Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 ESTUDIOS DE ELIMINACION DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS DE RESIDUALES PORCINOS EN UN BIORREACTOR CON TIEMPO DE RETENCIÓN CORTO M.A. Oliva1, D. Velasco2, L.M.C. Ventura2, E.J. Ballinas1, M.L. Salvador1, Dendooven3 y F.A. Gutiérrez1 1 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Autónoma de Chiapas Carretera Ejido Emiliano Zapata km 8 Tuxtla Gutiérrez Chiapas, México 2 3 Departamento de Investigación y Posgrado Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez Chiapas, México Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN Chiapas, México RESUMEN Se estudiaron variables de operación de un biorreactor tubular en condiciones experimentales (dimensiones, 68.58 cm de largo y 15.24 cm de diámetro), y se utilizó un diseño experimental completamente aleatorio, con un arreglo factorial 2x2x2 con tres réplicas por tratamiento. Los factores fueron el aislamiento térmico del reactor (aislado o no)., la velocidad de agitación (0 y 0.6 rpm) y la hermeticidad (abierto o cerrado). Para un estudio de la cinética, se realizaron mediciones de pH y temperatura a los siguientes tiempos: 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 23 hr. Los residuales porcinos se mezclaron con rastrojo de sorgo, melaza, suero de leche y agua (MS promedio inicial, 21.2%). La desaparición de organismos patógenos (Salmonella spp, Shigella spp y Escherichia coli) tuvo lugar entre 16 y 23 hr en todos los tratamientos (conteo mínimo en el tiempo cero, 10-6 UFC/mL), y los mejores tratamientos fueron cuando la fermentación ocurrió en condiciones abiertas y con agitación, sin necesidad de aislamiento térmico. El tiempo mínimo para alcanzar un pH de 4.0 fue de 16 hr. La calidad nutricional de la mezcla con residuales porcinos también influenciaron las condiciones del proceso. El contenido promedio proteico (Nx6.25) de la mezcla fermentada fue un 10% más que el valor inicial, al pasar de 11.7 a 15.0% en base seca (P<0.05). No hubo cambios en la concentración final de MS (21.7%). Se sugiere que mediante un biorreactor tubular con un tiempo de retención corto, no es necesario el aislamiento térmico para la eliminación de microorganismos patógenos, y las mejores condiciones de trabajo son mediante la operación del reactor abierto y con agitación. Palabras claves: residuales porcinos, eliminación de patógenos, bioreactor tubular Título corto: Eliminación de coliformes patógenos de excretas porcinas en un biorreactor tubular 115 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 STUDIES OF PATHOGENIC MICROORGANISMS ELIMINATION FROM SWINE WASTES BY USING A SHORT RETENTION TIME BIORREACTOR SUMMARY Different operation variables in a tubular bioreactor (dimensions, 68.58 cm length x 14.24 cm diameter) were studied. An experimental design with a factorial arrangement 2x2x2 and three replications per treatment was used. The factors were thermal isolation (isolated or not), speed of agitation (0 and 0.6 rpm) and hermetic status (open or closed). The kinetics of reaction was studied by pH measurements at 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 and 23 hr. Pig wastes were mixed with sorghum straw, sugar cane molasses, whey and water (average initial DM, 21.2%). It was found a complete disappearance of pathogen organisms (Salmonella spp, Shigella spp and Escherichia coli) between 16 and 23 hr (minimum count at zero time, 10-6 UFC/mL) and the best treatments were in open conditions with agitation and not thermal isolation. The minimum time to reach pH values was 16 hr. The nutritional quality of the mixture had influence on the process of fermentation. The crude protein (Nx6.25) content of the fermented mixture was 10% higher (P<0.05) than the original value (from 11.7 to 15.0% in dry basis). There was no changes in final content of DM (21.2%). It is suggested that thermal isolation is not necessary for pathogenic microorganisms in a tubular bioreactor with a short retention time, and the other best parameters are by operating in open conditions and with agitation. Key words: Swine waste, pathogen elimination, tubular bioreactor Short Title: Elimination of pathogenic coliforms from swine waste in a tubular bioreactor INTRODUCCION Los desechos de las granjas porcícolas contienen nutrientes que se pueden usar para alimentar vegetales o animales. Sin embargo, un riesgo inherente en los sistemas de reciclado es la posibilidad de transmisión de microorganismos patógenos. Se ha demostrado que el ensilado de las excretas es un método efectivo para eliminar bacterias coliformes fecales (McCaskey y Anthony 1975; Knight et al 1977), así como para disminuir la sobrevivencia de coccidios provenientes de los bovinos. Este proceso también reduce los riesgos de transmisión de micobacterias en las raciones formuladas con estiércol de bovinos (McCaskey y Schehane 1980). En el proceso del ensilado, las bacterias lácticas utilizan los nutrientes que se encuentran en las excretas para crecer y para producir ácido láctico y pequeñas cantidades de ácido propiónico y ácido butírico (Knight et al 1977). A medida que se producen los ácidos, el pH disminuye a valores menores que 4.5 y esto es el factor principal de la antibiosis que ocurre en el proceso del ensilado (McCaskey y Anthony 1979). Se ha informado que el tiempo en el cual las mezclas ensiladas alcanzan valores de pH menores que 4.5 es variable y que depende del porcentaje de humedad de las excretas, de los ingredientes que se le adicionen para fermentar las excretas y de factores operativos del proceso del ensilado. Soria et al (2001) encontraron tiempos de 50 días para la 116 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 eliminación de coliformes fecales en las excretas de cerdo con alto contenido de agua y en un proceso del tipo de lagunas de oxidación. Para propósitos prácticos, los tiempos arriba mencionados son muy largos para implementarse en las granjas porcícolas. El objetivo del presente trabajo fue caracterizar las condiciones de operación de un biorreactor tubular para la eliminación de las bacterias patógenas presentes en las excretas de cerdo en tiempos más cortos que los informados habitualmente. MATERIALES Y MÉTODOS Diseňo experimental Se estudiaron variables de operación de un biorreactor tubular en condiciones experimentales de laboratorio, se utilizó un diseño experimental completamente aleatorio, con un arreglo factorial 2x2x2 con tres réplicas por tratamiento. Los factores fueron el aislamiento térmico del reactor (aislado o no)., la velocidad de agitación (0 y 0.6 rpm) y la hermeticidad (abierto o cerrado). Para un estudio de la cinética del proceso fermentativo, se realizaron mediciones de pH y temperatura a los siguientes tiempos: 0, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 23 hr. Los residuales porcinos se mezclaron con rastrojo de sorgo, melaza y suero de leche. Preparación de las excretas Los sólidos de excretas de cerdo se obtuvieron en la granja “Mundet”, ubicada en el municipio de Suchiapa, Chiapas, sur de México. Este municipio está situado en la región central del Estado de Chiapas. La granja tiene 300 cerdos en promedio. Los cerdos se crían entre 25 y 105 kg de peso y se mantienen con dietas basadas en sorgo y un complemento vitamínico y mineral. Se eligió esta granja debido a que las instalaciones, la prevención de enfermedades y la alimentación tienen un grado de tecnificación por encima del promedio de las granjas que se encuentran en Chiapas. La recolección de las excretas se hizo directamente de los encierros o corrales, antes de aplicar agua, con la finalidad de no incrementar la humedad. Las excretas se mezclaron con rastrojo de sorgo para obtener el contenido de humedad deseado. A partir de investigaciones realizadas por Hrubant et al (1978) y Sutton et al (1987), se eligió rastrojo de sorgo (y/o rastrojo de maíz) como sustrato sólido para facilitar la fermentación y fue proporcionado por el mismo propietario de la granja “Mundet”. Este rastrojo fue molido usando un molino de martillos y se hidrató con agua (1.4 L de agua por cada kg de rastrojo molido). La melaza fue la fuente principal del carbono, con una densidad de 1.4 g/mL, y se obtuvo de la Unión Ganadera Local (Suchiapa). Esta melaza provenía del ingenio azucarero “La Fé”, ubicado en el municipio de Venustiano Carranza, Chiapas. El suero de leche fue adquirido de la misma granja cuidando que fuera obtenido el mismo día. El medio de cultivo se preparó de acuerdo con las indicaciones para preparar un medio no selectivo para el cultivo de bacterias del rumen (Church 1974), al adicionar 5.00 g de azúcar; 0.50 g de almidón de yuca; 7.00 g de sal mineral; 200.00 mL de suero de leche y agua destilada para ajustar a un volumen total de 1 L. La mezcla a fermentar se preparó con melaza, cerdaza y rastrojo de sorgo (15: 59: 26).La preparación del inóculo se realizó en tres etapas. En la primera etapa, se pesaron 10 g de cerdaza, a la que se le adicionaron 90 mL del medio de cultivo descrito con anterioridad y se dejó incubando a temperatura ambiente durante 27 horas. En la siguiente etapa, se utilizaron 80 mL del inóculo obtenido en la etapa 1, y se aňadieron 504 mL del medio de cultivo, más 216 g de la mezcla a fermentar, para incubarla a continuación a temperatura ambiente durante 117 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 27 horas. En la tercera etapa, se usaron 2160 mL del medio de cultivo, 5040 g de la mezcla a fermentar y se le adicionaron 800 mL del inóculo obtenido en la segunda etapa. Construcción y operación del fermentador El fermentador piloto se construyó de PVC, y sus dimensiones fueron de 68.58 cm de largo y 15.24 cm de diámetro. Este biodigestor constaba de dos puertas localizadas en los extremos que permitían el paso de la mezcla excretas-rastrojo a través del fermentador. La mezcla a fermentar, ocupó 2/3 del volumen del fermentador. El fermentador funcionó sobre ruedas ancladas a flechas impulsoras en paralelo, y se emplearon 3 juegos de poleas con su respectiva banda para ajustar a la velocidad deseada. La potencia de la flecha la proporcionó un motor de velocidad variable con una potencia de 1/8 hp. Análisis químicos y microbiológicos Se tomaron muestras de las materias primas y al producto de la fermentación para determinar el contenido de humedad, proteína cruda (Nx6.25), extracto etéreo, fibra cruda, cenizas y extracto libre de nitrógeno según procedimientos reconocidos (AOAC 1980). El valor de pH se determinó por potenciometría mediante el uso de un electrodo de vidrio. A 20 gramos del producto fermentado se le adicionaron 180 mL de agua para alcanzar una proporción de 1:10. La mezcla se logró mediante un agitador Waring, durante 5 min. El filtrado se usó para los análisis microbiológicos. El conteo en placa de las bacterias totales, de los hongos y de los coliformes totales se estimaron en el filtrado obtenido en las determinaciones anteriores mediante los siguientes medios de cultivo: agar-azul de metileno-eosina, agar-Shigella y Salmonella y agar-McConkey. Análisis biométrico El análisis estadístico consistió en aplicar la técnica del análisis de varianza, utilizando el método de Yates (Box et al 1979). La comparación de medias entre los tratamientos se realizó por el método de Tukey con 0.05% de probabilidad. Se empleó el paquete estadístico del SAS (1985). En el caso de la comparación de los índices químicos antes y después de la fermentación, se efectuó por medio de pruebas de hipótesis de comparaciones apareadas, y se utilizó la prueba t de Student en la que el nivel de significación aceptado fue el correspondiente a P<0.05. (Wayne 1992). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Status de los microorganismos patógenos Los tratamientos 2 y 6 fueron los que promovieron la eliminación de los microorganismos patógenos en un menor tiempo, es decir, 16 hr (tabla1). Estos tratamientos también fueron los mejores porque promovieron un menor valor de pH en un tiempo más corto en comparación con los demás tratamientos El análisis de varianza de los resultados demostró que ni la agitación ni la interacción agitaciónxhermeticidad fueron significativas. Sin embargo, la hermeticidad en sí produjo un efecto altamente significativo (P<0.01) en la eliminación de los organismos coliformes patógenos. De acuerdo con la prueba de efectos fijos, el factor aislamiento no evidenció influencia en el comportamiento de los tratamientos. 118 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 Tabla 1. Efecto de distintos factores en el tiempo de desaparición de microorganismos patógenos de excretas porcinas tratadas en un un biodigestor tubular con tiempo de retención corto1 Aislamiento Desaparicion de Tratamiento Agitación Hermeticidad térmico coliformes, hr1 1 No Abierto No 20 2 Sí Abierto No 16 3 No Cerrado No 23 4 Sí Cerrado No 23 5 No Abierto Sí 20 6 Sí Abierto Sí 16 7 No Cerrado Sí 23 8 Sí Cerrado Sí 23 Sig ns P<0.01 ns - Los resultados obtenidos son lógicos, si se considera que estos factores influyen en la concentración de oxígeno disuelto disponible para los microorganismos y que las bacterias lácticas producen ácido láctico preferentemente en condiciones microaerofílicas. La característica más importante utilizada para evaluar el éxito de un proceso de tratamiento de excretas es el pH (Naugle et al 1980). Si se compara con otros estudios, el tiempo de 16 horas es el menor informado hasta el momento. Por ejemplo, McCaskey y Shehane (1980) hallaron que el pH disminuyó hasta por debajo de 4.5 después de 3 días de ensilado a 25º C. Estos autores afirmaron que el pH fue el factor que influyó para lograr la antibiosis contra las micobacterias, las cuales representan un reto, ya que estos organismos toleran un gran rango de valores de pH. Weiner (1992) logró valores de pH de 5.01, 4.59 y 4.38 a las 48, 72 y 96 hr, respectivamente. Cabe mencionar que a las 72 hr ya no se encontraron coliformes totales en mezclas de cerdaza y maíz (Weiner 1980). Berger et al (1980), al usar harina de soya y de maíz, encontraron que a medida que se aumentó la proporción de harina de maíz, disminuyó la concentración de carbohidratos solubles, se incrementó la concentración de ácido láctico y disminuyó el pH en un tiempo de ensilado de 40 días. Se observó que la fermentación llevada a cabo en el biorreactor con operación a tanque abierto fue la que promovió menores valores de pH en contraste con la llevada a cabo con el biorreactor cerrado. La diferencia se observó desde las 10 hr del proceso fermentativo. Estos resultados indican que la fermentación requiere condiciones microaerofílicas más que condiciones anaeróbicas. Este resultado es interesante, debido a que la mayor parte de los estudios relativos al diseño de reactores para el tratamiento de la cerdaza se han enfocado hacia el establecimiento de condiciones anaeróbicas (Sweeten 1980). Por razones económicas, el nivel de oxígeno disuelto en el reactor debe ser el mínimo necesario de tal manera que satisfaga los requerimientos para que se genere suficiente actividad microbiana que permita lograr los objetivos del tratamiento. Al parecer, la operación del reactor de forma abierta permitió que se lograran condiciones microaerofílicas. Estas condiciones permitieron que se produjera mayor concentración de ácidos orgánicos, los cuales a su vez provocaron la disminución del pH con mayor rapidez que con las condiciones anaeróbicas, con el reactor cerrado. Se encontró que la agitación no tuvo una influencia significativa en el comportamiento del pH en la fermentación. Sin embargo, la interacción con la hermeticidad si presentó diferencias estadísticamente significativas (P<0.05). Esto pudiera explicarse con respecto con el intercambio gaseoso dentro de la mezcla. Las condiciones de operación a tanque abierto permitieron que existiera una aireación superficial a través de la superficie libre. Se ha estudiado con detalle la transferencia de masa hacia adentro y hacia fuera de la película de líquido (Bailey y Ollis 1997). 119 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 No obstante, hace falta todavía más información cuando se trata de explicar lo que sucede cuando están presentes las células de los microorganismos, y además. se deben de incluir los aspectos bioquímicos en el análisis. Evidentemente, los factores que determinan una diferencia entre una actividad aeróbica y una anaeróbica dependen de la concentración de oxígeno dentro de la mezcla a fermentar, del coeficiente de difusión de oxígeno, que depende en gran parte de la viscosidad y densidad de la mezcla, y de la velocidad de respiración o de consumo del oxígeno por los microorganismos. De acuerdo con las condiciones experimentales que se probaron en el presente trabajo, la apertura o no del bioreactor es el factor que permitió que hubieran diferencias en la concentración de oxígeno disuelto en la mezcla a fermentar. La fermentación fue más adecuada cuando los microorganismos tuvieron disponible oxígeno, aunque en cantidades limitadas, debido a que la transferencia gaseosa sólo se realizó a través de la superficie de la mezcla a fermentar. Esta idea se refuerza aún más por el hecho de que se encontró que la interacción tanque no-hermético y agitación a 0.6 rpm fue significativa (P<0.05) al favorecer la disminución del pH, debido a que la agitación permitió que el coeficiente de difusión de oxígeno fuera mayor, con lo que los microorganismos tuvieron disponible más oxígeno disuelto, para que su metabolismo no lo realizaran bajo condiciones de anaerobiosis. En las condiciones en que se operó el biorreactor y las características de viscosidad y contenido de sólidos de la mezcla a fermentar, lo más probable es que se hayan generado condiciones microaerofílicas (Bailey y Ollis 1997). La disminución del pH se debe a la producción de ácidos orgánicos, particularmente ácido láctico originado por bacterias lácticas. Como ilustración, pudiera decirse que Burgos-Rubio (2000) encontró que el Lactobacillus bulgaricus, que anaeróbico facultativo manifestó la mayor velocidad de crecimiento en condiciones microaerofílicas. Análisis microbiológico de las excretas de cerdo Antes de la fermentación, la mezcla contenía Escherichia coli (10.5x106 UFC/mL), Shigella y Salmonella (2.5x106 UFC/mL) y de enterobacterias (8.4x106 UFC/mL). Después de la fermentación no se encontró ninguna UFC de los tres tipos de microorganismos (tabla 2). Estos resultados son importantes porque demuestran que se puede obtener cerdaza libre de microorganismos patógenos en un tiempo corto de fermentación. El contenido microbiano de la cerdaza permite obtener productos con mejor calidad; por ejemplo, si el uso es para fertilizar plantas, se ha demostrado que la calidad del biofertilizante es baja cuando la cerdaza en forma de composta, que contiene mayor carga microbiana. Esto se debe a que los microorganismos inmobilizan y ayudan a retener el N en el suelo y como consecuencia disminuye la eficiencia de asimilación de este elemento por las plantas. Particularmente en maíz, Choi et al (2001) encontraron que la aplicación de composta de cerdaza aumentaba al doble la immobilización del nitrógeno. Tabla 2. Conteo de microorganismos patógenos al comienzo y al final del proceso fermentativo en el biorreactor tubular (en 10-6 UFC/mL)1 Microorganismo Comienzo Final Enterobacterias 8.4 Ausencia Escherichia coli spp 10.5 Ausencia Shigella y Salmonella spp 2.5 Ausencia 1 Media de todos los tratamientos 120 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 Análisis químico de las excretas de cerdo Los cambios en el contenido de fibra cruda, extracto etéreo y proteína bruta fueron signicativos (P<0.05) cuando se compararon los valores antes y después de la fermentación para todos los tratamientos (tabla 3).. Si se comparan estos resultados con los de Iñiguez et al (1990a,b), es evidente que existió coincidencia en el contenido de proteína bruta en condiciones iniciales pero no en las finales. Iñiguez et al (1990a,b) obtuvieron en este caso valores de 12.1% mientras que en el presente trabajo se obtuvo un valor superior (15.0%). Desde este punto de vista el proceso fermentativo informado aquí fue más eficiente porque promovió la obtención de un producto con mayor contenido de proteína. Con respecto al extracto etéreo, los valores hallados por Iñiguez et al (1990a,b) fueron más bajos (3.13 %) que los obtenidos en este trabajo (13.91%). Un factor que posiblemente influyó para esta diferencia fue que aquí se usó suero de leche y en el experimento de Iñiguez et al (1990a,b), no. En cuanto al contenido de fibra cruda, no se observaron diferencias significativas originadas durante la fermentación (7.3 % aquí, y 7.06 % de acuerdo con Iñiguez et al 1989). Tabla 3. Cambios en la composición química del sustrato al comienzo y final del proceso fermentativo (porciento en base seca)1 Indice Comienzo Final Sig Humedad 78.79 ± 1.45 78.27 ± 2.08 ns MS 21.21 ± 0.65 21.73 ± 0.59 ns Cenizas 16.56 ± 0.04 15.32 ± 0.72 ns Fibra cruda 8.32 ± 0.57 7.06 ± 0.04 * Extracto etéreo 12.05 ± 0.06 13.91 ± 0.03 * ELN 51.37 ± 1.40 48.71 ± 1.40 ns Nx6.25 11.70 ± 0.22 15.00 ± 0.59 * 1 Media y DE de todos los tratamientos ns, no significativo; * P<0.05 El contenido de N que se encontró para la cerdaza fermentada con el proceso descrito en el presente trabajo permite suponer su uso potencial para elaborar biofertilizantes específicos para diversas plantas. En otros estudios anteriores, el poder fertilizante del producto final ha sido evaluado bajo distintas condiciones experimentales (Choi et al 2002; Cooperband et al 2002). En este caso, habrá que evaluar en invernaderos cuáles son las respuestas de las plantas a diferentes niveles de aplicación de un producto, con características similares al obtenido en la presente investigación. También es importante evaluar cómo son afectados los procesos químicos del suelo, especificamente la dinámica de carbono y nitrógeno, fósforo, potasio, así como el pH, la temperatura, los microorganismos benéficos del suelo y otros, para determinar los posibles efectos adversos que pudiera tener la aplicación de la cerdaza fermentada en la cual se logró disminuir el pH y el contenido microbiano en un periodo de tiempo corto. AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue financiada por el Sistema de Investigación Benito Juárez del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (SIBEJ-CONACYT), y correspondió al proyecto “Producción de cerdaza para alimentación de rumiantes” (código 19990505006). 121 Revista Computadorizada de Producción Porcina Vol: 11 No. 1 2004 REFERENCIAS AOAC. 1980. 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