protocolo para evaluacion de muestras para microscopia confocal

 PROTOCOLO PARA EVALUACION DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA CONFOCAL. Ing. Elsa Nydia Hernández Rios, Unidad de Microscopía, Instituto de Neurobiología Campus UNAM‐
Juriquilla / Dr. Marco Antonio Ramírez Olvera, División Microscopía, Carl Zeiss de México. El siguiente escrito, describe una serie de pruebas para la evaluación de muestras con epifluorescencia para determinar su posible observación en el LSM 510 Meta. Durante la preparación de las muestras de epifluorescencia existen numerosos factores (fijación adecuada, temperatura, preservación de los sitios activos, usar anticuerpos primarios adecuados y específicos, fluorocromos de contraste NO VIEJOS, bloqueo, dilución adecuada, tiempo de incubación de los anticuerpos, medio de montaje y la refrigeración, factores que intervienen en el resultado final que nos interesa, en la intensidad y duración de la marca fluorescente, etc. Las muestras deben de ser lo más planas posibles y deben de ser montadas usando cubreobjetos de 0.17 mm y en el caso de muestras preparadas en Cajas de Petri ó Cajas de Cultivos (que no tengan fondo de vidrio) utilizar solamente bajos aumentos u objetivos LD. 1.‐ Apariencia de la muestra en el microscopio de epifluorescencia. No basta con que la fluorescencia perdure, también es necesario que la marca se observe como se describe a continuación: •
Marca específica: Solo debe observarse en sitios puntuales de la muestra y no en toda la muestra. •
Fondo negro: El fondo negro permite el contraste de la marca y captura de la misma, cualquier fondo de otro color dificulta este proceso. •
Intensidad adecuada: La fluorescencia debe ser lo suficientemente brillante para ser diferenciable del fondo o de otra marca cercana sin ser opacada. 1
•
Duración adecuada: La intensidad de la marca fluorescente disminuye con el paso del tiempo aun cuando no esta expuesta a la luz UV, pero si deseamos capturar imágenes excepcionales en LSM 510 META necesitamos un mínimo de 5 minutos o la calidad de la imagen se verá reducida. 2.‐ Problemas más comunes con muestras observadas con epifluorescencia A. Espesor de la muestra: Las muestras con grosor superior a los 200 micrometros no hay garantía de que el Láser penetre lo suficiente para capturar imágenes de calidad. B. Perdida de la fluorescencia: Esto puede ser ocasionado principalmente por una mala fijación, falta de refrigeración, larga y previa revisión en el microscopio de epifluorescencia usando la lámpara HBO 100 (No HBO 50), uso de fluorocromos VIEJOS y mal ajuste de la potencia de los Láser del LSM 510 META. (Photobleaching). C. Fluorescencia Inespecífica: Esta sucede cuando el flurocromo adicionado, no se fija en las regiones de interés de la muestra, además existen estructuras que en forma inducida ó natural como el medio de montaje fluoresce en la misma longitud de onda que el fluorocromo utilizado. D. No hay fluorescencia: Las principales causas son el uso del anticuerpo equivocado, larga exposición a la lámpara HBO‐100 previo al LSM 510 META y mala configuración de filtros. E. Configuración inadecuada del LSM 510 META : La selección de filtros no es la adecuada para las longitudes de excitación y emisión del fluorocromo utilizado, al igual que la potencia de Láser y apertura de pinhole. 2
Problemas frecuentes con la fluorescencia de muestras
Incorrecta
selección de
filtros
Escaso
contraste
No hay
Fluorescencia
Apertura de
pinhole
inadecuada
Extinción de la
fluorescencia
(Quemado)
Fondo NO
negro
3.‐ Evaluación de la muestra en epifluorescencia para LSM 510 META. Si se observa la muestra con una lámpara HBO‐50 la fluorescencia podrá perdurar por más de 30 minutos, pero si se utiliza una lámpara HBO‐100 (10 veces mayor intensidad de luz UV) la fluorescencia de la muestra no durará más de 10 minutos en el mejor de los casos y el tiempo mínimo necesario para la observación en el LSM 510 META será de 2 minutos para la obtención de un Z‐Stack no mayor a 30 cortes y con una velocidad de captura de 7. Con el fin de asegurar la obtención de imágenes de calidad en el LSM 510 Meta es necesario cumplir los puntos 1,2 y 3. 3
A continuación se presenta un ejemplo de una muestra ideal con intensidad de fluorescencia adecuada, contraste y fondo negro de Células bovinas útil para observarse en el Microscopio Confocal.
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