1 Protocolos de secuenciación de ADN Introducción El método de secuenciación utilizado aquí es el desarrollado por Sanger en 1975. Este consiste en la incorporación de didesixinucleótidos marcados fluorescentemente a una cadena de ADN durante el proceso de copiado de la misma. Los didesixinucleótidos no poseen un grupo 3´-OH necesario para la formación del enlace fosfodiester que permite la unión entre nucleótidos, por lo tanto se interrumpe la elongación de la cadena cada vez que uno de estos es incorporado en ella. De este modo se generan secuencias de diferentes tamaños. Estas se hacen migran a través de un gel de poliacrilamida donde se separan por tamaños. El equipo de secuenciación cuenta con un dispositivo que permite captar la emisión de luz de los cuatro didesixinucleótidos. La lectura se hace entonces partiendo de las secuencias más cortas hasta la secuencia completa, y se genera un gráfico con picos de emisión de luz en la posición de cada uno de los nucleótidos de la secuencia de interés (cromatograma). El proceso de secuenciación se hace en seis pasos. Primero se prepara la secuencia de interés o templado de la reacción de secuencia. Esto consiste en la amplificación de la misma vía PCR. Una vez culminado el PCR la secuencia debe ser limpiada para eliminar los restos de primer y posibles inhibidores de la reacción de secuencia. Es recomendable mirar el producto de PCR antes de la limpieza y hacerlo migrar unos tres dedos en un gel de agarosa, para estar seguros de que la secuencia no presenta dobles bandas ni barridos. Si este es el caso, es necesario aislar la banda de interés del gel y limpiarla. El segundo paso es la cuantificación del producto de PCR limpio. La reacción de secuencia es muy sensible a la concentración del ADN templado, grandes cantidades inhiben la reacción (los reactivos se consumen rápidamente, como resultado se obtienen secuencias truncadas) y las pequeñas cantidades generan intensidades de luz pequeñas que pueden ser confundidas con el ruido de fondo. Adicionalmente se tiene establecida la cantidad de ADN templado para varios tipos y tamaños de secuencias (ver tabla 1). El tercer paso es la reacción de secuencia. Esta consiste en el copiado de la secuencia patrón, no es una amplificación de la secuencia como en el caso de la PCR, de allí que la concentración del ADN inicial sea tan restrictiva. La reacción de secuencia necesita de la hebra molde, uno solo de los primers (la inclusión de los dos primers genera dos secuencias superpuestas ilegibles), una enzima polimerasa de ADN, el cofactor de la enzima MgCl2, una solución tampón (buffer), los cuatro desoxinucleotidos (dNTPs) y los cuatro didesoxinucleotidos marcados (ddNTPs). Generalmente los kit de secuenciación traen una solución con la mezcla adecuada de dNTPs, ddNTPs, la enzima y el Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 2 MgCl2. En nuestro caso, utilizamos el kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y la mezcla de reactivos de denomina Terminator Ready Reaction mix o Big Dye. La reacción de secuencia se lleva a cabo en un termociclador donde se repite un programa de extensión que consta de, un paso de desnatulalización de la secuencia de ADN a 96°C, uno para el anhealing de la secuencia a una temperatura de 50°C y el de la extensión de la secuencia a 60°C. Tabla 1: Cantidad de ADN templado para una reacción de secuencia, dependiendo del tipo y tamaño de la secuencia de interés. Tipo de Templado Tamaño de templado (pb) Cantidad de ADN inicial (ng) Producto de PCR 100-200 200-500 500-1000 1000-2000 >2000 1-3 3-10 5-20 10-40 40-100 50-100 200-500 500-1000 2000-3000 ADN de hebra simple ADN de doble hebra Cósmidos/BAC ADN genómico bacteriano El cuarto paso es la precipitación de la reacción de secuencia. En este se eliminan los reactivos sobrantes de la reacción y otras moléculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador. Existen varios métodos de precipitación de la secuencia, aquí se muestran dos de ello uno basado en etanol e isopropanol y otro donde se utilizan perlitas magnéticas para capturar el ADN. El quinto paso es la resuspensión de la secuencia marcada en formamida de alta pureza (Formamida Hi-Di). Finalmente el último paso consiste en el montaje de la muestra en el equipo de secuenciación. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 3 1. Protocolo para PCR 1. 1Materiales - Termociclador -Tubos de 1,5ml -Tubos de y 0,2ml -Pipetas de 0.2-2uL, 2-20uL y de 20-200uL -Guantes de látex sin polvo. 1.2 Reactivos - Taq polimerasa de alta fidelidad de copia - Buffer 10X de la reacción de secuencia -MgCl2 -Primer Forward y Reverse -dNTPs -Agua MilliQ 1.3 Preparación de la reacción de PCR Reactivo Concentración en el stock Buffer MgCl2 dNTPs Primer F y R (para cada uno) Taq polimerasa ADN total Agua 10X 25mM 20mM (cada uno a 5mM) 10uM 5ng/uL Concentración o cantidad en una reacción 1X 3mM 0.4mM 0.5uM 1U 5ng Nota: La reacción se prepara en un volumen final de 10uL. Se recomienda tener alícuotas de los reactivos y servir de ultima la enzima. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 4 1.4 Protocolo 1) Preparar la mezcla de reactivos de la PCR sin incluir el ADN total en un tubo de 0,2ml. Si va preparar varias reacciones a la vez, utilice un tubo de 1,5ml para hacer la mezcla. Prepare una reacción adicional por cada 10 muestras a amplificar. Esto es para no quedarse corto cuando reparta la mezcla. 2) Alicuotar el ADN en un tubo de PCR de 0.2ml. Si solo está amplificando una muestra agregue el ADN al tubo donde está la mezcla. 3) Amplificar la muestra en el termociclador utilizando uno de los siguientes programas: a) PCR común b) PCR touch down Nota: El programa de PCR Touch down es un programa de amplificación doble, que sirve para eliminar amplificaciones inespecíficas. Este consta de ciclos de amplificación selectiva al principio y de amplificaciones laxa después, lo que se consigue variando la temperatura de anhealing. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 5 4) almacenar a -20°C hasta su uso 1.5 Resultados El resultado ideal de una PCR es un producto relativamente limpio de primers, altamente concentrado (100ng/uL en adelante) y sin amplificaciones inespecíficas. Este resultado se puede logar estandarizando la reacción de PCR y el programa de amplificación. La optimización de la reacción se hace variando la concentración de MgCl2, la cantidad inicial de ADN templado y la de la enzima. Mientras que la optimización del programa de amplificación consiste en la modificación de la temperatura de anhealing (aumentando la temperatura mejora la especificidad de la enzima por la secuencia de ADN) y el tiempo de extensión de la cadena (debe ser más larga para las secuencias grandes). En ocasiones la optimización de la PCR no se logra con facilidad a pesar de jugar con las condiciones mencionadas. Cuando esto ocurre generalmente se debe al diseño inadecuado de primers, en ese caso lo mejor es diseñar unos nuevos y estandarizar la PCR con estos. Figura 3: Productos de PCR de una secuencia del gen COI en mariposas, vistos en un gel de agarosa al 1,2% teñido con Syber Safe. A. Producto de PCR con una cantidad de primer excesiva (mancha en la parte inferior de la columna) B. y C. Producto de PCR con una amplificación inespecífica (banda doble) D. Producto de PCR con una amplificación baja. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 6 2. Reacción de secuencia 2.1 Materiales - Termociclador -Tubos de 1,5ml -Tubos de y 0,2ml -Pipetas de 0.2-2uL, 2-20uL y de 20-200uL -Guantes de látex sin polvo. 2.2 Reactivos - Big Dye Terminator v3.1 (del kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems)) - Buffer 5X de la reacción de secuencia (del kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems)) -Producto de PCR -Primer Forward o Reverse -Agua MilliQ 2.3 Preparación de la reacción de secuencia Reactivo Terminator ready reaction mix (Big Dye) Buffer del kit Primer F ó R Producto de PCR Agua Concentración inicial Concentración en la reacción - Cantidad para una reacción (uL) 0,5 5X 10uM - 1X 2,0 0,2 Completar el volumen Nota: La reacción se prepara en un volumen final de 10uL. Se recomienda tener alícuotas de los reactivos de secuencia. El Big Dye es sensible a la luz y el calor, almacenarlo en recipiente oscuro y descongelar al cuando se vaya a terminar la reacción de secuencia. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 7 2.4 Protocolo 1) Hacer la mezcla de la reacción de secuencia en un tubo de 0,2uL. 2) Correr la reacción de secuencia en un termociclador siguiendo este programa de elongación. Nota: El tiempo de cambio entre temperaturas (rampa del termociclador) debe ser de 1°C por segundo. Si se utiliza el Big Dye diluido y/o la secuencia es grande (800pb en adelante) debe utilizarse un número de ciclos elevado, 40 ciclos. Si la secuencia de interés es pequeña (300pb) con 20 ciclos es suficiente. 3. Limpieza de la reacción de secuencia 3.1 Protocolo con etanol e isopropanol 3.1.1 Materiales -Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL -Plancha de calentamiento - Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm - Vortex -Tubos de 1,5ml -Guantes de látex sin polvo. 3.1.2 Reactivos -Isopropanol al 65% -Etanol al 60% -Formamida Hi-Di Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 8 3.1.3 Protocolo Para una reacción de secuencia en un volumen de 10ul. 1) Agregar al tubo con la reacción de secuencia 40uL de isopropanlo al 65% y transferir a un tubo nuevo de 1,5mL. 2) Mezclar vigorosamente (vortex). 3) Dar un spin. 4) Guardar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. 5) Centrifugar a 14000 rpm durante 25 minutos, a temperatura ambiente. 6) Remover el isopropanol por inversión del tubo. 7) Agregar 100uL de etanol al 60% 8) Mezclar vogorosamente (vortex) 9) Centrifugar a 14000 rpm durante 5 min. 10) Secar la muestra en una plancha de calentamiento a 60ªC durante 10 min. 11) Resuspender en 10uL de Formamida Hi-Di. La formamida debe estar fuera de la nevera 10 min antes de ser utilizada para evitar la incorporación de cristales en la muestra. 3.1.4 Resultados obtenidos con este método de limpieza El resultado de la limpieza de las secuencias con este método es variable. Generalmente se observan picos de emisión luz a través del electroferograma correspondientes a rastros de etanol en la muestra. Este problema puede ser corregido secando muy bien la muestra antes de resuspenderla en la formamida. Adicionalmente se pierden un buen número de bases al inicio de la secuencia contrariamente a lo que se obtiene utilizando el método de Magnesil Green (Promega). Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 9 Figura 3: Electroferograma de una secuencia del gen COI de mariposas que presenta rastros de etanol. 3.2 Protocolo con Magnesil Green de Promega 3.2.1 Materiales -Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL -Plancha de calentamiento - Centrifuga para tubos de 1,5 ml, que alcance 14000 rpm - Vortex -Tubos de 1,5ml -Magneto 3.2.2 Reactivos -Magnesil Green (Promega) -Formamida Hi-Di 3.2.3 Protocolo Para una reacción de secuencia en un volumen de 10ul. 1) En un tubo de 1,5mL mezclar el producto de secuenciación con 90uL de Magnesil Green. 2) Mezclar con pipeta. 3) Almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente por 10min. 4) Poner tubo en el magneto. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 10 5) Retirar el sobrenadante con pipeta sin llevarse las perlitas de metal. 6) Retirar el tubo del magneto. 7) Agregar al tubo 90uL de etanol al 90%. 8) Mezclar vigorosamente (vortex). 9) Esperar 5 min. 10) Poner el tubo en el magneto y retirar el sobrenadante con pipeta. 11) Repetir el lavado con etanol, pasos 7 a 10. 12) Retirar tubo del magneto e incubarlo a 65ªC por 10min. 13) Resuspender en 15uL de formamida Hi-Di. La formamida debe estar fuera de la nevera 10 min antes de ser utilizada para evitar la incorporación de cristales en la muestra. 14) Dejara a temperatura ambiente por 10 min. 15) Poner tubo en magneto y recuperar 13uL del liquido. Esto evita llevarse las perlas magnéticas. Figura 4: A. Magneto B. Magnesil Green cuando se ha agitado y después de ponerlo en el magneto. Observe como las perlitas magnéticas de la solución (marrón oscuro) se congregan al ser colocadas en el magneto. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 11 3.2.4 Resultados obtenidos con este método de limpieza En general las secuencias que se limpian con este método son muy buenas. Generalmente no se observan picos de emisiones de luz a través del electroferograma. Adicionalmente la secuencia puede empezar a ser leída mas cercanamente del extremo del primer, es decir que se pierden menos bases al inicio de la secuencia. 4. Corrida en el secuenciador 4.1 Materiales -Secuenciador automático. En este caso se emplea el 3130 Genetic Analyser de Applied Biosystems. -Placa de 96 pozos adaptada al secuenciador. -Cubre placa de 96 pozos. -Termociclador. -Pipetas de 2-20uL, de 20-200uL. -Guantes de látex sin polvo. 4.2 Reactivos -Buffer de corrida -Agua MilliQ -Polímero POP7 -Formamida Hi-Di 4.3 Protocolo La corrida de las muestras en el secuenciador se hace en tres pasos. El primero consiste en la preparación de las muestras (desnaturalización del ADN y montaje en la placa de corrida), el segundo en la preparación del archivo con las condiciones de corrida y el último en el montaje de las muestras en el equipo y la corrida en sí. Siempre debe verificar el nivel de polímero, buffer y agua de los compartimientos del equipo destinados para ello antes de empezar a secuenciar. 1) Una vez resuspendida la muestra en formamida Hi-Di, pasarla a la placa de corrida del secuenciador. Es importante que no queden burbujas en el pozo ni tampoco gotas en las paredes, las primeras introducen aire a los capilares y las segundas generar puentes eléctricos ocasionando cortos en el equipo. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque 12 2) Desnaturalice la muestra en el termociclador a 94°C por 2 min y llévela a 4°C hasta su uso. No utilice hielo para el enfriamiento, las gotas de agua en las afueras de la placa generan puentes eléctricos. 3) Prepare el archivo con los parámetros de corrida de la muestra. Esto consiste en nombrar la muestra, ubicarla dentro de la placa de secuenciación, indicarle al equipo con que velocidad se va a hacer la corrida de la muestra, cuánto tiempo se va a tardar en inyectarla, que tipo de marcaje fluorescente lleva la muestra y si esta contiene un marcador de tamaño molecular (esto para el caso de microsatélites). Esto se hace en la ventana Plate Manager. 4) Saque la bandeja del secuenciador presionando el botón Tray. 5) Abra la puerta del secuenciador y monte la placa en él. Verifique que esta tenga la tapa bien puesta y que esté al mismo nivel de los tanques de agua y buffer. Cierre la puerta del secuenciador. 5) Asocie la placa con el archivo de parámetro de corrida en la ventana Run Scheduler. Esto se hace seleccionando la planilla y después la placa. 6) Dele inicio a la corrida presionando el icono de la flecha verde en la ventana Run View. 7) Puede monitorear la corrida a través de la ventana Status. Para una explicación más detallada de los pasos a seguir consulte la guía de Preparación del ABI 3130 para electroforesis adjunta. Protocolos de laboratorio UEG 2009 Por: Duina Posso Duque