luego se seleccionaron los nódulos viables en base a sus características morfológicas14. Los nódulos
viables fueron acondicionados en frascos de vidrio con algodón y silicagel, y conservados en
refrigeración hasta su posterior tratamiento.
Aislamiento de bacterias nativas de rizobios
Los nódulos fueron procesados utilizando la metodología sugerida por Somasegaran y Hoben 14. La
desinfección de los nódulos se realizó por inmersión sucesiva en alcohol al 95% por un minuto e
hipoclorito de sodio al 3% durante tres minutos, posteriormente, se enjuagaron con agua destilada
estéril (ADE) hasta que no se perciba el olor a lejía
Los nódulos desinfectados fueron colocados en placas Petri y machacados adicionando una gota de
ADE por nódulo. Muestras del machacado fueron sembradas por estría en placas conteniendo Agar
Manitol Extracto de Levadura-Rojo de Congo (LMA-RC) y se incubaron a 28°C por 2 – 10 días. Se
observó diariamente el crecimiento de las colonias características de rizobios de acuerdo al manual del
CIAT (CIAT, 1988).
Las colonias típicas de rizobios fueron resembradas en placas Petri conteniendo LMA-RC y se
incubaron a 28°C por 2 – 10 días. Se verifico la pureza de los cultivos. Los cultivos fueron aislados en
tubos conteniendo LMA-RC e incubados a 28°C.
Selección primaria e identificación de cepas nativas de rizobios.
Los cultivos seleccionados fueron analizados tanto en sus características macroscópicas y
microscópicas. Se evaluaron el color, el diámetro, la apariencia y la forma de las colonias, la cantidad
de goma producida y la textura. se realizaron coloraciones simple y de Gram15.
Además, se evaluó el crecimiento de los cultivos aislados en agar peptona glucosa (PGA), agar
Luria Bertani (LLA) y agar manitol (LMA). Después de la incubación a 28°C, se realizaron las lecturas
y se identificaron los rizobios15.
Conservación de cepas nativas de rizobios.
Las cepas nativas aisladas fueron, selladas, rotuladas y conservadas en agar manitol (LMA) en
condiciones asépticas de refrigeración.
Análisis de Datos
El número de bacterias nativas de rizobios fijadores de nitrógeno aislados, seleccionados e
identificados, a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris “frijol” serán procesados y
organizados en tablas y figuras.
RESULTADOS
Se encontraron 10 cultivos nativos de rizobios, aislados a partir de nódulos radiculares de Ph.
vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C (Tabla 1). Cuando
se determinaron las características micromorfológicas de las bacterias, se encontró que eran Gram y
Maneval negativas (Tabla 2).
Cuando se determinaron las características macromorfológicas se encontró que tenían tamaño
variable entre 1 y 7mm, borde entero, consistencia gelatinosa, de color blanquecino a rosado y tiempo
de generación entre 3 y 10 días (Tabla 3). Por su lado, las características culturales determinaron
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crecimiento en Medio Lactosa Extracto de Levadura y ausencia de crecimiento en Medio Luria
Bertani (Tabla 4) habiéndose hallado que el género más frecuente (60%) fue Rhizobium (Tabla 5)
Tabla 1. Cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a partir de nódulos radiculares de
Phaseolus vulgaris, en agar manitol extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C.
N° DE
CULTIVOS
AISLADOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
MUESTRAS
Nódulos
radiculares
de
Phaseolus
vulgaris.
CÓDIGO
MITPhv1
MITPhv2
MITPhv3
MITPhv4
MITPhv5
MITPhv6
MITPhv7
MITPhv8
MITPhv9
MITPhv10
MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris
Tabla 2. Características micromorfológicas de los cultivo nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a
partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
CARACTERÍSTICAS
MICROMORFOLÓGICAS
Gram
Maneval
Forma
TODOS LOS CULTIVOS
(del MITPhv1 al MITPhv10)
Negativos
Cápsula presente
Bacilar y Bacilos Pleomórficos
MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris
Tabla 3. Características macromorfológicas y tiempo de crecimiento de los cultivos bacterianos nativos de
rizobios fijadores de nitrógeno, aislados a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris, en agar manitol
extracto de levadura - rojo de congo (ELMA-RC) a 28°C.
CULTIVO N°
Características
Macroscópicas
Diámetro(mm)
Forma
Borde
Elevación
Superficie
Consistencia
Color
Detalles ópticos
Cant. de goma
Tiempo de
crecimiento
(días)
MITPhv1
MITPhv2
MITPhv3
MITPhv4
MITPhv5
MITPhv6
MITPhv7
7mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Blanquecina
Opaca
abundante
3
2mm
Puntiforme
Entero
Elevada
Lisa
Ligosa
Rosadas
Translúcida
escaso
10
1mm
Puntiforme
Entero
Plana
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translúcida
escaso
10
1mm
Puntiforme
Entero
Plana
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translúcida
escaso
10
6mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Blanquecina
Opaca
abundante
3
4mm
Circular
Entero
Convexa
Lisa
Gelatinosa
Rosadas
Translúcida
abundante
3
1mm
Puntiforme
Entero
Convexa
Lisa
Ligosa
Rosadas
Translúcida
escaso
10
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Tabla 4. Selección de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de pruebas bioquímicas y de
crecimiento para la determinación de pureza de los cultivos aislados de nódulos radiculares de Phaseolus
vulgaris.
MUESTRA
Nódulos radiculares
de Phaseolus
vulgaris.
CULTIVO
PRUEBA BIOQUÍMICA
LLA
PG-PBC
LB
+ (SC)
Escaso
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+ (SC)
Escaso
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+(SC)
+(SC)
Escaso
-
MITPhv1
MITPhv2
MITPhv3
MITPhv4
MITPhv5
MITPhv6
MITPhv7
MITPhv8
MITPhv9
MITPhv10
GENERO
Rhizobium
Bradyrhizobium
Bradyrhizobium
Bradyrhizobium
Rhizobium
Rhizobium
Bradyrhizobium
Rhizobium
Rhizobium
Rhizobium
LLA = Medio lactosa extracto de levadura
PG-PBC = Medio peptona glucosa-púrpura de bromocresol
LB = Medio Luria Bertani
+ = Crecimiento
- = Ausencia de crecimiento
SC = Sin cambio de color
Tabla 5. Frecuencia de cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, Rhizobium sp. y Bradyrhizobium sp.,
encontrada a partir de aislados de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris.
MUESTRAS
Nódulos radiculares
de Phaseolus vulgaris.
CULTIVOS
GÉNERO
N° DE
CULTIVOS
%
MITPhv 1, 5 , 6, 8, 9, 10.
Rhizobium
6
60
MITPhv 2, 3, 4, 7.
Bradyrhizobium
4
40
MITPhv = Microbiología Industrial Trujillo, Phaseolus vulgaris
DISCUSIÓN
El uso de fertilizantes nitrogenados a nivel mundial ha sido indispensable para mantener o
incrementar las reservas de nitrógeno del suelo; no obstante, su abuso ha conducido a problemas de
contaminación ambiental, por tal motivo, la FBN ha atraído a los científicos interesados en la nutrición
vegetal, la cual es de bajo costo y no causa daño ambiental16.
La búsqueda, el aislamiento y selección de bacterias fijadores de nitrógeno es muy importante
desde el punto de vista agronómico, ya que se requiere como base para la producción de inoculantes
bacterianos que estimule la producción vegetal. Existe una gran diversidad de microorganismos
presentes en el suelo que se encuentran interactuando entre sí y con otros organismos del medio, de
ellos tenemos un grupo de gran importancia por su relación sinérgica con las plantas en la fijación
biológica del nitrógeno (FBN), y por su gran potencial uso biotecnológico en la agricultura. En los
últimos años se ha observado un gran interés a nivel mundial en el estudio de estas interacciones
planta-microorganismo, fundamentalmente enfocado a generar nuevos conocimientos básicos
aplicables a los sistemas de producción17.
Del estudio realizado, se puede observar en la Tabla 1, que se aislaron y seleccionaron 10 cultivos
de rizobios nativos fijadores de nitrógeno a partir de nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris, 6 de
los cuales según las pruebas realizadas pertenecerían al género Rhizobium y 4 del género
Bradyrhyzobium tal como se observa en las Tabla 3 y 4, los cuales se caracterizaron por ser
heterótrofos, con metabolismo aeróbico, al microscopio se observaron en forma de bacilos no
esporulados, Gram negativos, y sus células presentaron formas irregulares o pleomórficas en forma de
X o de Y, llamados bacteroides, creciendo a una temperatura óptima de 28 °C. y un pH de 7,0.
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Las especies del género Rhizobium encontradas, se caracterizaron por tener un crecimiento rápido
(3 a 5 días), de reacción ácida en un medio con sales minerales conteniendo manitol, fueron
productores de abundante lipopolisacáridos extracelulares, por consiguiente formaron colonias de
aspecto mucilaginoso; semitranslúcidas y opacas, circulares, convexas, de color blanco o ligeramente
rosadas, midiendo de 2 a 7 mm de diámetro a los 3- 5 días de incubación en medio ELMA (Agar
Manitol Extracto de levadura). Asimismo, es importante mencionar que dentro del género Rhizobium
existen nueve especies definidas: R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R.
huatlense, R. mongolense, R. tropici y R. leguminosarum18.
Para el género Bradyrhyzobium las especies seleccionadas se caracterizaron por el crecimiento
lento que presentaron (3 a 10 días) con colonias pequeñas circulares puntiformes y midiendo de 1 a 2
mm de diámetro y produciendo una reacción alcalina en el medio. Estas características encontradas
durante el aislamiento y selección de bacterias nativas de rizobios. son similares y concuerdan con lo
descrito en el Manual de Bergey para los géneros de Rhizobium y Bradyrhyzobium18.
Al mismo tiempo, realizando un análisis porcentual de los rizobios que se muestran en la Tabla 5,
se puede observar que existe una predominancia de rizobacterias de crecimiento rápido pertenecientes
al género Rhizobium en comparación con las de crecimiento lento del género Bradyrhyzobium.
Además, los miembros del género Rhizobium se distingue de Mesorhizobium por diferencias en su
tasa de crecimiento, en tanto que con Allorhizobium o Sinorhizobium sólo se distingue por sus
caracteres fenotípicos individuales de cada especie. El género Agrobacterium se diferencia de los
demás géneros señalados anteriormente por la producción de la enzima ketolactasa19,20,21.
La taxonomía de los rizobios ha cambiado considerablemente durante los últimos 30 años, la
familia Rhizobiaceae en la 8va Edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática incluye a
Bradyrhizobium como un nuevo género, basado en la rapidez de crecer en un medio de cultivo 22. Los
rizobios actualmente abarcan un rango de géneros, que incluyen Rhizobium, Bradyrhizobium,
Sinorhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium yAzorhizobium, que pertenecen a diferentes familias
dentro de la clase Alpharizobiales y los cuales establecen simbiosis con plantas leguminosas21.
La FBN puede ser llevado a cabo por microorganismos que viven libremente o formando
asociaciones. Los microorganismos asociados o simbióticos usan los productos de la fotosíntesis de la
planta para fijar el N2 atmosférico por lo que es un proceso muy eficiente para la bacteria, siendo los
más eficaces en la FBN. Este tipo de simbiosis es muy común entre bacterias fijadoras de nitrógeno y
plantas leguminosas23.
Son muchas ventajas de las asociaciones simbióticas ya que, la planta puede autoabastecerse del
nitrógeno fijado por los bacteroides encontrados dentro de los nódulos, elevando de manera
considerable su contenido de proteínas; así mismo, los bacteroides reciben de la planta toda la energía
necesaria para su multiplicación. A pesar de estas indiscutibles ventajas, los rizobios no siempre se
encuentran en el suelo, están en poblaciones relativamente bajas o si se encuentran presentes, muchas
veces son de baja efectividad, por lo que una de las estrategias para incrementar la fijación de
nitrógeno ha sido el aislamiento y la selección de cepas y la posibilidad de introducir estos
microorganismos en el suelo a través de la inoculación y favorecer así la simbiosis. Adicionalmente,
cabe destacar que inocular las semillas de leguminosas tiene un bajo costo para el productor, con un
valor promedio estimado en sólo un 5% sobre el costo de la semilla24,25.
Finalmente, los cultivos nativos de Rhizobium y Bradyrhyzobium aislados y seleccionados según
las pruebas realizadas, fueron conservados en refrigeración, utilizando el método de subcultivos
periódicos en el medio agar manitol extracto de levadura proceso que se realizó en condiciones
asépticas, posteriormente fueron selladas, rotuladas y agrupados según su género, este proceso de
preservación de cultivos es muy importante ya que nos permitirá en el futuro disponer de bacterias
nativas de rizobios fijadores de nitrógeno seleccionados para posteriores estudios y ser proporcionados
a los agricultores para promover el uso de inoculantes microbianos.
CONCLUSIONES
 Se aislaron 10 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno, a partir de nódulos
radiculares de Phaseolus vulgaris.
 Se seleccionaron 6 cultivos nativos de rizobios fijadores de nitrógeno del género Rhizobium .
 Se seleccionaron 4 cultivos nativos
de rizobios fijadores de nitrógeno del género
Bradyrhyzobium.
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