MELAMIANA AIA

INTRODUCCIÓN:
La melamina es un compuesto sintético, cuya estructura es la siguiente:
H2N
N
N
NH2
N
NH2
La melamina se emplea para síntesis de resinas formaldehído, y su uso es muy variado:
desde laminado, recubrimientos, adhesivos, inmobiliario, fertilizantes de alimentos de
consumo humano, etc.
En la década de los 60-70 se estudió como potencial agente anticancerígeno, sin
embargo, fue abandonado debido a la toxicidad que presentaba y a los bajos beneficios
aportados.
No solo la leche ha sido adulterada con melamina, si no que también los productos de
alimentación para mascotas. Esto ha ocurrido en Korea y EE.UU en 2004 y 2007,
aunque no han sido los únicos países afectados, ya que la melamina es un producto
fácilmente asequible y barato, por lo que resulta de gran interés en la adulteración.
En 2007 en Estados Unidos se declaró como un agente fuertemente tóxico, debido a la
aparición de mascotas muertas, ya que se adulteró la comida con ella.
Fue a finales de 2007 cuando aparecieron los primeros síntomas y quejas a las
compañías de leche en China. En mayo de 2008 la primera muerte de un niño tuvo lugar
en este país por la intoxicación con melamina.
Los síntomas más representativos:
-fue la aparición de piedras en el riñón
-llantos sin sentido en niños, especialmente a la hora de ir al baño
-vómitos
-alta presión arterial, edema y flato
-subida de fiebre debida a la obstrucción
-hematuria macroscópica o microscópica
-nefrolitiasis
Según diversos artículos chinos, en el 20% de los bebés afectados se detectaron piedras
en el riñón, en EE.UU se detectaron entre gente de 20 a 74 años en el 5,2 %.
Además hay informes de agencias chinas que indican que la nefrolitiasis se forma
debido a la dieta y forma de vida.
Estos estudios se basan en ultrasonografía,que es un estudio dinámico en 3D que tiene
la ventaja de no someter al paciente a irradiación, generando imágenes más exactas de
la medida longitudinal y transversal de lesiones en toda la uretra, sin embargo el uso de
esta técnica destruye las piedras del riñón y no da resultados muy veraces.
Las piedras se forman debido a la presencia de ácido cianúrico, que es un metabolito de
la degradación de melamina y otros compuestos derivados.
Estos son algunos de los hechos anteriores en China a la adulteración con melamina de
la leche:
Según las autoridades chinas, se dieron 300000 casos de intoxicación por melamina (los
cuales se llegan a determinar cuando los síntomas que presentan son muy agudos y
están muy enfermos, por lo que el dato es subestimado) y SÓLO murieron 6 niños, lo
cual resulta un poco paradójico. Los preparados lácteos fueron fomentados por el
gobierno por campañas que decían que aumentaban la inteligencia de la gente. Además,
la empresa Sanlu fue eximido a realizar cualquier tipo de análisis en sus productos, sin
embargo el 93% de 40 muestras de leche infantil procedentes de la empresa contenían
melamina (150-4700)mg/kg y el 73% también contenían ácido cianúrico(0,4-6,3)mg/kg,
donde el rango permitido en melamina en leche de niños es de 1mg /kg .
Los mayores afectados son de zonas rurales, puesto que las madres no se pueden hacer
cargo de los niños y se requiere el uso de preparados lácteos.
Algunos de los alimentos que presentan melamina se recogen en la siguiente tabla:
ADULTERACIÓN Y DETECCIÓN DE NITRÓGENO EN ALIMENTOS.
La adulteración de productos lácteos se llevó a cabo para falsear los resultados
obtenidos en las pruebas de Kjedahl y Dumas en la determinación de nitrógeno en las
muestras. Con la adición de melamina se “incrementa” el número de proteína en la
muestra, por lo que aparentemente los productos eran de mejor calidad. Sin embargo,
como hemos dicho, la melamina es un producto sintético, no proteíco, que lo único que
hace es generar daños en el organismo, por lo que se hacía publicidad engañosa.
El método por excelencia en la determinación de nitrógeno en alimentos es el método
Kjedahl y Dumas, el cual se viene empleando para este fin desde hace más de 100
años.
En 1883 apareció el método en los laboratorios Carlsberg y ocho años más tarde ya
era reconocido como el método universal para la detección de nitrógeno en
compuestos orgánicos, es decir, para la detección de nitrógeno total; inicialmente se
desarrolló este método para analizar fertilizantes y comidas de animales. Poco
después se dijo que era válido para la determinación de nitrógeno en proteínas como
identificación de su valor nutritivo, pero en realidad sirve para detectar el nitrógeno
total. Para la determinación de nitrógeno en alimentos, se desarrollaron otros métodos,
como la combustión de Dumas. La unión de ambos métodos : Dumas y Kjedahl dieron
lugar al método universalmente oficial para la determinación de nitrógeno, aunque con
el paso de los años se ha ido modificando según ha sido conveniente.
Este es el protocolo seguido:
Es un método oficial y descrito en múltiples
normativas: AOAC, US-EPA, ISO, El método Kjeldahl Y Dumas sirve para determinar
el contenido de nitrógeno en muestras orgánicas e inorgánicas. Se basa en la
digestión de la muestra en ácido sulfúrico concentrado a ebullición, con la adición de
un catalizador.La muestra se digiere hasta disolución y oxidación de la muestra. El
nitrógeno contenido en la muestra se convierte en sulfato de amonio. Añadiendo un
exceso de solución de hidróxido de sodio, el ion amonio es liberado en forma de
amoniaco, destilado y recogido sobre una solución de ácido bórico o sobre
una solución valorada de ácido sulfúrico. El amoniaco recogido es determinado con
una solución valorada de ácido o se valora por retroceso con solución de sodio
hidróxido de concentración conocida, si se recogió sobre ácido sulfúrico.
Los resultados se pueden expresar en % N, % NH3 o proteína (%N x factor).
Algunos productos comerciales del método son los siguientes:
MÉTODOS PARA DETERMINAR MELAMINA.
Debido a que el método Kjedahl y Dumas no permite determinar la procedencia del
nitrógeno analizado y a raíz de todos los problemas generados con la adición de
melamina en alimentos de consumo humano y animal, en los últimos años se han
desarrollado muchos métodos muy innovadores para determinarlo.
Varios métodos en la detección de melamina son los siguientes:
-HPLC acoplado a detectores de UV o MS
-GC acoplado a detectores de UV o MS
-Electroforesis capilar acoplado a detección amperométrica
-GC-MS y ELISA
-Electroforesis capilar para la detección de melamina y compuestos relacionados
-Determinación fluorimétrica de melamina por formación de complejos
-Formación de complejo con un derivado de cobre y determinación por
voltamperometría cíclica.
-Cromatografía y determinación de masas en tándem
-Espectrometría de masas doble de isótopos.
A continuación determinaremos algunas de las características más importantes de cada
uno de ellos y propondremos entre uno de ellos, nuestro método para determinar
melamina en muestras.
1-HPLC Y GC ACOPLADOS A UV/MS
Son métodos accesibles para la mayor parte de los laboratorios, sobre todo HPLC, sin
embargo, realizar el análisis resulta muy caro y se requieren unos tiempos de análisis
muy elevados. Por ello, están cayendo en desuso y se recurren a nuevos métodos de
respuesta rápida y baratos.
2-ELECTROFORESIS CAPILAR ASOCIADO A DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA.
En este texto analizan la técnica de cromatografía capilar micelar electrocinética con detección
amperométrica para la determinación de melamina en leche.La ventaja de este método de
detección es la obtención de resultados rápidamente,con buena reproducibilidad y empleo de
un volumen muy pequeño como muestra.
Además, la inyección dela muestra SE LLEVA A CABO SIN PRECONCENTRACIÓN,que ha
sido un dato que me ha llamado mucho la atención.
El uso de micelas es crítico para la separación de la melamina entre la fase móvil o la fase
estacionaria, además de favorecer la separación entre la melamina y compuestos
desconocidos. Se empleó SDS(dodecilsulfato sódico), que no es más que un surfactante,forma
micelas.
Eligiendo un potencíal adecuado con un pH y concentración de micelas crítico, la obtención de
resultados se consigue a los 9 minutos.
Se validó el método con la linealidad que preenta la señal en amperios con respecto a la
concentración, el límite de detección y cuantificación y su reproducibilidad.
SE comprobó así mismo que las muestras reales de leche adquiridas en supermercados de
China contenían unos valores de melamina por debajo del límite de detección( y éste es más
bajo al permitido por la ley).
3-GC-MS y ELISA
Para analizar la cantidad de melamina en tejidos, orina y plasma, se llevó a cabo por el empleo
de dos métodos: inmunoadsorción ELISA Y CG-MS.
Para conseguir antígenos, se inyectó a conejos con el inmunogen BSA-melamina varias veces,
aislándose de la sangre por centrifugación, posteriormente se purifica por precipitación.
Los métodos fueron validados mediante el uso de muestras de plasma, hígado, riñón y
músculo procedentes de pollos y cerdos lo cuales habían sido alimentados con una dieta
exenta de melamina. A cada muestra se añadieron concentraciones crecientes de melamina,
dando buenos resultados en ambos métodos y quedando ambos resultados relacionados por
rectas de calibrado de la siguiente forma:
y(resultado ELISA) = a +bx(resultado GS-MS) ---->para cada tejido.
Ámbos métodos son aptos para la determinación de melamina en determinados tejidos y
revelan datos importantes:
1.El ensayo de tejidos en un pollo que fue alimentado con una dieta que contenía una cantidad
de 1000mg/kg de melamina demostraba que la cantidad en el músculo era mucho menor que
en el hígado y en el plasma y que la porción de melamina presente en el ríñón doblaba la
cantidad presente en esas tres muestras.Por ello, cuando se ingieren alimentos que contienen
melamina, es el riñón el organo más afectado, en el cual se generan piedras e incluso cáncer.
2.Para ver la rapidez con la que se metaboliza en el organismo la melamina, a Un pollo que
seguía la misma dieta que el anterior se le alimentó durante 7 días con alimentos que no
contenían melamina, Como resultado,las concentraciones eran ligeramente altas sólo en el
riñón, por lo que se metaboliza relativamente rápido.
El empleo de este método es un poco caro y conlleva mucho tiempo, pero los resultados
obtenidos son muy buenos.
4- Electroforesis capilar para la detección de melamina y compuestos relacionados
EStamos continuamente hablando del problema que causa la melamina en el organismo:
piedras en el rión, cáncer de vejiga, etc, pero no sólo la melamina es capaz de generara estos
problemas, otras especies que se pueden denominar derivados o asimilados a la melamina
también causan daños en el organismo. Algunos de estos productos son: amelina, amelida y
ácido cianúrico.
Del tema que trata esta publicación es acerca de la determinación simultánea de estos cuatro
compuestos empleando la electroforesis capilar de zona. SE determinaron los valores de pH y
potencial adecuados para poder llevar a cabo la separación de los cuatro analitos con buena
resolución.
Los electroferogramas demuestran la presencia cuantitativa de analitos y puede llevarse a cabo
sobre muestras cotidianas como son: huevos, leche, comida de peces, yogur, etc. El método
fue validado por el limite de detección, cuantificación y el grado de recuperación.Además,
existe una relación lineal de la concentración con el área bajo el pico
5- Formación de complejo con un derivado de cobre y determinación por
voltamperometría cíclica.
El empleo de melamina como ligando en muchas investigaciones ha resultado inútil, ya
que se requiere mucho tiempo para poder sintetizarlo, en cambio, se puede sintetizar online y rápidamente un ligando con cobre, permite obtener una respuesta eléctrica que en
ausencia del metal, melamina no es capaz de proporcionar.
La medidas se llevan a cabo en un electrodo multicapa de carbono modificado en
presencia de iones Cu2+ y un medio ligeramente básico (en medio neutro no se
observaban redox en la voltamperometría cíclica).
Para optimizar las medidas y evitar que el exceso de Cu2+ interfiriese en las medidas, se
añadió etanol a la disolución ( el pico redox del cobre se atenua), se hicieron varios
experimentos para comprobar en qué proporciones se llevaba a cabo la formación del
complejo y comprobaron que el complejo 1:1, daba mayor sensibilidad y señal que el
complejo 2:1 pero la formación del complejo 1;1 tiene lugar con mayor facilidad si se
añade un exceso de cobre.
Fig. 1 (A) Cyclic voltammograms (CVs) measured at the MWCNTs
modified electrode in the absence (a) or the presence of 40 mM CuCl2
(b) or 40 mM CuCl2 + 6.0 mM Mel (c) in 0.10 M pH 7.0 phosphate
buffer containing 0.10 M KCl. (B) CVs in the absence (a) or the
presence of 40 mM CuCl2 (b) or 40 mM CuCl2 + 2.5 mM Mel (c) in
0.10 M pH 10.0 borate buffer containing 0.10 M KCl. Scan rate:
100 mV s_1.
Fig. 2 CVs in the absence (dashed curve) or the presence (solid curve)
of 40 mM CuCl2 with different concentrations of Mel in 0.10 M pH
10.0 borate buffer containing 0.10 M KCl and 20% ethanol (v/v). The
concentration of Mel (nM): (a) 0; (b) 10; (c) 30; (d) 70; (e) 90; (f) 110;
(g) 150. Scan rate: 100 mV s
Fig. 3 CVs for different ratios of CuCl2 to Mel. (a) 60 mM Mel;
(b) 20 mM CuCl2 + 40 mM Mel; (c) 30 mM CuCl2 + 30 mM Mel;
(d) 40 mM CuCl2 + 20 mM Mel. Other conditions as in Fig. 2.
Posteriormente se llevó a cabo la identificación del complejo por masas, IR y
RMN
7- Cromatografía y determinación de masas en tándem
Se llevó a cabo la identificación en diferentes orinas de ácido urico y melamina.
Las muestras de orina fueron recogidas a niños y adultos que pudieron beber
leche contaminada. El empleo de LC/MS_MS permite identificar conjuntamente
ambos analitos en la orina y se ha comprobado que no están correlacionados.
Este método es muy rápido y barato, lo que supone un gran adelanto en la
detección de melamina y compuestos relacionados con ella.
8- Espectrometría de masas doble de isótopos.
No existen métodos realmente validados para la determinación de melamina, a
diferencia de ellos, éste ha hecho un estudio interlaboratorios con materiales de
referencia sintetizados por el laboratorio que propuso el método(los anteriores sólo eran
intralaboratorios) obteniendo buenos resultados en la mayoría de ellos.
Se diferencia de otros métodos de CG-MS en la adición de melamina marcada
isotópicamente.
9- Determinación fluorimétrica de melamina por formación de complejos
La publicación de la fluorimetría consiste en un estudio en el cual se ha comprobado que la
melamina forma un complejo muy estable con una molécula circular con carbonilos dispuestos
hacia el exterior, que tiene características hospedadoras y se llama cucurbit (7) uril
Se han medido las constantes de formación del complejo y se ha comprobado que su
estabilidad decrece al incrementarse la temperatura.
Se ha demostrado la formación del complejo por fluorimetria, ya que al añadir cantidades
crecientes de cucurbit a melamina, la intensidad de fluorescencia crecía y se desplazaba la
banda hacia al rojo ( 367,8 hasta 373,4)nm.
Con una preparación de muestra adecuada, se puede llevar a cabo una recta de calibrado que
relacione la intensidad de fluorescencia con la concentración de melamina de esa forma,
preparando muestras de leche en las mismas condiciones que las disoluciones del calibrado,
se obtiene la concentración de melamina en leche.
Este método ha sido perfectamente validado mostrando unos valores de recuperación de
melamina entre (97-106)%.
Pienso que este método es simple y barato, además de ser selectivo, porque no influyen los
efectos de matriz de la leche, sólo la cantidad de melamina, ya que sólo ella forma el complejo
con la molécula hospedadora.
Curcubit (7) uril:
A
b
c
Fig. 5. Molecular modelingofthe CB7–melamine complex. (a) conformationof melamine; (b)top-viewof
CB7–melamine complex; (c)side-view of CB7–melamine complex.
Con este gráfico se puede ver claramente como con el espectro de fluorimetría a concentraciones crecientes de
melamina, ambos parámetros quedan relacionados por una recta: