Separación electroforética de isoenzimas de la LDH

LDH- 1
IDENTIFICACIÓN DE LAS DIFERENTES ISOFORMAS DE LA LDH MEDIANTE
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
1.-INTRODUCCIÓN
La lactato deshidrogenasa (E.C.1.1.1.27) es una enzima dependiente de NAD+ que se
encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos.
Cataliza la transformación anaerobia de piruvato a lactato según la siguiente reacción:
Tiene un importante papel en el metabolismo de glúcidos, interviniendo en el último
paso de la glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeogénesis a partir de
lactato. Además aporta combustible al ciclo de Krebs en tejidos consumidores de lactato
como el músculo cardíaco.
Su peso molecular es aproximadamente 140.000 Da y su estructura es la de un
tetrámero dispuesto tetraédricamente, en el que la subunidades van unidas por enlaces
hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas. Existen dos tipos distintos de
subunidades: M y H, que dan lugar a cinco tipos de isoenzimas distintas (H4, MH3, M2H2,
M3H y M4) las cuales se han numerado del 1 al 5 en función de su movilidad electroforética.
Así la LDH-1 (H4) es la que más avanza hacia el ánodo mientras que la LDH-5 (M4) es la de
menor movilidad electroforética. Las distintas isoenzimas presentan características cinéticas
diferentes. Su proporción varia según la especie animal, el tejido y el grado de desarrollo del
mismo. La isoenzima M4 (típica de músculo) cataliza mejor el paso de piruvato a lactato,
mientras que la H4 (típica de corazón) pasa preferentemente de lactato a piruvato,
inhibiéndose por este último.
La LDH es una enzima citoplasmática aunque se ha descrito una cierta afinidad de la
subunidad M para unirse a las membranas, que es dependiente de la razón NADH/NAD+. Su
centro activo se encuentra en el interior de cada subunidad, siendo específico para L-lactato,
y utiliza únicamente NAD+ como coenzima. La unión de la coenzima provoca un cambio de
conformación diferente según su estado de oxidación, lo que permitirá el acceso del sustrato.
Esta práctica consiste en separar e identificar las distintas isoenzimas de la LDH por
electroforesis.
2. ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA DE LDH DE MÚSCULO
ESTRIADO DE RATA Y SU COMPARACIÓN CON OTROS TEJIDOS
La electroforesis es una técnica de separación y caracterización de proteínas y otras
moléculas. El soporte a utilizar, en esta práctica, consiste en tiras delgadas de acetato de
celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y
los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separación es muy rápida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
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5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos
Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y son más susceptibles a la
evaporación que el papel. Son también más susceptibles al flujo electro-endosmótico.
3.- MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
.-Tiras de acetato de celulosa ("Cellogel")
.- Papel de filtro para secar las tiras de acetato
.- Cubeta de electroforesis
.- Fuente de electroforesis
.- Placa de vidrio
.- Rodillo
.- Aplicador
REACTIVOS
.- Tampón Tris 0,025 M, glicina 0,192 M pH=8,6
.- Tejidos de rata: riñón, hígado, corazón, músculo, etc.
.- Homogeneizado de tejidos de rata: 1 g de tejido/1,5 ml de Tampón fosfato 50mM,
pH 6,9. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Tomar el sobrenadante y conservar
en hielo hasta su utilización.
.- Solución reveladora (6 tiras de cellogel)
32 ml de Tampón Tris 0,1 M, pH 8,9
8 ml de Lactato sódico 0,5 M
20 mg de NAD+
2 mg de azul de paranitrotetrazolio
En el momento de su utilización se añade 1 mg de metasulfato de
metilfenazina
BIBLIOGRAFÍA.
Isoenzymes "Wilkinson" (1970) pp. 47, 136, 137, 186.
Methods of Enzymatic Analysis "Bergmeyer" (1983) pp 118-155.
Abe K, Matsuki N (2000) Neuroscience Research 38: 325-329.
4.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1.- Electroforesis:
• Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para
su equilibrado.
• Eliminar el exceso de tampón poniendo las tiras entre dos hojas de papel de filtro, con
cuidado de que no lleguen a secarse por completo.
• Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie penetrable
quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se
coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha
• Depositar con ayuda del aplicador una muestras de sobrenadante en cada tira, en el
centro de la misma para que las isoformas se distribuyan entre el cátodo y el ánodo.
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•
Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 200 voltios durante 30
minutos.
4.2.- Revelado específico de las isoenzimas de la LDH:
Después de la separación electroforética, las diferentes isoenzimas de la LDH se
pueden revelar por una coloración específica basada en la reducción enzimática del NAD+,
utilizando la solución reveladora. La tira de acetato de celulosa, después de la migración se
recubre del revelador especifico de la LDH de modo que queden cubiertas por el líquido,
durante 10 minutos en la oscuridad.
El revelado implica tres reacciones de óxido reducción sucesivas, la primera es
catalizada específicamente por la LDH y las siguientes por el NADH y el reactivo MPSM.
• Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+
• NADH + MPSM MPSM reducido + NAD+
• MPSM reducido+ MTT amarillo MPSM + MTT formazán
La presencia de LDH en la tira de acetato de celulosa de electroforesis se visualiza
por el precipitado violeta de formazán formado.
4.3. Cuantificación de las diferentes isoformas por densitometría:
Colocar las tiras sin secar sobre una funda de plástico para evitar que se sequen,
eliminando las burbujas con el rodillo.
La actividad de la LDH en cada banda es proporcional al área del pico en el
densitograma. Medir, utilizando el programa SCION IMAGE, el área de cada pico y calcular
el porcentaje de cada tipo de LDH con respecto del total (suma de todos los picos).
5.- TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS
5.1. Dibujar el patrón de bandas observado tras la electroforesis del homogeneizado de los
diferentes tejidos, indicando la posición del ánodo y cátodo así como el punto de aplicación
de la muestra.
5.2. Dibujar el perfil obtenido después de escanear las tiras de electroresis, indicando la
posición del ánodo y cátodo así como el punto de aplicación de la muestra.
5.3. Calcular, a partir del perfil escaneado, los porcentajes relativos de las diferentes
isoenzimas. Identificar y justificar el orden y proporción de las mismas.