El transporte del yodo hacia el lumen del folículo tiroideo: efecto de
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El transporte del yodo hacia el lumen del folículo tiroideo: efecto de la amiodarona Eleonora Bernal Pinilla Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento Ciencias Fisiológicas Bogotá D.C., Colombia 2010 El transporte del yodo hacia el lumen del folículo tiroideo: efecto de la amiodarona Eleonora Bernal Pinilla Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de Magíster en Bioquímica Directora: PhD Clara Spinel Co-director: PhD Thierry Pourcher Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina Departamento Ciencias Fisiológicas Bogotá D.C., Colombia 2010 III A la vida por darme la oportunidad de aprender un poco más sobre la reglas de la vida, conocer personas maravillosas y aprender que hay mucho por aprender. IV Agradecimientos A todos aquellos que de una u otra manera estuvieron involucrados en el desarrollo de este trabajo. A mi esposo, por su apoyo constante, comprensión que permitieron horas de trabajo y mucho tiempo separados y por sus múltiples asesorías para la ejecución de este trabajo. A mi familia porque sin su apoyo no hubiese sido posible el desarrollo de esta maestría. A la profesora Clara Spinel por ser más que una guía académica, ser una guía de la vida. Al profesor Thierry Pourcher por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio y conocer una parte de la cultura francesa. A todos mis compañeros y amigos de la línea de cultivos tridimensionales con y sin matriz extracelular por darme consejos, ayudarme y ser un apoyo no sólo en el laboratorio sino académicamente (Alejandro, Margarita, Cristina, Jhon, Carolina y Magnolia). A mis compañeros de maestría por brindarme una compañía en este camino académico. A todos los profesores de la maestría en Bioquímica por darme la oportunidad de aprender de ellos, en comprender más la bioquímica y la literatura científica, en especial al Profesor Luis Alberto Gómez, Profesor Carlos Guerrero y Profesor Orlando Acosta. Al grupo de investigación Biofísica y biología de membranas, en especial, a la Profesora Marcela Camacho quien con su liderazgo nos ha mostrado como llevar adelante un grupo de investigación en el país. Al grupo de trabajo de la Unité TIRO (Transporteurs en Imaginerie et Radiotherapie Oncologique) CEA/UNAS Faculté de Médecine Université de Nice Sophia – Antipolis por brindarme compañía y herramientas para el desarrollo de este trabajo y especialmente al Profesor Jaques Darcourt, Profesora Sabine Lindenthal, Marine Breuilly y Fanny Graslin. Al Centro Internacional de Física y todos los que en el laboran por darme un espacio de crecimiento académico. A la Universidad Nacional de Colombia, por ser el alma mater en la cual me forme y me dio oportunidades como ser becaria del programa de Estudiantes sobresalientes de Posgrado. V Al laboratorio Interfacultades de Patología, al Bioterio Experimental de Medicina Veterinaria y al Laboratorio de equipos comunes por permitirme usar sus instalaciones y recursos para el desarrollo de esta tesis. Al Profesor Hernando Curtidor por su apoyo y permitirme el uso del laboratorio en el FIDIC. A los socios de Genética Animal de Colombia Ltda por darme el tiempo necesario para la ejecución y culminación de este trabajo. Al Profesor William Usaquén, Profesor Jimmy Vargas y Blanca Schroeder por su apoyo. Al programa ECOS-NORD por el apoyo económico para hacer la pasantía realizada en la Université de Nice Sophia – Antipolis. Al programa de movilidad de la Facultad de Medicina y Bienestar Universitario por su apoyo para la asistencia a eventos que permitieron parte de mi formación académica. VI Resumen La glándula tiroides regula la tasa metabólica de muchos órganos. El yodo es un componente esencial de las hormonas tiroideas, la T3 (triyodotironina) y la T4 (tetrayodotironina o tiroxina). La amiodarona es un agente poderoso y ampliamente usado como antiarrítmico pero efectos secundarios en esta glándula han sido reportados:, hipotiroidismo como hipertiroidismo con intervalos generales estimados entre 2% y el 24%, siendo el intervalo más común entre el 14% al 18%. Dos hipótesis pueden explicar estas disfunciones en la glándula tiroides: la primera, se puede relacionar con el aumento en la concentración de yodo debido al alto contenido de este halógeno presente en la molécula (37% de su peso molecular) (efecto Wolff-Chaikoff); la segunda, en donde el efecto de la amiodarona es directo e independiente de la concentración de yodo. En este trabajo nosotros estudiamos si hay modificaciones en el transporte del yoduro del tirocito por exposición directa a la amiodarona en folículos tiroideos de ratón in vitro y el papel de sus concentraciones altas de yoduro. Se analizó el estado redox, el transporte de yoduro y la localización de NIS, co-transportador responsable de la entrada de yoduro al tirocito dando una mejor comprensión de las alteraciones que se han reportado. Palabras claves: tiroides, amiodarona, yodo, efectos, Wolff-Chaikoff Abstract The thyroid gland regulates the rate of metabolism of many organs. The iodine is an essential component of thyroid hormones, T3 (tri-iodothyronine) and T4 (tetraiodothyronine or thyroxine). Amiodarone is a powerful and widely-used anthyarritmic agent, but side effects are reported: hypothyroidism as hyperthyroidism with a range estimated between 2% and 24%, most commonly in the range of 14–18%. Two hypotheses could explain these dysfunctions of the thyroid: firstly, it could relate to chronic high iodine concentrations due to the high content of this halogen present in the molecule (37% of it molecular weight) (Wolff-Chaikoff effect); secondly, the amiodarone effect is direct and independent of the iodine concentration. In this work, we studied if there are modifications in the iodine transport in the thyrocytes by direct exposition to amiodarone in thyroid follicles of mice in vitro and the role of its high iodide concentrations. The redox-state, the iodide transport and the localization of NIS, symporter responsible of the iodide entrance to the thyrocyte, were analyzed, let a better understanding of the alterations have been reported. Key words: thyroid, amiodarona, iodine, effects, Wolff-Chaikoff VII Tabla de contenido 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Resumen Lista de Figuras Lista de símbolos y abreviaturas Introducción Marco teórico Materiales y métodos 2.1 Cultivo folículos de tiroides 2.2 Viabilidad 2.2.1 Azul de Trypan 2.2.2 Anexina V - Yoduro de propidio 2.3 Funcionalidad 2.3.1 Sistema redox 2.3.2 Captación de yoduro 2.3.3 Expresión de la proteína NIS Resultados 3.1 Aislamiento y disociación de tiroides 3.1.1 ICR 3.1.2 C57BL6 3.1.3 General 3.2 Viabilidad 3.2.1 ICR 3.2.2 C57BL6 3.3 Funcionalidad 3.3.1 Sistema redox 3.3.2 Captación de yoduro 3.3.3 Expresión de la proteína NIS Discusión Conclusiones Perspectivas Bibliografía Anexo 1. Objetivos Anexo 2. Resumen general Página VI VIII X 1 3 11 11 14 14 14 14 14 16 17 19 19 19 22 23 26 26 28 30 30 32 33 36 44 45 46 54 55 VIII Lista de Figuras Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24. Figura 25. Figura 26. Glándula tiroides de ratón y rata Regulación de la glándula tiroides Cascada de señalización activada por el RTSH en folículos tiroideos Representación esquemática de los promotores de 4 genes de 4 proteínas presentes en la tiroides (Tg, TPO, RTSH y NIS). Demostración del efecto Wolff-Chaikoff por altas dosis de yoduro en rata Esquema del tirocito en donde se señalan los diferentes elementos que intervienen en la síntesis de hormonas tiroideas. Estructura química de la amiodarona Ratones empleados en el estudio Disección de la tráquea junto con la glándula tiroides Proceso de micro disección para obtención de lóbulos tiroideos Estructura química de RedoxSensor Red CC-1 Caja de Petri modificada para ver en microscopio confocal Los diferentes Z obtenidos de un cultivo de folículos de tiroides al ser expuestos a la sonda RedoxSensor Red CC-1 Cultivos de folículos tiroideos de ratón de la cepa ICR Cultivos de folículos tiroideos de ratón de la cepa C57BL6 Diferencias en el tiempo del cultivo primario de folículos tiroideos Presencia de células C en el cultivo de folículos de tiroides Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan en ausencia y presencia de TSH a las 48 de incubación. Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con diferentes concentraciones de yoduro Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con diferentes concentraciones de amiodarona Folículos de ratón en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con DMSO 0.5% Viabilidad de folículos de tiroides en ratón C57BL6 Viabilidad de folículos de tiroides en ratón C57BL6 a las 48 horas de cultivo expuestos a diferentes concentraciones de amiodarona. Diferencias en los estados redox entre folículos de tiroides de ratón a mayor fluorescencia mayor la presencia de ROS Comparación del estado redox entre folículos con TSH y sin TSH Comparación del estado redox entre folículos control y expuestos a amiodarona. Página 3 4 5 5 7 8 9 11 12 13 15 15 16 21 23 24 25 26 26 27 28 28 29 30 31 32 IX Figura 27. Figura 28. Figura 29. Figura 30. Figura 31. Figura 32. Comportamiento del estado redox entre folículos control y expuestos a amiodarona cuando son expuestos a una concentración de NaI de 1x10-4 M Captación de yoduro 48 horas en folículos de tiroides de ratón Inmunohistoquímica en cortes de glándula de tiroides de los ratones utilizados en este trabajo Comparación de la localización de NIS en folículos de ratón incubados 48 horas en condiciones control y amiodarona 10 µM Comparación de la localización de NIS en folículos de ratón incubados 48 horas en condiciones control y amiodarona 25 µM Localización de la proteína NIS en folículos de ratón incubados 48 horas con NaI 1x10-4 M 32 33 33 34 34 35 X Lista de símbolos o abreviaturas Símbolo Término / ~ α Ǻ β II I125 II IP3 µCi µg µM % CO2 C° g Gs Gq KI NaI M P ® T3 T4 Vrs Por Aproximadamente Alfa Angstrom Beta Yoduro Uno Radioisótopo de yodo ciento veinte y cinco Dos Inositol trisfosfato Microcurie Microgramos Micromolar Porciento Dióxido de carbono Grados centígrados Gravedades Proteína G estimulatoria Proteína G q Yoduro de potasio Yoduro de sodio Molar Valor de probabilidad Marca registrada Tri-yodotironina Tetra-yodotironina o tiroxina Versus Abreviatura Término 4HNE ADN AIH AIT AMI AP Bcl2 C57BL6 cAMP CA D1 4-Hydroxynonenal Acido desoxirribonucleico Hipotiroidismo inducido por amiodarona Tirotoxicosis inducida por amiodarona Amiodarona Potencial de acción Proteína antiapoptotica del protooncogén Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) C 57 Black 6 AMP cíclico California Desionidasa 1 XI D2 DAB DAG DIT DMSO DNAsa Duoxs FRTL5 GPXs GTP kDa ME Mg Ml MIT Mm mM mU NADPH NIS Osc PBS PFA pg PKA PLC PRDX5 RER ROS RTSH SFB TAD2 Tg TIRO TRH TRs TSH USA V Desionidasa 2 Diaminobenzidina Diacilglicerol Di-iodo tironinas Dimetilsulfóxido enzima desoxirribonucleasa Oxidasas duales Línea celular de tiroides derivada de rata Fischer Glutatión peroxidasas Guanosin trifosfato Kilodalton Microscopio electrónico Miligramos Mililitros Mono yodo tironinas Milímetros Milimolar Miliunidades Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en su forma reducida Nadium Iodide Symporter (co-transportador sodio/yoduro) Oscilaciones Solución buffer Fosfato Paraformaldehído Picogramos Proteína quinasa A Fosfolipasa C Peroxiredoxina-5 mitocondrial Retículo Endoplasmático Rugoso Especies Reactivas de Oxígeno Receptor de la Hormona estimulante de la tiroides Suero Fetal Bovino Línea celular de tiroides de feto humano transformada por SV40 Tiroglobulina Unité Transporteurs en Imagerie et radiothérapie oncologique Hormona Liberadora de Tirotropina, por sus siglas en inglés Tioredoxina reductasa Hormona estimulante de la tiroides, por sus siglas en inglés Estados Unidos de América Volumen Introducción La tiroides juega un papel esencial en la fisiología de los vertebrados, ya que está encargada de la biosíntesis de hormonas tiroideas, T3 y T4 (tri- yodotironina y tetrayodotironina o tiroxina, respectivamente). Estas hormonas son reguladores esenciales en el metabolismo intermediario en casi la totalidad de los tejidos y en el desarrollo del sistema nervioso del feto y el recién nacido (Riedel C. et al., 2001). Por este motivo, las alteraciones en el funcionamiento de esta glándula son de gran importancia biomédica, siendo prioritario analizar y entender los efectos de agentes que generan disfunción en esta glándula, como es el caso de la amiodarona. La amiodarona fue aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) en 1985 para el tratamiento de arritmias ventriculares. También es eficaz en el tratamiento de taquicardia paroxística supraventricular, fibrilación auricular y flúter (Harjai K.J. & Licata A.A., 1997). Desde entonces es utilizada ampliamente en la clínica para disfunción ventricular izquierda y fibrilación atrial con eficiencias entre el 40% y 80% (Zipes D.P., 1992). No obstante, se han registrado diversos efectos secundarios relacionados con dosis diarias o acumulativas y la duración del tratamiento que incluye micro depósitos cornéales, fotosensibilidad, hepatotoxicidad, toxicidad pulmonar, daños en la glándula tiroides y en otros tejidos. (Vassallo P. & Trohman R.G., 2007). Para el caso de la glándula tiroides, los intervalos generales estimados para que se presente una disfunción en la tiroides relacionada con el consumo de amiodarona están entre 2% y el 24%, siendo el intervalo más común entre el 14% al 18%. En general, varios estudios reportan para tirotoxicosis un rango desde 1% hasta 23% y para hipotiroidismo entre 1% y 32%. Aún no hay una explicación clara frente al por qué de estas disfunciones, aunque se ha visto una relación con el consumo de yodo y la patología que presenta la población. Hipotiroidismo es más frecuente en áreas geográficas con suficiencia de yodo mientras la tirotoxicosis aparece más frecuente en áreas con baja toma de yodo (Martino E., et al., 2001). En América Latina se ha descrito un comportamiento similar y se ha determinado que la mayor prevalencia es para el hipotiroidismo (Diehl L.A. et al., 2006). Se han desarrollado dos hipótesis alrededor de los efectos generados en la tiroides relacionados con el consumo de amiodarona. La mayoría de autores relacionan los efectos de la amiodarona con una exposición a altas concentraciones de yodo, debido al alto contenido de este halógeno en dicha molécula (37% de yodo del peso molecular). Además, la literatura ha descrito que estas exposiciones a altas concentraciones de yodo modifican la fisiología del tirocito, efecto Wolff-Chaikoff, en donde estas altas concentraciones de yodo bloquean durante 24 horas la función de la tiroides al disminuir la producción de hormonas tiroideas (Wolff J & Chaikoff IL, 1948, Harjai KJ 2 & Licata AA, 1997, Martino E, et al., 2001). Sin embargo, el trabajo de Tedelind generó controversia al presentar una nueva hipótesis en donde los efectos generados por la amiodarona serían independientes del yodo observando los mismos efectos entre la amiodarona y un análogo no yodado (dronedarona) (Tedelind S., et al., 2006), no obstante este modelo no cuenta con la estructura folicular, es decir, los tirocitos no están en contacto con una cavidad cerrada, el lumen, lo que enmarca estos resultados únicamente al modelo empleado, monocapa sobre filtros. Por lo tanto, la polémica sobre la importancia del yodo en este tipo de efectos queda nuevamente en juicio, convirtiéndose en un punto interesante a analizar en el modelo de cultivo tridimensional de folículos de tiroideos desarrollado en el grupo (Cabezas R., et al., 2005, Herrera M et al., 2008). Estos trabajos nos muestran algunos datos pero nos dejan muchos más interrogantes en el camino sobre los efectos de este fármaco en esta glándula endocrina. Este trabajo busca aportar conocimiento sobre los efectos de la amiodarona en tiroides, para ello se evalúo los efectos de la amiodarona sobre el transporte de yoduro hacía el lumen y la expresión de una proteína involucrada en este proceso, el co-transportador sodio/yoduro, NIS, por sus siglas en inglés, en folículos tiroideos de ratón in vitro, basados en la hipótesis de trabajo que los folículos expuestos a amiodarona no generan modificaciones en el sistema del transporte del yodo hacía el lumen. Además, este trabajo es novedoso, ya que se va a emplear un nuevo modelo que a diferencia de los demás estudios conserva la estructura tridimensional del folículo, elemento vital, ya que es la unidad funcional de la glándula y se ha visto que es un factor determinante en la expresión de proteínas y por ende de su función (BernierValentin F. et al., 2006). Además, dependiendo si son monocapas cúbicas o planas o pseudofolículos reconstruidos o folículos la expresión de proteínas varia en los diferentes dominios celulares del tirocito, lo cual puede dar diferentes aproximaciones a los fenómenos observados in vivo. Este estudio evalúa los efectos de la amiodarona en el transporte del yoduro y la relación que puede existir con el yoduro a partir de un modelo in vitro, folículos tiroideos, que ha sido demostrado que morfo- funcionalmente se comportan como in vivo (Rivera J et al., 2010 y Herrera M et al., 2010). 3 1. Marco Teórico La tiroides está conformada por dos lóbulos a lado y lado de la tráquea a la altura del cartílago cricoides unidos por un istmo y conformada por un arreglo de folículos en forma ovoide (Figura 1A). El folículo consta de una capa de células epiteliales cúbicas, tirocitos, alrededor del coloide que secretan, lo cual le da una estructura morfofuncional (Figura 1B, 1C). Los tirocitos se unen en la membrana lateral a nivel apical por el típico complejo de unión (unión cerrada (tight junction, desmosomas), dándole una polaridad a las membranas, diferenciando los componentes de la membrana apical y la basolateral. Asimismo, esta polaridad se ve reflejada en la distribución de los organelos celulares donde el núcleo con el retículo endoplásmico rugoso (RER) se ubican en la región basal mientras las vesículas de endo y exocitosis y el complejo de Golgi se encuentran en la región apical de la célula (Figura 1D). A 2x Eleonora Bernal P C B 4x C D 7300x Clara Spinel Eleonora Bernal P 40x Eleonora Bernal P Figura 1. Glándula tiroides de ratón y rata A. Ubicación anatómica de la glándula tiroides en ratón vista dorsal. B. Corte histológico de la glándula tiroides hematoxilinaeosina. El extremo romo de la flecha indica un lóbulo de tiroides, y el extremo afilado de la flecha señala el epitelio de un folículo de la tiroides. C. Folículos tiroideos tinción con hematoxilina. La flecha indica el coloide de un folículo. D. Folículos tiroideos ME. La flecha indica el núcleo de un tirocito. La membrana basal está en contacto con la lámina o membrana basal del tirocito seguido de la lámina basal de los capilares que se encuentran alrededor de todos los folículos y en contacto con las células C o células parafoliculares las cuales sintetizan calcitonina y tiene efectos sobre los depósitos de calcio en el hueso. Mientras la 4 membrana apical erizada de microvellosidades está en contacto directo con el coloide que permite un almacenamiento extracelular (Figura 1D) (Fawcett B, 2000). Para el adecuado funcionamiento de la glándula tiroides, hay dos factores que predominan el control sobre este sistema: hormona tireotrópica (TSH) y el yoduro en la sangre. En el caso de la TSH la regulación es compleja ya que como en otros ejes endocrinos también hay participación del hipotálamo. Este proceso es regulado por la liberación de la Hormona Liberadora de Tirotropina (TRH) que cuenta con un mecanismo de retroalimentación a partir de la tiroxina libre en el plasma, mecanismo muy estudiado en tiroides (Jácome A., 1981, Mariotti S, 2006) (Figura 2). Se sabe que la TSH, glicoproteína conformada por dos subunidades, una cadena α y una β, es la que estimula el funcionamiento de la tiroides al unirse al receptor específico, RTSH. Hipotálamo Pituitaria D1/D2 Riñón Hígado Tiroides Figura 2. Regulación de la glándula tiroides. La TRH estimula la síntesis y la secreción de la TSH. La TRH es regulada directamente por las hormonas tiroideas. La T4 es el principal producto de la glándula tiroides, tiene desidinación de T4 a T3 en el hígado y el riñón dando el 80% de la T3 en circulación. Tanto la T3 como la T4 inhiben la síntesis de TSH. Tomado a partir de: Mariotti S. 2006 y mdconsult.com. El RTSH, es una proteína de 7 hélices alfa transmembrana y está unida a una proteína G intercambiador de nucleótidos de guanina que está divida en 3 sub-unidades: una alfa, beta y gamma, y cuando se une el ligando, este receptor se altera, produciendo un cambio conformacional. Esto permite al complejo G que la sub-unidad alfa se disocie de beta y gamma, y cambie por un nuevo nucleótido con carga GTP, y de la energía para generar cAMP por la adenilato Ciclasa y la activación de PKA, la Gq activa la PLC y generan los segundos mensajeros, DAG e IP 3 (Figura 3) los cuales convergen para activar la transcripción de los genes tiroideos como NIS, TPO, Tg y Duoxs por factores de trascripción como el CREB, TTF-1, TTF-2 y PAX8 (Rousset, B; Dunn JT, 2004, Dumont JE et al, 2008 y Santisteban P) (Figura 4). 5 Figura 3. Cascada de señalización activada por el RTSH en folículos tiroideos. La TSH tras su unión a su receptor de siete dominios transmembranales acoplado a la proteína Gs induce la actividad adenilato ciclasa con el siguiente aumento de cAMP y la activación de PKA mientras la Gq activa la PLC y generan los segundos mensajeros, DAG e IP3 lo que converge en la regulación transcripcional de genes tiroideos. Tomado de: mdconsult.com. Figura 4. Representación esquemática de los promotores de 4 genes de 4 proteínas presentes en la tiroides (Tg, TPO, RTSH y NIS). Tomado de: Santisteban P Para el caso del yoduro, es importante resaltar que las hormonas tiroideas y los yodolipidos son compuestos yodados presentes en tiroides y los cuales cuentan con una significancia fisiológica en los vertebrados y de allí la importancia que toma este elemento no metálico y el más pesado de los halógenos. La química del yodo, como la de los otros halógenos, se ve dominada por la facilidad con la que el átomo adquiere un electrón para formar el ión yoduro, I -, o un solo enlace 6 covalente –I, y por la formación, con elementos más electronegativos, de compuestos en donde su estado de oxidación puede ser +1, +3, +5 o +7. El yodo es el más electropositivo que los halógenos y sus propiedades se modulan por: la debilidad relativa de los enlaces covalentes entre el yodo y elementos más electropositivos; los tamaños grandes del átomo de yodo y del ión yoduro, lo cual reduce las entalpías de la red cristalina y de disolución de los yoduros, en tanto que incrementa la importancia de las fuerzas de Van der Waals en los compuestos del yodo, y la relativa facilidad con que se oxida éste. El único isótopo estable del yodo es el 127I (53 protones, 74 neutrones). De los 22 isótopos artificiales (masas entre 117 y 139); los más empleados son el 131I, con una vida media de 8 días que se utiliza mucho en el trabajo con trazadores radiactivos y ciertos procedimientos de radioterapia. Igualmente, el 125I es utilizado en investigación debido a que tiene una mayor vida media, 60 días. El yodo es moderadamente soluble en líquidos no polares y el color violeta de las soluciones sugiere que se encuentran presentes las moléculas I 2, como en su fase vapor. Aun cuando, por lo común, es menos vigoroso en sus reacciones que los otros halógenos, el yodo se combina directamente con la mayor parte de los elementos; excepciones importantes son los gases nobles, el carbono, el nitrógeno y algunos metales nobles. Los derivados inorgánicos del yodo pueden agruparse en tres clases de compuestos: aquéllos con más elementos electropositivos, es decir, los yoduros; los formados con otros halógenos y los formados con el oxígeno. Los compuestos organoiódicos caen en dos categorías: los yoduros y los derivados en que el yodo se encuentra en un estado de oxidación formal positiva, en virtud del enlace con otro elemento más electronegativo (Holding B.V., 2008). Se ha descrito que la disponibilidad de este elemento, tanto por su exceso como defecto genera fenómenos o patologías. En el caso de altas concentraciones de yodo, se ha descrito un fénomeno autoregulatorio que inhibe la formación de hormonas tiroideas, bloqueando la organificación, disminuyendo la captación de yoduro y elevando los niveles de yoduro en sangre, efecto Wolff-Chaikoff (Figura 5). Pasado este proceso, es seguido por un proceso de escape, en el cual se vuelve a la misma funcionalidad de la glándula, organificando y produciendo hormonas (Wolff J & Chaikoff IL, 1948, Harjai KJ & Licata AA, 1997, Martino E, et al., 2001, Dayem M., et al., 2006). Acerca de los estudios realizados para entender este fenómeno se han desarrollado varios trabajos analizado el fenómeno observado a altas dosis de yoduro de sodio o de potasio. Se ha encontrado que los niveles de mRNA de RTSH no son afectados (Dayem M., et al., 2006), NIS tiene reportes de disminución de la proteína y el mRNA aunque en diferentes tiempos se reporta desde las 24 horas de exposición hasta después de 6 días, experimentos in vivo (rata) (Eng P., et al., 1999, Ferreira A.C., et al., 2005) como in vitro (FRTL-5), y donde muestran una disminución del 27% en la vida media de la proteína Eng P., et al., 2001, Dayem M et al, 2006) y por lo tanto se observa una disminución de la captación de yoduro al interior del tirocito (Ferreira A.C., et al., 2005, Dayem M et al, 2006). La tiroperoxidasa disminuye la expresión de mRNA en modelo in vivo (rata, perro) (Eng P., et al., 1999, Dayem M., et al., 2006) y su actividad de producción de peróxido in vivo (rata) Ferreira A.C., et al., 2005 y Dayem M., et al., 2006) e in vitro (foliculos de 7 tiroides de cerdo) (Morand S., et al., 2003) y la tiroglobulina en un modelo de monocapa de cerdo en filtro muestra disminución en el medio apical (Gruffat D., et al. 1992). Figura 5. Demostración del efecto Wolff-Chaikoff por altas dosis de yoduro en rata. La línea continua muestra el yodo captado, la línea punteada muestra la organificación total y la línea de puntos muestra porcentaje de yodo. Tomado de: Miot F et al, 2010. En el caso de la deficiencia de yodo, una de las manifestaciones más conocidas es el bocio endémico, por carencia de este elemento en la dieta, ya que es necesario consumir en forma regular pequeñas cantidades de yodo dado que el organismo no es capaz de producirlo, generando un aumento en el tamaño de la glándula. También, se han encontrado bociógenos naturales presentes en bebidas y alimentos, procedentes del humus o de los estratos hullíferos (Gaitan E., et al., 1991, Lindsay R.H., et al., 1992, Gaitan E., et al., 1994 y Gaitan E., et al., 1995). Es así como la regulación juega un papel muy importante en la fisiología de esta glándula, al igual que la organización folicular y la polaridad del tirocito que tiene como principal función la producción de hormonas tiroideas. Para llevar a cabo este proceso de formación de hormonas, se requieren de tres puntos: 1) Síntesis de tiroglobulina (Tg), en donde participa el RER, su glicosilación en el Complejo de Golgi para generar una proteína homodimérica (~660 kDa), la cual es llevada al coloide por exocitosis convirtiéndola en la proteína más abundante del tirocito. 2) La entrada del yoduro del plasma sanguíneo hacia el lumen del folículo y la organificación. Para la entrada del yoduro a la célula se cuenta con un transporte de Ieficiente, dado por un transportador de la familia SLC5, NIS, que genera diferencias en la concentración de este ion, acumulando de 20 a 40 veces más respecto al plasma sanguíneo (Jhiang S.M., et al., 1998). Esta proteína esta únicamente en la membrana basolateral y para su transporte activo depende de una ATPasa Na+/K+ (Ondarra A et al, 1985) y tiene como inhibidores competitivos característicos el perclorato y el tiocinato (Carrasco N, 1993, Eskandari S et al, 1997). 8 A nivel apical, se habían postulado dos posibles transportadores de yoduro, pendrina (Royaux I.E., et al., 2000, Kohn L.D. et al., 2001 y Guillam M.P., et al., 2004) y el Transportador Apical de Yoduro (AIT) (Rodríguez A.M., et al., 2002). Sin embargo, esta última proteína ha dejado de considerarse como transportadora de yoduro y ha sido postulada como un sensor de yoduro (Lindenthal S., et al., 2010). Por otro lado, hay otra proteína transmembranal, muy importante en esta membrana, la tiroperoxidasa, enzima oxidoreductasa que oxida el yodo y reduce al peróxido (Morand S., et al., 2003) permitiendo el proceso conocido como organificación, modificación química que implica la unión de varias moléculas de yodo a una molécula orgánica, y que logra este proceso gracias a la presencia de 2 proteínas (Duox 1 y Duox 2) las responsables de la producción de peróxido de hidrógeno, paso limitante en la síntesis de las hormonas, obteniendo finalmente, la yodación de la tiroglobulina conformando así la MIT, la DIT, la T3 y la T4 (Levy O., et al., 1998). Debido a que este proceso se realiza en la superficie de la membrana apical del tirocito y el peróxido de hidrógeno puede difundir hacia la célula, el tirocito cuenta con enzimas y elementos antioxidantes como GPXs, TRs y D1/D2 (Beckett GJ & Arthur JR, 2005). 3) La salida de las hormonas del tirocito, se inicia con la internacionalización de la Tg al lumen de la célula por endocitosis o pinocitosis, degradación parcial en lisosomas y presencia de la desiodinasa tipo I que puede deionidinizar cualquiera de los 2 anillos hasta en un 10% (Rousset, B; Dunn JT, 2004), reciclando siempre el yoduro liberado y finalmente la salida al plasma sanguíneo por la membrana basal a través de la MCT8 (Di Cosmo C, 2010) para que finalmente generará diferentes compuestos yodotironinas como la T3 y la T4 (tri-yodotironina y tetra-yodotironina o tiroxina, respectivamente) (Levy O., et al., 1998) (Figura6). 1 DUOX 1 y 2 3 MCT8 Figura 6. Esquema del tirocito en donde se señalan los diferentes elementos que intervienen en la síntesis de hormonas tiroideas. 1 Síntesis de Tiroglobulina. 2 Transporte de yoduro: NIS (co-trasportador de sodio/yoduro), ATPasa, AIT (Transportador Apical de yoduro), PDS (Pendrina) y organificación: TPO (Tiroperoxidasa) y Duox 1 y 2. 3 Salida de las hormonas tiroideas: MCT8 como proteína exportadora. Además, otras proteínas de importancia en esta célula: TSHR (Receptor de la hormona estimulante de tiroides). Modificado a partir de Spitzweg C. et al., 2002. 9 Es así como la tiroides juega un papel esencial en la fisiología de los vertebrados ya que está encargada de la biosíntesis de hormonas tiroideas, T3 y T4 las cuales son reguladores esenciales en el metabolismo intermediario en casi la totalidad de los tejidos y en el desarrollo del sistema nervioso del feto y el recién nacido (Riedel C. et al., 2001). Asimismo, juega un papel en la regulación del metabolismo: termogenésis, metabolismo de proteínas, carbohidratos, lípidos, vitaminas y óseo (Jácome A, 1979). Por este motivo, las alteraciones en el funcionamiento de esta glándula son de gran importancia biomédica, siendo prioritario analizar y entender los efectos de agentes que generan disfunción en esta glándula, como es el caso de la amiodarona. La amiodarona, 2-butil-3-(3,5-diiyodo-4-dietilaminoetoxibenzoil)-benzofuran es un derivado del benzofuran rico en yodo con aproximadamente un 37% de yodo orgánico del peso molecular (Kishore J. et al., 1997) (Figura 7). Es una molécula amfipática en donde su estructura está compuesta por una parte hidrofílica y la otra hidrofóbica, otorgándole un alto coeficiente de partición. Puede sufrir varias modificaciones químicas entre ellas la desiodinación, la O-dealquilación, la N-dealquilación y la desmetilación (Berger Y. & Harris L., 1986). Figura 7. Estructura química de la amiodarona (Kishore J. et al., 1997). Esta fue aprobada por la Food and Drug Administration (FDA) en 1985 para el tratamiento de arritmias ventriculares. También es eficaz en el tratamiento de taquicardia paroxística supraventricular, fibrilación auricular y flúter (Harjai K.J. & Licata A.A., 1997). Desde entonces, es utilizada ampliamente en la clínica para disfunción ventricular izquierda y fibrilación atrial con eficiencias entre el 40% y 80% (Zipes D.P., 1992). No obstante, se han registrado diversos efectos secundarios relacionados con dosis diarias o acumulativas y la duración del tratamiento que incluye micro depósitos cornéales, fotosensibilidad, hepatotoxicidad, toxicidad pulmonar, daños en la glándula tiroides y en otros tejidos. (Vassallo P. & Trohman R.G., 2007). Para el caso de la glándula tiroides, los intervalos generales estimados para que se presente una disfunción en la tiroides relacionada con el consumo de amiodarona están entre 2% y el 24% , siendo el intervalo más común entre el 14% al 18%. En general, varios estudios reportan para tirotoxicosis un intervalo desde 1% hasta 23% y para hipotiroidismo entre 1% y 32%. Aún no hay una explicación clara frente al por qué de estas disfunciones, aunque se ha visto una relación con el consumo de yodo y la patología que presenta la población. El Hipotiroidismo es más frecuente en áreas geográficas con suficiencia de yodo mientras la tirotoxicosis aparece más frecuente en áreas con baja toma de yodo (Martino E., et al., 2001). En América Latina se ha descrito un comportamiento similar y se ha determinado que la mayor prevalencia es para el hipotiroidismo (Diehl L.A. et al., 2006). 10 Se han desarrollado dos hipótesis alrededor de los efectos generados en la tiroides relacionados con el consumo de amiodarona. La mayoría de autores relacionan los efectos de la amiodarona con una exposición a altas concentraciones de yodo, debido al alto contenido de este halógeno en dicha molécula (37% de yodo del peso molecular). Además, la literatura ha descrito que estas exposiciones a altas concentraciones de yodo modifican la fisiología del tirocito, efecto Wolff-Chaikoff (Wolff J & Chaikoff IL, 1948, Harjai KJ & Licata AA, 1997, Martino E, et al., 2001). Sin embargo, el trabajo de Tedelind generó controversia al presentar una nueva hipótesis en donde los efectos generados por la amiodarona serían independientes del yodo. En este estudio se utilizaron monocapas sobre filtro para conservar la polaridad de los tirocitos y ellos observaron los mismos efectos entre la amiodarona y un análogo no yodado (dronedarona) (Tedelind S et al., 2006). Adicionalmente, se han evaluado los efectos citotóxicos y efectos sobre los tirocitos en donde estudios morfológicos por medio de microscopia electrónica determinaron que la amiodarona genera disminución e irregularidades en las microvellosidades, retículo endoplasmático alterado y lipofuscinogenesis (Pitsiavas V. et al., 1997). Efectos de citotoxicidad por pérdida de viabilidad dado por un aumento de lisis en las células por concentraciones superiores a 75 micromolar (Chiovato L. et al., 1994). Un cambio en el perfil de expresión de genes a partir de tiroides con enfermedad de Graves, enfermedad autoinmune que genera anticuerpos contra el receptor de la TSH, en donde se disminuyó la expresión de genes relacionados con la producción de hormonas y un aumento en los genes involucrados con procesos inflamatorios, reparación de lípidos de membrana y antioxidantes (Yamazaki J., et al., 2007). Por otro lado, también se ha visto un efecto inhibidor sobre la actividad de la desionidasa Tipo I 5, enzima encargada de convertir la T4 a rT3 y posteriormente en T2 lo que genera cambios en las concentraciones de las hormonas tiroideas en plasma incrementando los niveles de T4. Asimismo, un aumento en la presencia de anticuerpos contra la tiroperoxidasa en pacientes con hipotiroidismo inducido por amiodarona (Martino E. et al., 2001). 11 2. Materiales y métodos En este capítulo se mencionan los materiales empleados en este trabajo junto con los protocolos y algunos elementos que determinaron que el método descrito funcionará. En el caso del cultivo la descripción del cultivo en las condiciones finales se describe en el siguiente capítulo ya que lo consideramos más como resultado que como protocolo establecido desde el comienzo de este trabajo. 2.1. Cultivo folículos de tiroides Los folículos tiroideos, fueron obtenidos de la glándula tiroides de ratón (mus musculus) y se usaron dos cepas, la ICR y la C57BL6 (Figura 8), los cuales fueron dados por los bioterios correspondientes de cada institución, Bioterio Experimental Universidad Nacional de Colombia y Bioterio Faculté de Medicine de la Université Sophia-Antipolis.. Los ratones usados fueron machos de 30g aproximadamente, cada ratón fue sacrificado con una dosis de Euthanex ® (INVET) 0.01ml intra-peritoneal (ip) o utilizando Isoflurano (1-cloro-2,2,2-trifluoroetil difluorometil éter) por vía respiratoria llevando a muerte sin dolor, ni maltrato cumpliendo con lo establecido en la Resolución 8430 de 1993 Título IV sobre el adecuado manejo de los ratones. Asimismo, se manejó el esquema de desechos de residuos biológicos de acuerdo al plan ambiental de la Universidad Nacional de Colombia en donde los desechos biológicos son colocados en bolsas rojas, las cuales son recogidas para ir al incinerador o en bolsas amarillas en el caso de la Faculté de Medicine de la Université Sophia-Antipolis. A A Figura 8. Ratones empleados en el estudio. A. ICR B. C57BL6. B 12 La disección y obtención de tejido tiroideo se hizo en base a lo estab lecido por Spinel 1987 en rata en donde, posterior al sacrificio, se debe realizar una disección en la cual se obtiene la tráquea junto con los lóbulos de la tiroides (Figura 9D) los cuales se separan en un proceso posterior y con la mayor esterilidad posible manteniendo sie mpre en medio COON modificado F-12 (Sigma- Aldrich) suplementado con bicarbonato de sodio 2,68 g/L (Sigma-Aldrich) más antibiótico, streptomicina/penicilina 1 ml/100 ml de medio. Este proceso de disección consiste en abrir la piel a la altura del cuello del rató n, separar la piel con agujas, separar cuidadosamente las glándulas salivales, sin ir a maltratar la yugular, ya que la presencia de sangre es indeseable, con ayuda de una pinza tomar ligeramente el músculo que se encuentra en la parte ventral de la tráquea y retirarlo lle vándolo hacia la boca del ratón. Cuando la tráquea esta despejada, tomar con pinzas finas lo más abajo posible la tráquea y cortarla, levantar con las pinzas y cortar el otro extremo lo más arriba posible y llevar lo cortado al frasco que contiene el medio para llevarlo a micro disección (Figura 9). Figura 9. Disección de la tráquea junto con la glándula tiroides. A. Separación de la piel para posteriormente separar los lóbulos de las glándulas salivales B. Desprendimiento del músculo que se encuentra adelante de la tráquea C. Corte de la tráquea de un extremo D. Tráquea con lóbulos de la glándula tiroides para realizar micro disección. En el proceso de micro disección (Figura 10) se usa un estereoscopio para separar los lóbulos de la tráquea quitando el esófago y el músculo alrededor de los lóbulos con pinzas finas, en donde se procura mantener la glándula libre de presión y retirar la capsula que protege a la glándula y este procedimiento debe realizarse manteniendo la glándula en medio COON más antibiótico. Como se observa en la figura 10B la mitad del lóbulo se 13 encuentra sin material alrededor de los folículos mientras la otra mitad, la derecha, aún tiene material conjuntivo que debe ser retirado antes de proceder a la digestión enzimática. 1.2 mm A 1 mm B Figura 10. Proceso de micro disección para obtención de lóbulos tiroideos. A. Tráquea junto con los lóbulos para iniciar el proceso de micro disección al estereoscopio. Flecha gruesa: presencia de un lóbulo de la glándula tiroides. Flecha delgada: ausencia del lóbulo ya que ya fue retirado. B. Uno lóbulo de la glándula tiroides ya separado de la tráquea (nótese el tejido adiposo que lo rodea con los otros tejidos como el muscular que deben ser eliminados en la micro disección). Ya obtenidos los lóbulos, se parten con cuchillas de afeitar en dos para iniciar todo el proceso de digestión enzimática y mecánica con el fin de separa r lo mejor posible los lóbulos entre si y eliminar parte del tejido conectivo que se encuentra alrededor de los folículos. Para ello y se probaron varias enzimas (colagenasa tipo I y II (Sigma-Aldrich), dispasa (Gibco) y DNAsa (Manheim Boehringer)) y a diferentes concentraciones en medio de cultivo COON, realizando este proceso entre 3 y 6 veces a 37°C con agitación continua de 160 osc/min en baño maría en busca de la mejor digestión de la glándula. En cada tiempo de digestión se hace una disociación mecánica con pipeta 5 o 10 ml, que tengan un diámetro de 3 a 5 mm en el extremo distal (no usar pipetas Pasteur aunque se le elimine el capilar pues le fuerza del flujo abre los folículos y se debe evitar generar burbujas de aire, mantener un flujo constante y suave, se centrifuga 3 veces con COON más 5% de SFB (Eurobio) por 5 minutos a 100g para lavar los folículos buscando disminuir y eliminar las enzimas. Al final de la disociación se colocan en COON más 0.5-1% SFB con 5% CO 2 a 37 °C sobre cajas de Petri que previamente fueron cubiertas de Agarosa al 1%, para evitar la adhesión celular y al cambiar el medio se eliminen los folículos abiertos y las células aisladas que mueren. Se deja 2 horas de pre-incubación, se vuelve a cambiar el medio de cultivo 24 horas después, para iniciar los puntos experimentales así: con TSH 0.1 mU/ml (Genzyme Thyrogen) y los tratamientos, amiodarona 1, 10 y 25 µM (Sigma-Aldrich) o yoduro de sodio 1x10-10 , 1x10-7 y 1x10-4 M (Merck) dejando los cultivos incubados con los tratamientos en un tiempo máximo de 48 horas. 14 2.2. Viabilidad Se emplearon dos métodos, el primero, Azul de Trypan y el segundo Anexina V combinada con yoduro de propidio como se muestra a continuación. 2.2.1. Azul Trypan Después de realizados los cultivos se pre- incubo por 24 horas para iniciar allí los tratamientos y dejarlos 48 horas para evaluar con el colorante de exclusión azul de Trypan (Sigma-Aldrich). Se coloca al 2% V/V este colorante y después de 5 minutos se observa en el microscopio invertido. 2.2.2. Anexina V – Yoduro de Propidio Se evalúo la viabilidad por medio del kit Vybrant® Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular ProbesTM) que usa el marcaje de anexina V (fluorocromo verde) y yoduro de propidio (fluorocromo rojo que se intercala con el ADN). El protocolo utilizado fue: - Pasado el tiempo de incubación, llevar muestras a eppendorf - Centrifugar a 100g por 3 minutos - Retirar sobrenadante - Adicionar PBS a temperatura ambiente - Centrifugar bajo las mismas condiciones - Adicionar 100 µl de Buffer Anexina 1x - Adicionar 5 µl anexina V conjugada - Adicionar 1 µl de yoduro de propidio 1x - Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente - Centrifugar - Retirar sobrenadante - Lavar con 200 µl de buffer anexina 1x - Repetir lavado - Ir al microscopio confocal LSM 5 Exciter Zeiss a observar los folículos y en algunos casos tomar imágenes en microscopio invertido para tener imágenes monocromáticas de los folículos. 2.3. Funcionalidad 2.3.1. Sistema redox Para el estudio de la funcionalidad de la tiroides y el efecto del yoduro en el lumen, se evaluó los cambios de especies ROS en las células y a su vez en el lumen, ya que a diferencia de otros modelos, se puede analizar la estructura funcional de la tiroides. Para esto se utilizó la sonda fluorescente RedoxSensor Red CC-1 (R-14060) (Molecular Probes) (Figura 11) y se siguió el siguiente protocolo, todos los cambios de soluciones vienen acompañados de una centrifugación previa a 400g para poder retirar el sobrenadante y 15 añadir la solución que le sigue, es así como, este paso no se va a mencionar a continuación pero es vital ya que los folículos se encuentran en suspensión. - - Colocar los folículos en eppendorf Lavar con nuevo medio con las condiciones de tratamiento que tuviese previamente 3 veces Adicionar solución Red CC-1 En un vial se adicionan 150 µl DMSO (Merck) y se mantiene a -20 °C De este vial que se encuentra a una concentración de 1 mM tomar 1 µl y adicionarlo a 1 ml de medio COON. Incubar a 37 °C por 10 minutos Lavar con nuevo medio con las condiciones de tratamiento que tuviese previamente 3 veces Llevar a microscopio confocal LSM 5 Exciter Zeiss y colocar en caja de petri modificada (Figura 12). Figura 11. Estructura química de RedoxSensor Red CC-1. Para la adquisición de imágenes en el microscopio confocal se obtuvieron al menos 3Z por cada cultivo (Figura 13) para poder hacer posteriormente el análisis de la sonda fluorescente. Figura 12. Caja de petri modificada para ver en microscopio confocal. 16 Figura 13. Los diferentes Z obtenidos de un cultivo de folículos de tiroides al ser expuestos a la sonda RedoxSensor Red CC-1. De izquierda a derecha Z1, Z2, Z3, imágenes para analizar estado redox. Las imágenes fueron tomadas cada 5 minutos y en el momento de añadir el yoduro de sodio se tomaron las imágenes a los 2 minutos de añadido, la concentración final del yoduro de sodio fue de 1x10-4 M. Para el análisis de imágenes, se analizó que Z, presentaba una mejor visualización del lumen y de los tirocitos, a manera de ejemplo, en la figura 4, vemos que el primer Z, se ven muy bien los tirocitos mientras en el Z3, mejor los lúmenes. Después de decidir los Z, se tomaron zonas de cada imagen, tomando entre 3 a 4 folículos diferentes y con ayuda del programa Image J (Rasband W.S, 1997-2009) se medio la cantidad de fluorescencia. Estos valores fueron analizados en el programa de Microsoft Excel 2007 y en SPSS v 16, se realizaron pruebas no paramétricas: Kruskal-Wallis y Mann-Whitney y para evaluar las diferencias al colocar el yoduro se utilizó un Chi-cuadrado comparando los valores con la ecuación lineal obtenida con todos los puntos. 2.3.2. Captación de yoduro Después del proceso de pre- incubación se preparó el medio en el cual se iban a poner los folículos: TSH, medio COON con SFB 5%, NaI 1x10-10 M y con o sin 25 µM de amiodarona, más 25 µl de I125 0,1 µCi (Donado por el Profesor Hernando Curtidor). Antes de colocar los folículos en este medio, se colocaron en azul de Trypan para ver si la viabilidad y los folículos estaban en buen estado. Después de tres lavados con COON, se colocaron en el medio preparado en cajas cubiertas de agarosa 1%. Se llevo a un contador gamma a las 48 horas de estar incubado. Para la normalización de los datos se utilizo el protocolo de fenol/cloroformo/alcohol isoamilico (Invitrogen) para obtener la fracción de proteínas y cuantificarla en el nanodrop (Thermo Scientific). 17 2.3.3. Expresión de la proteína NIS Para determinar si se modificaba la localización y expresión de la proteína encargada de la entrada del yoduro al tirocito se realizaron 2 protocolos, el de corte sobre tejido en parafina y el de los folículos en cultivo. Para los controles negativos, una muestra sea de tejido o de cultivo fue incubada sin anticuerpo primario. Inmunohistoquímica Los ratones fueron anestesiados con ketamina para permitir la perfusión con PFA tamponado con PBS al 4% (pH 7.4). La glándula tiroides fue extraída y conservada en PFA durante 5 horas a temperatura ambiente. Se realizó el proceso de deshidratación para embeber los tejidos en parafina y realizar cortes de 5 μm que fueron usados para el proceso de inmunohistoquímica. Se utilizó un complejo Avidina-Biotina (ABC) usando el kit Vectastain® (Vector Laboratorios Inc., Burlingame, CA, USA) y el protocolo que se siguió fue el siguiente: - La glándula fue desparafinada y mantenida en horno a 37°C durante 12 horas El tejido fue hidratado con sucesivas inmersiones a partir de xilol y con alcohol a diferentes concentraciones y posteriormente lavados con agua destilada Bloqueo de peroxidasa con peróxido al 3% , 30 minutos temperatura ambiente Lavar en vaso coplin con agua Recuperación con el antígeno Target® (Dako Corporation, Carpintería, CA, USA) en un baño de maría 1 hora Incubar con suero en la cámara húmeda 1 hora Eliminar el exceso de suero Incubar con Anti-NIS 1:300 (Donación del Profesor Thierry Pourcher de la Unité TIRO, Université de Nice Sophia – Antipolis, Francia)1 hora Lavar con PBS 3 veces Biotinilado 30 minutos Lavar con PBS 3 veces ABC 30 minutos Revelado con DAB (Dako) 30 segundos Lavar con agua Contracolorear con hematoxilina 30 segundos Lavar con agua exceso de hematoxilina El tejido debe ser deshidratado para el montaje con resina. 18 Inmunocitoquímica Todos los cambios de soluciones vienen acompañados de una centrifugación previa a 400g para poder retirar el sobrenadante y añadir la solución que le sigue, es así como, este paso no se va a mencionar a continuación pero es vital ya que los folículos se encuentran en suspensión. - Lavar folículos con PBS Adicionar PFA 4% por 15 minutos Lavar con PBS, 3 veces Incubar con cloruro de amonio 50 mM y Glicina 100 mM por 30 minutos Adicionar cloruro de amonio 50 mM por 30 minutos Lavar con PBS 3 veces Permeabilizar con tritón x-100 0.1% en PBS por 10 minutos Lavar con PBS 3 veces Incubar con suero 1% p/v preparado en PBS durante 1 hora Retirar el exceso de suero después de centrifugar Incubar toda la noche a 4 °C con agitación el anticuerpo policlonal contra ratón anti-NIS 1:300. Lavar con PBS/suero 1% P/V, 3 veces Incubar con Alexa 488 anti-conejo 1:1000 por 1 hora Lavar con PBS/suero 1% P/V, 3 veces Incubar con DAPI 1:100 por 10 minutos Lavar con PBS/suero 1% P/V, 3 veces Observar en microscopio confocal LSM 5 Exciter Zeiss colocando la muestra en caja de Petri para observar directamente sin medio de montaje (Figura 12). 19 3. Resultados El modelo desarrollado en este trabajo busca resaltar la tridimensionalidad de las estructuras celulares y trabajar con la unidad funcional de la glándula tiroides, por ende, este trabajo ha sido a partir del folículo tiroideo. Este modelo ha sido trabajado y desarrollado por el grupo de investigación Línea Cultivos tridimensionales con y sin matriz extracelular liderado por la Profesora Clara Spinel del Grupo de Biofísica y Biología de membranas del Centro Internacional de Física y la Universidad Nacional de Colombia. Este modelo fue desarrollado en rata (Spinel C, et al., 1990) y posteriormente se ha desarrollado en otras especies: humano (Orozco et al, 1997, Cabezas et al 2005), cerdo (Herrera M, et al., 2008) y ratón (Cabezas et al., 2005, Bernal E et al.2010). 3.1. Aislamiento y disociación de tiroides Se observaron diferencias entre las glándulas de tiroides entre las 2 cepas, en cantidad de adipocitos y tamaño de la glándula y de los folículos siendo la ICR la de menor cantidad de adipocitos y mayor tamaño. Es así como a partir de la disección las 2 cepas son diferentes, la glándula presenta una menor cantidad de tejido conectivo en la ICR y los folículos se encuentran con menor adhesión entre ellos, por lo cual el proceso de digestión enzimática y mecánica varía un poco y el protocolo es diferente entre las 2 cepas. Asimismo, el protocolo fue modificado de lo que se había determinado para rata y cerdo. Es así como a continuación, muestro las diferencias entre las dos cepas y los resultados obtenidos en cultivo. 3.1.1. ICR Para los ratones ICR se utilizaron varias modificaciones tanto en micro disección como en disociación enzimática. Se inició con el protocolo establecido por Cabezas en donde se usaba únicamente colagenasa 250 U/ml, digestión de 30, 15, 15 y 15 minutos, para hacer un lavado al 2% SFB en medio COON y filtrando con una malla de 300 µm. Se obtenían tirocitos más no folículos, y quedaba un material considerable atrapado en el filtro. Así que se utilizaron: colagenasa tipo I, la cual arrojó resultados similares, se jugó con la concentración de la colagenasa tipo II desde 50 U hasta 300 U, y se observo que a 300 U/ml la concentración fue muy alta afectando la estructura folicular (Figura 14A) y a concentraciones por debajo de 250 U/ml, la disociación es deficiente y se requeriría de más tiempo (Figura 14B). 20 Asimismo, se observo que el uso de pipetas Pasteur deterioraba mucho los folículos a pesar de que el capilar hubiese sido modificado (Figura 14C), el ideal es usar pipetas que la punta tenga al menos unos mm. En el caso del uso de la dispasa, a una concentración de 1 U/ml no disociaba el material si no lo ponía más baboso (Figura 14D) y cualquier folículo que hubiese estado liberado se unía a este conjunto de material celular que tenía muchos problemas de viabilidad. Mientras que a 0,5 U/ml el resultado mejoraba considerablemente, obteniendo grupos de folículos (Figura 14E y F). Igualmente, se observo que la calidad de la micro disecció n es fundamental para la buena ejecución de la disociación enzimática y mecánica, ya que si no es retirado de manera adecuada el material conectivo que circunda los lóbulos, la digestión es pobre, dejando casi el material intacto frente a las enzimas, es a sí como partir el lóbulo al menos en dos porciones favorece la disociación de los folículos que se ubican más hacia el centro del lóbulo. Finalmente, el protocolo establecido para hacer cultivo de folículos de ICR quedo de la siguiente manera: Preparación de soluciones: - Colagenasa 250 u/ml y dispasa 0,5 U/ml - COON + SFB 5% para lavados - COON + 0,5% para incubación Micro disección: lóbulos partidos en 2 después de retirar el material conectivo alrededor Disociación enzimática a 37 °C 160 osc/minuto en los siguientes tiempos: 15 minutos 5 minutos 5 minutos 10 minutos Disociación mecánica con pipetas de punta ancha, 20 pipeteadas en cada paso. Lavados centrifugando a 50 g Incubación en COON más 0.5% SFB con 5% CO 2 a 37 °C sobre cajas de Petri que previamente fueron cubiertas de Agarosa al 1%. 21 A B C D E F Figura 14. Cultivos de folículos tiroideos de ratón de la cepa ICR. A. Uso de colagenasa tipo II 300 U/ml. B. Uso de colagenasa tipo II 200 U/ml. C. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml con disociación mecánica con pipeta Pasteur. D. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml con dispasa 1 U/ml. E. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml con dispasa 0.5 U/ml con un tiempo de disociación de 20, 15, 10, 10 minutos F. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml con dispasa 0.5 U/ml con un tiempo de disociación de 15, 5, 5, 10 minutos. 22 3.1.2. C57BL6 Para la cepa C57BL6 se inició con el protocolo de ICR pero los resultados fueron completamente diferentes, en este no se obtuvieron folículos, sino una masa de desechos celulares con los folículos inmersos en ellos (Figura 15A). Es así como se inició nuevamente la estandarización de este cultivo, comenzando con disminuir a 200 U/ml la colagenasa tipo II y la concentración de dispasa, pero la disociación fue igualmente mala. Posteriormente, por comunicación personal se inicio el uso de la DNAsa (ver discusión) y se eliminó la dispasa, los resultados de los cultivos mejoraron pero la disociación era insuficiente y variaba mucho en el tiempo (ver discusión), se jugó con diferentes concentraciones de DNAsa y se dejo la concentración de colagenasa tipo II como se había estandarizado para ICR (Figura 14) y para lograr grupos más pequeños de folículos, se jugó con los tiempos de disociación aumentándolos ligeramente. Finalmente, el protocolo establecido para hacer cultivo de folículos de C57BL6 quedo de la siguiente manera: Preparación de soluciones: - Colagenasa 250 u/ml y DNAsa 33 µg/ml (ver discusión) - COON + SFB 5% para lavados - COON + 1% para incubación Micro disección: lóbulos partidos en 2 después de retirar el material conectivo alrededor Disociación enzimática a 37 °C ~ 150 osc/minuto en los siguientes tiempos: 30 minutos 10 minutos 10 minutos 10 minutos 5 minutos 5 minutos Disociación mecánica con pipetas de punta ancha, 20 pipeteadas en cada paso. Lavados centrifugando a 125 g Incubación en COON más 1% SFB con 5% CO 2 a 37 °C sobre cajas de Petri que previamente fueron cubiertas de Agarosa al 1%. 23 A B 50 µm 50 µm C 50 µm D 50 µm E 50 µm F 50 µm Figura 15. Cultivos de folículos tiroideos de ratón de la cepa C57BL6. A. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml con dispasa 0.5 U/ml B. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml y DNAsa 25 µg/ml. C. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml y DNAsa 60 µg/ml. D. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml y DNAsa 25 µg/ml. E. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml y DNAsa 33 µg/ml con mayor tiempo de disociación. F. Uso de colagenasa tipo II 250 U/ml y DNAsa 33 µg/ml. 3.1.3. General Al preparar las soluciones, es importante, verificar el pH de los medios y que se encuentre alrededor de 7.2. En cada tiempo de digestión se hace una disociación mecánica con pipeta, la cual debe procurar no generar burbujas y mantener un flujo constante y suave, se 24 centrifuga 3 veces con COON más 2 ó 5% de SFB por 5 min a 50 ó 125 g para lavar los folículos buscando disminuir y eliminar las enzimas. Al final de la disociación se colocan en COON más 0.5-1 % SFB con 5% CO 2 a 37 °C, este medio es cambiado a las 2 horas y se pre- incuban por 24 horas antes de incubar con los tratamientos y con la TSH (0.1 mU/ml). Igualmente es importante, cambiar de cajas cuando se cambia el medio ya que quedan células y desechos celulares. Pasado el tiempo, se observan que los folículos que se encontraban aislados se van uniendo al grupo de folículos y a las 48 horas de incubación, es decir, 74 horas después de terminado el cultivo, se encuentra un grupo de folículos completamente unidos y donde se observa el lumen entre ellos, comportamiento observado independiente del tratamiento que tuviesen las células (Figura 16). Figura 16. Diferencias en el tiempo del cultivo primario de folículos tiroideos. A. Folículos de la cepa ICR terminado el cultivo -26 horas. B. Folículos de la cepa ICR +48 horas de cultivo. Por otro lado, se observaron diferencias en los tamaños de los folículos podían variar entre 25-200 µm al igual que el alto de las células en donde podían observarse algunas con mayor altura que otras. Los diferentes cultivos realizados presentaron ciertas variaciones en la cantidad de disgregación entre folículos y a medida que pasa el tiempo los folículos se van uniendo. Para el caso de los folículos obtenidos de la ICR el tamaño promedio era alrededor de 100 µm mientras los de C57BL6 eran en promedio de 50 µm. Asimismo, en algunos cultivos se podían observar el otro tipo de célula que se encuentra en la glándula tiroides, las células C, (Figura 17) fácilmente reconocibles y las cuales podrían quedar y permanecer en cultivo. 25 Figura 17. Presencia de células C en el cultivo de folículos de tiroides. 26 3.2. Viabilidad Para conocer en más detalle el modelo utilizado en este trabajo, se desarrollaron pruebas de viabilidad con el objeto de identificar cuando el cultivo, los folículos, estarían en buenas condiciones para el estudio funcional y a su vez conocer si los tratamientos a utilizar generaban algún efecto en la viabilidad de los folículos. Para esto, se emplearon dos métodos, el primero, Azul de Trypan y el segundo Anexina V combinada con yoduro de propidio como se muestra a continuación. 3.2.1. ICR A partir del cultivo obtenido en esta cepa se evalúo con azul de Trypan la viabilidad de los folículos. En general se observó en todos los cultivos que algunas células estaban teñidas y si se encontraba material conectivo alrededor, este también se marcaría. Para el caso de la presencia o ausencia de TSH (Figura 18), se muestra que la viabilidad de los folículos está bien y no se vio que hubiera diferencias en presencia o ausencia de esta hormona, y al mismo tiempo se puede visualizar que los folículos están cerrados. +TSH -TSH Figura 18. Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan en ausencia y presencia de TSH a las 48 de incubación. En cuanto a los tratamientos utilizados, con las concentraciones de NaI (1x10-4 y-7 M) (Figura 19) se muestra que sin yoduro o con yoduro, no hay cambios notables a través de este sistema, algunas células teñidas, folículos en buen estado y cerrados. A +TSH B +TSH + NaI 1 x10-7 M C +TSH + NaI 1x10-4 M Figura 19. Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con diferentes concentraciones de yoduro. A. Sin yoduro. B. En presencia de NaI 1x10-7 M. C. En presencia de NaI 1x10-4 M. 27 En el caso de las tres concentraciones de amiodarona (1, 10 y 25 µM) la diferencia más clara es a la concentración más alta utilizada, 25 µM, ya que se observan folículos completamente muertos, a pesar de que hay algunos que no se observan coloreados (Figura 20). Este comportamiento se repitió en más de tres experimentos, corroborando que la viabilidad de los folículos, se ve comprometida con esta concentración pero no en el 100% del cultivo. Estos resultados debieron verificarse con el otro sistema de viabilidad que arroja datos más precisos sobre este proceso celular. A B +TSH +AMI 1 µM C D +TSH +AMI 10 µM E F +TSH +AMI 25 µM Figura 20. Folículos de ratón ICR en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con diferentes concentraciones de amiodarona. A. Amiodarona 1µM tomada con objetivo 10x. B. Amiodarona 1 µM tomada con objetivo 40x. C. Amiodarona 10µM tomada con objetivo 10x. D. Amiodarona 10 µM tomada con objetivo 40x. E. Amiodarona 25 µM tomada con objetivo 10x. F. Amiodarona 25 µM tomada con objetivo 40x. 28 Finalmente, el DMSO (0.5%) (Figura 21) utilizado para solubilizar la amiodarona no muestra cambios en la viabilidad por medio de este colorante. A B C AMI 1 µM 1h rato 50 µM +TSH +MMI 4 µM +TSH +DMSO 0.5% Figura 21. Folículos de ratón en presencia de Azul de Trypan a las 48 horas de incubación con DMSO 0.5%. 3.2.2. C57BL6 Para esta cepa se confirmo por medio del sistema Vybrant® Apoptosis Assay Kit la viabilidad de los folículos en el tiempo de trabajo (máximo 48 horas de incubación) en presencia de TSH (Figura 22) y se observo que la viabilidad de los folículos es buena, presenta algunas células muertas, especialmente en las primeras horas, ya que las células que sufrieron algún daño en todo el proceso de cultivo entran en muerte celular. Además, se observa que células endoteliales que están encima de los tirocitos son las células con menor viabilidad como se observa en la (Figura 22A) y que estas ya no están presentes a las 48 horas de cultivo (Figura 22B). Figura 22. Viabilidad de folículos de tiroides en ratón C57BL6 A. 1 hora de cultivo. B. 48 horas de cultivo. Verde: Anexina V, Rojo: yoduro de propidio. Asimismo, si las células se empiezan a despegar de la estructura folicular, se observa que presentan tanto marcaje de anexina V como de yoduro de propidio (Figura 22B). 29 Este comportamiento únicamente muestra que células afectadas entran en proceso de muerte, pero el folículo sobrevivive a dicho proceso. Igualmente, se evalúo en presencia de las tres concentraciones de amiodarona (Figura 23) corroborando los resultados obtenidos con Azul de Trypan, algunos folículos se encuentran en pésimo estado a la concentración de 25 µM de Amiodarona (Figura23C), más no el 100% de ellos se encuentra en este estado. En las otras dos concentraciones, al igual que el control, algunas células presentan muerte celular, más el folículo está en un buen estado. A B C Figura 23. Viabilidad de folículos de tiroides en ratón C57BL6 a las 48 horas de cultivo expuestos a diferentes concentraciones de Amiodarona. A. 1µM Amiodarona. B. 10 µM Amiodarona. C. 25µM Amiodarona Verde: Anexina V, Rojo: yoduro de propidio. 30 3.3. Funcionalidad La clave de este trabajo se centra en evaluar si hay o no diferencias en la función de la unidad funcional de la glándula tiroides, el folículo, cuando es expuesto a concentraciones altas de yoduro y a la amiodarona. Es así como a continuación se presentan algunos procesos y proteínas relacionados con el transporte de yoduro hacia el lumen del folículo tiroideo cuando es expuesto a estas moléculas. 3.3.1. Sistema redox Al utilizar la sonda CC-1 se encontraron diferencias en las actividades de los folículos, mostrando la heterogeneidad funcional que hay entre ellos y especialmente es más notorio en los lúmenes que en los tirocitos (Figura 24). Los lúmenes que presentan una fluorescencia más fuerte indican que la cantidad de ROS es mayor, mientras que lo que no tenga fluorescencia indicará que no hay presencia de estas moléculas. Figura 24. Diferencias en los estados redox entre folículos de tiroides de ratón a mayor fluorescencia mayor la presencia de ROS. Se evalúo el estado redox de los folículos en ausencia y presencia de TSH (Figura 25) y se verifico con microscopio de luz, si los lúmenes se veían traslucidos y en buenas condiciones antes de colocar en contacto la sonda con los folículos. Se compararon los tiempos con cada tratamiento en cada compartimiento usando Kruskal-Wallis y no se encontraron diferencias significativas con p > 0.177; α 0.05. Como se observa en la siguiente figura, cuando los folículos son estimulados con TSH ocurren dos comportamientos: el lumen presenta en promedio mayor cantidad de ROS que los tirocitos y las diferencias notorias, más de 50 unidades arbitrarias de fluorescencia, entre un compartimiento y el otro, mientras sin TSH la mayor cantidad de ROS esta en las células, no hay mayor actividad en los lúmenes de los folículos y son valores con una diferencia más estrecha que lo observado con TSH. Además, los valores obtenidos en los folículos sin TSH están por debajo de lo observado en los folículos con estimulo de la hormona. 31 Fluorescencia (Unidades arbitrarias) 250.0 200.0 150.0 Tirocitos con TSH Lumenes con TSH 100.0 Tirocitos sin TSH Lumenes sin TSH 50.0 0.0 0 5 10 15 Tiempo (minutos) Figura 25. Comparación del estado redox entre folículos con TSH y sin TSH. Haciendo la comparación con la prueba no paramétrica, Mann-Whitney, se encontró que hay diferencias significativas p < 0.01; α 0.05 entre los tirocitos y los lúmenes de los folículos expuestos a TSH vrs los no expuestos a la hormona, corroborando que el sistema es sensible a condiciones externas y en este caso la TSH genera un efecto de activación en los folículos. Ya corroborado el sistema, se evalúo que ocurría con los folículos expuestos a amiodarona y se analizaron las diferencias entre los tirocitos y los lúmenes de cada uno. Se observó que los folículos expuestos a amiodarona presentan menor cantidad de ROS, los cambios más drásticos están en los tirocitos en donde los valores son cercanos a los obtenidos con los folículos no expuestos a TSH y el lumen a pesar de tener una mayor presencia de ROS frente a las células, comportamiento observado en el control, presenta una disminución más rápida en el tiempo (Figura 26). Se encontraron diferencias significativas con Mann-Withney entre los folículos expuestos a amiodarona vrs los control con un p < 0.01; α 0.05. Con estos resultados que muestran claramente que hay alteraciones en el sistema de generación del estado redox en el folículo, es así como se prosiguió a evaluar que ocurría con el transporte de yoduro hacia el lumen del folículo, teniendo en cuenta que la sonda presenta un comportamiento lineal. Los folículos se expusieron a una concentración alta de NaI, 1x10-4 M, y lo que se observó entre los folículos control y los expuestos a amiodarona fue que los lúmenes de los folículos control presentaron una reducción a los 2 minutos con diferencia significativa por Chi-cuadrado p < 0.01; α 0.05 al haberse adicionado el yoduro, comportamiento ausente en los folículos con amiodarona (Figura 27). Asimismo, el sistema nos permitió observar que no hubo diferencias en la producción de ROS en las células, tirocitos, independientemente de si estas estaban o no en presencia de amiodarona (Figura 27). 32 Fluorescencia (unidades arbitrarias) 250.0 200.0 150.0 Tirocitos control Lumenes control 100.0 Tirocitos amiodarona Lumenes amiodarona 50.0 0.0 0 5 10 15 Tiempo (minutos) Fluorescencia (unidades arbitrarias) Figura 26. Comparación del estado redox entre folículos control y expuestos a amiodarona. 250.0 Tirocitos control 200.0 ¥ Lumenes control 150.0 Tirocitos amiodarona 100.0 Lumenes amiodarona 50.0 Lineal (Lumenes control) 0.0 0 5 10 15 17 20 25 30 35 37 Tiempo (minutos) Lineal (Tirocitos amiodarona) Figura 27. Comportamiento del estado redox entre folículos control y expuestos a amiodarona cuando son expuestos a una concentración de NaI de 1x10 -4 M. La flecha indica el tiempo en el cual fue adicionado el yoduro. ¥ p < 0.01; α 0.05. 3.3.2. Captación de yoduro Observando las diferencias en el lumen del folículo cuando se puso el yoduro en el medio, se evalúo la entrada de este ion al folículo, proceso que se denomina captación de yoduro. Se encontró que hubo diferencias en la cantidad de yoduro que entra a los folículos cuando estos son expuestos a amiodarona a una concentración de 25 µM con respecto al control (Figura 28). Tratamiento en las células 33 AMI 25µM control 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Yodo total captado (pg)/Proteína (mg/ml) Figura 28. Captación de yoduro 48 horas en folículos de tiroides de ratón. 3.3.3. Expresión de la proteína NIS Como parte fundamental en el transporte de yoduro hacia el lumen, está la proteína descrita en la literatura, el co-transportados sodio/yoduro, NIS, proteína encargada de la entrada del yoduro desde el plasma sanguíneo hacia el tirocito. Es así como se evalúo su expresión y localización en el cultivo de folículos tiroideos. Como control se realizo una inmuno histoquímica en cortes de glándula de tiroides de los ratones utilizados para este trabajo. En esta inmuno histoquímica se puede observar como la expresión de esta proteína se encuentra baso-lateralmente (Figura 29). A B Figura 29. Inmunohistoquímica en cortes de glándula de tiroides de los ratones utilizados en este trabajo. A. Expresión de NIS. B. Control negativo. En cultivo como se observa en la figura, la proteína se encuentra expresada basolateralmente en condiciones control pero cuando esta es expuesta por 48 horas a amiodarona 10 µM (Figura 30) ó 25 µM (Figura 31) la localización de la proteína deja 34 de ser basolateral y se vuelve más intracelular al igual que lo observado para folículos expuestos a NaI 1x10-4 M (Figura 32). A A B Figura 30. Comparación de la localización de NIS en folículos de ratón incubados 48 horas en condiciones control y amiodarona 10 µM. A. Condiciones control: TSH 0,1 mU/ml y 1x10-10 M NaI. B. Amiodarona 10 µM. A B B Figura 31. Comparación de la localización de NIS en folículos de ratón incubados 48 horas en condiciones control y amiodarona 25 µM. A. Condiciones control: TSH 0,1 mU/ml y 1x10-10 M NaI. B. Amiodarona 25 µM. 35 Figura 32. Localización de la proteína NIS en folículos de ratón incubados 48 horas con NaI 1x10-4 M. 36 4. Discusión Para evaluar los efectos de la amiodarona en un modelo in vitro que ha demostrado comportarse como in vivo (Spinel C., et al., 1990, Rivera J., et al., 2010) se desarrollo en este trabajo el cultivo de folículos de ratón en la cepa ICR y C57BL6 partiendo inicialmente de un protocolo para obtener folículos de ratón descrito por Cabezas en 2005. Se hicieron modificaciones sobre este protocolo, añadiendo la DNAsa y cambiando los tiempos empleados para la disociación enzimática en cada cepa. Al trabajar con la cepa ICR y la C57BL6 (Figura 14 y 15) los protocolos difirieron aumentando considerablemente los tiempos de disociación en la última cepa, ya que la glándula presentaba mayor cantidad de tejido conectivo lo que dificultaba la disociación del tejido. Por otro lado, para contar con un buen cultivo de folículos es indispensable la buena disección y micro disección sobre la glándula para que las enzimas puedan tener el resultado esperado, no lesionar el tejido por daño mecánico con el material de la micro disección o tener una mala disociación. Es de mencionar que independiente de la buena micro disección realizada se encontraba en baja proporción la presencia de células C (Figura 17) las cuales se podían descartar fácilmente de los experimentos por sus diferencias en tamaño y ausencia de lumen. En cuanto al adecuado uso de las enzimas (concentración y tipo) es importante fijar un rango de concentración útil y que no supere 50U/ml ya que los resultados obtenidos con diferencias iguales o superiores a este valor fueron significativos. Igualmente, la escogencia de las enzimas es fundamental, la colagenasa tipo II es la más adecuada de todas las colagenasas para la disociación de tiroides, y se encuentra reportada en la literatura por varios autores; la dispasa, metaloproteasa neutral, en ICR arrojó buenos resultados pero con la otra cepa, C57BL6, nunca funciono por lo cual es una enzima que se puede usar pero si se omite también se pueden obtener buenos resultados, haciéndola una enzima no indispensable para la disociación de la tiroides si se quiere obtener y cultivar los folículos de tiroides. Por último, la DNAsa, que tiene como función clivar enlaces fosfodiester del ADN, y el cual es muy útil para destruir el ADN que es liberado por las células que se rompen en el proceso de disociación y cultivo. Esta enzima a lo largo de este proyecto, tomó mucha importancia ya que en trabajos realizados al interior de la línea de investigación, se realizó un experimento funcional de folículos y se observo que la funcionalidad disminuía considerablemente cuando no se adicionaba DNAsa (comunicación personal Rivera J & Spinel C) motivo por el cual se incluyó en los protocolos. Finalmente, es indispensable recalcar que las concentraciones de las enzimas deben variarse 37 ligeramente con el tiempo ya que estas van perdiendo actividad y por supuesto tener todos los cuidados para el buen almacenamiento de estas (temperatura, humedad y luz). Por otro lado, la concentración definida de la DNAsa en este trabajo debe ser reevaluada ya que se utilizó una enzima vencida que según lo reportado en la literatura pierde actividad con el tiempo entre 5-10% por año, y es quizás la causa de la variación en el tiempo en los resultados obtenidos en la disociación; es así como la concentración para una DNAsa vigente debería estar en el rango de 7 a 22 µg/ml como lo reporta la literatura del grupo para el cultivo de folículos. En protocolos desarrollados en la línea de investigación de cultivos de folículos de tiroides en otras especies, se determinaron las siguientes concentraciones de enzimas, en rata (colagenasa tipo II 250 U/mL + DNAsa 2 g/mL) (Spinel C., et al., 1990) y en cerdo (colagenasa tipo II 300 U/mL + DNAsa 125 U/mL (Herrera M. et al., 2008). Mientras en este trabajo se determino en ratón ICR (colagenasa tipo II 250 U/mL + DNAsa 33g/mL + dispasa 0.5 U/mL) y en ratón C57BL6 (colagenasa tipo II 250 U/mL + DNAsa 33g/mL). Estos resultados muestran que existen diferencias entre los protocolos para obtener cultivos de folículos tiroideos de cerdo, rata y ratón, a pesar de partir del mismo tejido y de ser organismos vertebrados y mamíferos. La disociación enzimática de la glándula varía en tiempos y concentraciones entre especies e incluso entre cepas, por lo cual se requiere hacer modificaciones sobre el protocolo base para cada especie o cepa que se desee trabajar. Para conocer en más detalle el modelo utilizado en este trabajo, se desarrollaron pruebas de viabilidad con el objeto de identificar cuando el cultivo, los folículos, estarían en buenas condiciones para el estudio funcional y a su vez conocer si los tratamientos a utilizar generaban algún efecto en la viabilidad de los folículos. Para el primer caso, la viabilidad se estudio con azul de Trypan, se encontró que no había problemas de viabilidad en los folículos y la mayoría de estos se encontraban cerrados ya que el lumen permanecía traslucido (Figura 18). Se observo que en el tiempo máximo de trabajo, es decir, hasta 72 horas después de terminar el cultivo, la viabilidad de los folículos se mantuvo (Figura 18 y 22). En cuanto a los tratamientos utilizados, las concentraciones de yoduro de sodio (1x10 -4 y 1x10-7 M) muestran que sin yoduro o con yoduro no hay cambios notables en la viabilidad de los folículos (Figura 19). Estos resultados corroboran los resultados obtenidos en otros trabajos de la línea de investigación con folículos cerrados de cerdo y rata donde 1x10-3 M de NaI durante 72 horas no disminuyeron la viabilidad celular del cultivo (Rivera J., et al., 2010). Estos resultados son contrarios a lo reportado en la mayoría de la literatura en donde se reporta una alta toxicidad a concentraciones altas de yoduro. Many en 1992 encontró a partir de imágenes de microscopia electrónica, vesiculación del RER y acumulación de lisosomas secundarios y definió que a la mayor concentración de yoduro, 1x10 -3 M, la necrosis aumentó de 4% a 9% (Many MC. et al., 1992). Este trabajo a pesar de haberse realizado con cultivo de folículos de humano, partió de un tejido con nódulos fríos y por la morfología presentada a nivel óptico, pareciese no contar con folículos cerrados ya que sólo muestra fragmentos de estos, lo cual puede llevar a comportamientos diferentes al normal. 38 Por otro lado, el grupo de Vitale trabajo con concentraciones altas de KI 50 mM y observaron en cultivo de TAD2, línea celular de tiroides de feto humano trasformada por SV40, que las células se despegaron a las 48 horas, hubo disminución de la expresión de Bcl2, proteína que suprime la apoptosis al prevenir la activación de caspasas, marcaje con anexina indicando perdida de la integridad del membrana por exponer grupos de fosfatilserina en la cara externa de la membrana y fragmentación de la cromatina, resultados que le sugerían que el proceso que estaba ocurriendo era apoptosis (Vitale M. et al., 2000). Es así como vemos que la literatura actual sobre citotoxicidad con concentraciones altas de yoduro no cuenta ni con tejido normal, ni con la unidad fundamental de la tiroides, el folículo en cultivo, razón por la cual pueden encontrarse variaciones en la respuesta celular de cada experimento. A diferencia de lo reportado en experimentos in vitro, los experimentos llevados a cabo por el grupo de Pitsiavias in vivo, encontraron que a concentraciones altas de NaI en rata Wistar y rata BB/W, 10 mg/Kg, no encontraron alteraciones en la ultraestructura después de ser expuestas por 15 semanas (Pitsiavias V., et al., 1997). Igualmente, se evalúo la viabilidad en presencia de amiodarona y se encontró que la viabilidad de algunos folículos se encontraba afectada cuando fueron expuestos a 25 µM de amiodarona, mientras que en las otras concentraciones, 1 y 10 µM, no hubo cambios (Figura 20). Para corroborar estos resultados, se realizo Anexina V y yoduro de propidio y se encontraron los mismos resultados, algunos folículos se encontraban completamente muertos, mientras otros eran completamente viables (Figura 23) cuando fueron expuestos a 25 µM de amiodarona. Este efecto además de depender de la concentración de amiodarona, no tuvo relación con la solución en la cual se preparo, el DMSO, no hubo alteraciones en la viabilidad de los folículos cultivados con este reactivo (Figura 21). En otros sistemas, se ha reportado 50 µM para tirocitos humanos disminuyendo el número de células en un 25% (Bedows SA., et al., 1989), en FRTL5, la línea celular más usada para estudios de tiroides, y en folículos de humano se observó lisis específica significativa por encima de 75 µM, aunque se observo lisis desde 37.5 µM (Chiovato L., et al., 1994). Estos trabajos no evaluaron específicamente la concentración de 25 µM ya que utilizaron un rango más amplio, evaluaron la concentración de 3.75, 7.5, 37.5 µM de amiodarona pero igualmente muestran cambios en la viabilidad celular a concentraciones superiores a la encontrada en este trabajo. Igualmente, se reporto que se disminuyen las microvellosidades al usar amiodarona entre 10-20 µM en folículos de humanos expuestos por 3 días a este medicamento (Nakajima K., et al., 2001). Lo cual coincide con lo reportado in vivo en donde la amiodarona a 30 mg/kg en ratas disminuyo las microvellosidades y presento alteraciones en RER y alteración de la conformación del folículo (Pitsiavias V., et al., 1997). Igualmente, el comportamiento entre los folículos y otro tipo de células como los macrófagos alveolares de pulmón presentaron una disminución en la viabilidad, estas células evaluadas con azul de Trypan y con liberación de lactato deshidrogenasa pierden viabilidad con valores superiores al 55% al ser expuestos a amiodarona en un rango 39 entre 20 y 50 µM (Quaglino D., et al., 2004, Bigler L., et al., 2007). Mostrando que a concentraciones superiores a 50 µM se observan cambios en la viabilidad, en los diferentes modelos de cultivos. Esto sugiere que el efecto en viabilidad es independiente del tipo de célula, está en un mismo rango de concentración y no tiene relación con la presencia de yoduro. Además, parece existir una relación con la naturaleza del compuesto, cuando los compuestos análogos a la amiodarona usados tenían un mayor coeficiente de partición, es decir, cuando la estructura presentaba características más hidrofóbicas, se encontró menos viabilidad en las células (Quaglino D., et al., 2004). A partir de los resultados obtenidos con la viabilidad, se decidió trabajar con la concentración de 10 ó 25 µM para evaluar el transporte de yoduro hacia el lumen del folículo tiroideo. Para ello se contemplaron 2 pasos: la entrada del yoduro al tirocito por medio de la captación de yoduro, y la salida del yoduro al lumen, evaluada por el consumo del peróxido de hidrógeno en el lumen en presencia del yoduro. Para el primer paso, captación de yoduro, inicialmente se consideró que no tendría cambios debido a lo reportado en la literatura en donde se señala que las modificaciones del transporte se darían después de la entrada del yoduro al folículo, ya que estudios en FRTL5 y monocapas de tiroides de cerdo sobre filtro utilizando yodo radioactivo no encontraron diferencias en la captación entre el control y las diferentes concentraciones de yoduro (Bogazzi F., 2006 y Tedelind S., et al., 2006). Así que se inició con la evaluación del consumo del peróxido de hidrógeno como un primer acercamiento para evaluar si existían modificaciones en el transporte de yoduro en la membrana apical del tirocito. A partir de la sonda CC-1, logramos evaluar la presencia de este peróxido junto con otras especies reactivas del oxígeno. Es así como observamos que la fluorescencia registrada en cada folículo varía, por lo cual encontraríamos a lo largo de los experimentos varianzas diferentes y por lo cual requeriría de análisis estadísticos no paramétricos para evaluar si existían diferencias o no en la cantidad de ROS (peróxido de hidrógeno, radicales peroxilo y anión superóxido) presentes en los lúmenes de los folículos entre los tratamientos. Igualmente, se observaron lúmenes con mayor fluorescencia, más ROS, lo que nos indica una mayor actividad del folículo (Figura 24). Para evaluar si el sistema nos permitiría evaluar lo propuesto se estudio si el sistema era sensible a condiciones externas controladas. Para ello, los folículos se evaluaron en presencia o ausencia de TSH y se encontró que en presencia de la hormona los niveles de ROS aumentaban siendo mayor los niveles en los lúmenes (Figura 25). Además, se descartó que la baja fluorescencia no se debiera a folículos en mal estado, es decir, que estuviesen abiertos y por lo tanto la producción de peróxido de hidrógeno estuviese alterada, esto se logro gracias a la observación en microscopio de luz en donde los lúmenes se veían traslucidos y en buenas condiciones. Con estos resultados se mostró un sistema sensible a condiciones externas en donde se encontró una diferencia significativa con un p < 0.01; α 0.05, entre los folículos con TSH versus los que no tenían la hormona y como reporta la literatura, la TSH activa por medio de su receptor varias cascadas de señalización que en últimas están logrando un aumento en la actividad del tirocito al activar varios factores de trascripción como se describe en el capítulo 1 y un aumento en la generación del peróxido al aumentar los niveles de calcio intracelular por la activación de la vía de señalización de la PLC. 40 Conociendo el sistema, se prosiguió a evaluar el comportamiento de los folículos al colocar yoduro de sodio en folículos incubados con amiodarona o en las condiciones control. Como se ve en la figura 27, se determinó un fenómeno muy importante, el trabajo muestra como los folículos control presentaron una disminución de ROS en el lumen a los 2 minutos de haber colocado el yoduro, comportamiento que es entendible y según lo que se conoce en la literatura era de esperar que el yoduro entra en los folículos y se dirige al lumen para sintetizar los precursores de las hormonas tiroideas (Van den Hove, MF. et al., 2006) consumiendo peróxido de hidrógeno para lograr unir el yodo a los residuos de tirosina de la tiroglobulina, fenómeno que por primera vez es posible describir en tiempo real en folículos de tiroides a través de un experimento con una sonda fluorescente en un tiempo de dos minutos después de colocado el yoduro. Este fenómeno no fue observado en los folículos incubados con amiodarona lo que lleva a pensar en varias opciones: la primera es si había una alteración en la captación de yoduro, fenómeno previamente descartado por lo reportado por Tedelind y Bogazzi en el 2006 o una alteración en la membrana apical que no permitiera la salida del yoduro del tirocito hacia el lumen a la misma velocidad que los folículos control. Para descartar la primera opción, se reconsideró en este trabajo evaluar la captación de yoduro en los folículos y se encontró que la captación estaba disminuida en los folículos a las 48 horas de incubación con el yoduro (Figura 28). Es así como lo reportado por Tedelind y Bogazzi no se observó en este modelo de folículos tiroideos de ratón, lo que sugiere que los fenómenos observados en modelos que no se acogen a la unidad funcional de un órgano, en este caso el folículo, pueden presentar resultados diferentes, lo que sugiere que para estudios al menos en tiroides, es ideal trabajar con folículos o in vivo. Este cambio en la captación de yoduro entonces se podía deber a una menor cantidad de proteína o a una localización que no permitiese la entrada de yoduro. Es así que la evaluación de la cantidad de proteína expresada no se contemplo en los experimentos llevados a cabo en este trabajo, en la literatura se encuentran varios reportes en donde se han estudiado las cantidades de NIS expresada en tiroides tanto con concentraciones de yoduro como con concentraciones de amiodarona. Para el primer caso, se muestra que las altas concentraciones de I disminuyen la expresión de NIS tanto en proteína como mRNA (Eng PH., et al., 1999, Spitzweg C., et al., 1999, Susuki K & Kohn LD, 2006, Arriagada AA., et al., 2010, SerranoNascimiento C., et al., 2010, Wang K., et al., 2010), tiene menor estabilidad el trascrito (Serrano-Nascimiento C., et al., 2010) y por lo tanto la captación de yoduro disminuye (Ferreira AC., et al., 2005 y Arriagada AA., et al., 2010). En el caso de la amiodarona se muestra una menor expresión del trascrito de NIS desde 1 µM AMI y un efecto dosis dependiente (Tedelind S., et al., 2006, Yamazaki J. et al., 2007). Así que se consideró evaluar la localización de la proteína en los folículos incubados tanto a altas concentraciones de I como con amiodarona. Como se ve en las figuras 30, 31 y 32 indistinto de la concentración de amiodarona o de la presencia de I, la localización de la proteína NIS se encuentra intracelular, diferenciándose de los controles en tejido (Figura 29) o en cultivo (Figura 30 y 31) en donde la proteína se expresa baso lateralmente. Estos resultados son interesantes ya que por primera vez en un estudio en tiroides se muestra que por las altas concentraciones de yoduro y 41 concentraciones de amiodarona se genera un cambio en la localización de NIS, resultados que fueron expuestos parcialmente en el Congreso Internacional de Tiroides ITC 2010 (Bernal E., et al., 2010). Este resultado junto con lo reportado en la literatura soporta el hecho de la disminución en la captación de yoduro en los folículos expuestos a amiodarona, dando evidencias que soporten lo observado con el sistema de detección de ROS en donde no hubo disminución de ROS en el lumen de los folículos con amiodarona. Sin embargo, faltaría evaluar si hay una alteración en la membrana apical que no permita la salida del yoduro del tirocito hacia el lumen a la misma velocidad que los folículos control contribuyendo al fenómeno observado. Es así como este trabajo muestra que hay similitudes entre lo encontrado con la exposición con la amiodarona y con concentraciones altas de I en lo que respecta a la localización y cambio de la proteína NIS pasando de una localización basolateral a una intracelular, fenómeno que se puede asociar claramente con el efecto Wolff-Chaikoff. Por el contrario, se encontraron diferencias en la viabilidad ya que haciendo una relación, 25 µM de amiodarona, equivalente a 9,25 µM de yodo, empieza a mostrar efectos en la viabilidad de los folículos mientras a concentraciones de 0.1mM de yoduro no se muestra ningún efecto en la viabilidad de los folículos siendo la amiodarona más tóxica para los folículos y no el I. Asimismo, se encontraron resultados adicionales con el sistema redox, se observó que al colocar los folículos en una concentración alta de yoduro de sodio no hubo un incremento en los niveles de ROS en las células, hecho que contradice lo mencionado por varios autores. En el trabajo de Poncin se trabaja in vivo, a mayor tiempo, 20-28 días y en rata Wistar, modelo en donde muestra que a una dosis diaria de 100µg/rata de NaI aumenta la expresión de 4HNE, indicando mayor estrés oxidativo y a la vez incremento de PRDX5, enzima antioxidante (Poncin S. et al., 2008). En FRTL a dosis de 1x10 -4 M de KI por 24 horas muestra un incremento en la fluorescencia con el sistema MitoSOX Red y una disminución del potencial de membrana de la mitocondria (Li LY., et al., 2010). En células PCCl3, línea celular de tiroides, aumenta la producción de ROS iniciando a las 24 horas y con un pico a las 48 horas cuando fueron expuestas a concentraciones de 1x10 -3 M de I y se observa un incremento de proteínas antioxidantes como selenoproteinas, tioredoxinas reductasas y GPXs (Leoni SG., et al., 2010). Según estos reportes, el no aumento de ROS en los folículos puede ser debido al tiempo de exposición a las altas dosis de I, ya que estos estuvieron no por más de una hora en exposición, es así como debe evaluarse este efecto incubando las células en un mayor tiempo para descartar que esta sea la causa del no incremento de ROS. Sin embargo, reportes in vivo mencionan que las altas dosis de yoduro no muestran alteraciones en la ultraestructura (Pitsiavias V., et al., 1997) y resulta más tolerante para las células estas altas dosis que deficiencias de este ión (Lin LX., et al., 2010) seguramente debido a que la célula cuentan con muchos mecanismos de control del estrés oxidativo como una serie de proteínas antioxidantes que como se menciona en la literatura, incrementan su expresión. 42 De la misma forma, este sistema redox mostró que los folículos expuestos a amiodarona tienen una disminución en la cantidad de ROS presentes tanto en el lumen como en los tirocitos (Figura 26) encontrando diferencias significativas con un p < 0.01; α 0.05. Esto lo podemos contemplar desde la óptica de la célula y desde el sistema de producción del peróxido de hidrógeno en la membrana apical que da hacia el lumen encerrado y limitado por los tirocitos. En el caso de la célula, el tirocito, la disminución en ROS, nos lleva directamente a pensar en la mitocondria, organelo con la mayor generación de radicales libres al tener la cadena transportadora de electrones, (Curtin JF, 2002) ¿hay algún fenómeno descrito en este organelo que pudiese afectar la generación de ROS? en la literatura se encuentra que la amiodarona ha reportado una disminución en el potencial de membrana de la mitocondria en macrófagos alveolares de hámster con una concentración de 100 mM inhibiendo el complejo I y II (Bolt MW., et al., 2001), esto podría extrapolarse a este sistema y especular que hay alguna modificación en la mitocondria que genera esa disminución en ROS. O por otro lado, que los co-factores necesarios para la generación de peróxido estén alterados por cambios en las membranas. Para el caso del lumen, el sistema de generación del mayor ROS, el peróxido de hidrogeno, son las proteínas DUOX o Thox, ubicadas en la membrana apical de los tirocitos las cuales son oxidoreductasas dependientes de NADPH, duox1 y duox2 (Milenkovic M., et al., 2007). Como se vio en la (figura 26) hay una reducción en la cantidad de ROS presentes en el lumen en folículos expuestos a amiodarona, se puede ver que hay actividad parcial ya que los valores superan los valores obtenidos con los folículos sin TSH pero son valores menores a los obtenidos con el control que tiene TSH y por otro lado, presenta un comportamiento diferente al resto de lúmenes evaluados porque hay una disminución más grande en el tiempo pasando en 15 minutos de 123 a 85 lo que sugiere un menor recambio de ROS en el tiempo. Estos cambios sugieren alteraciones en la membrana, al igual que lo observado en la célula que sugiere cambios a nivel mitocondrial, hay alteraciones estructurales de las proteínas transmembranales? esto genera disminución en la producción de peróxido? o son cambios provenientes de alteraciones en vías de señalización? que disminuyen cofactores; como es el caso de las duox que por los motivos EF son dependientes de calcio, este aumenta sus niveles intracelularmente cuando la proteína Gq activa la vía de señalización de la PLC en donde el IP3 soluble, difunde a través del citoplasma e interactúa con receptores específicos IP3 del retículo endoplásmico, causando la liberación de calcio, elevando así las concentraciones de calcio intracelular (Song .,Y et al., 2010) las cuales repercutirán en la actividad de la enzima. Todas estas preguntas aún quedan por contestar para entender el comportamiento de la reducción en la cantidad de ROS en el lumen de los folículos. Por lo tanto, la amiodarona mostro efectos en varios sistemas que están directamente relacionados con las membranas: reducción de ROS en las células que como se menciono anteriormente puede relacionarse indirectamente con alteraciones en la mitocondria, reducción de ROS en el lumen, y cambio en la localización de la proteína NIS que se relaciona directamente con una disminución en la captación de yoduro. Estos resultados llevan a contemplar que el efecto de la amiodarona en la tiroides está dado por el alto coeficiente de partición que tiene la molécula y que favorece una interacción con la membrana como se demostró con membranas de 43 dipalmitoilfosfatidilcolina en donde la amiodarona generó una densidad de electrones adicional aumentando el área a 6 Å en la región terminal metilo de la bicapa lo que contribuye a una disminución de la fluidez de membrana (Trumbore M., et al., 1988). Asimismo, se demostró por medio de microarreglos que aumentaban los niveles de genes involucrados en reparación de membrana (Yamasaki K., et al., 2007) y en otro tipo de células se encontraron efectos de fosfolipidosis: a cumulación excesiva de fosfolípidos en células, inclusiones lamelares de membrana principalmente de origen lisosomal y aumento de los fosfolípidos lo que conlleva a una alteración en la membrana (Reasor M.J., et al., 1996, Sirajudeen K.N., et al., 2002, Baronas ET., et al., 2007, Fujimura H., et al., 2007). Al alterar la membrana, afecta todo el metabolismo del folículo ya que la gran mayoría de elementos indispensables para la producción de hormonas, principal función de la tiroides, depende de proteínas transmembranales (RTSH, NIS, TPO, DUOXs, PDS, AIT, Na+/K+ ATPasa) y si estás tienen cambios inmediatamente la producción de hormonas cambia. Es así que se abre la perspectiva de estudiar el efecto de la amiodarona en algunas de las proteínas presentes en la membrana apical TPO, PDS, AIT y saber si esta molécula genera igualmente modificaciones como las reportadas en este trabajo en donde NIS cambio su localización y DUOXs disminuyó la producción de peróxido de hidrógeno. Asimismo, en tiroides se ha reportado una disminución de los niveles de cAMP cuando las células de FRTL5 fueron incubadas a concentraciones mayores a 50 µM de amiodarona y si la incubación se hacía con 3 horas antes, la disminución de cAMP incrementaba, esto también podría representar cambios en el receptor de la TSH? (Pitsiavas V., et al, 1999). Por otro lado, los efectos observados en el tejido cardiaco dan más argumentos que soportan la alteración en la membrana, se disminuye la frecuencia cardiaca ya que prolonga el AP y por ende el período refractario demorando la repolarización (Bosch R.F et al., 1999, Celestino D et al., 2007 y Salgado H.C., et al., 2007) esto se debe a disminución de la corriente de Ca, ICa L (Hancox JC, 1997) y disminución de Ikr a corto plazo y de IKs a largo plazo (Kamiya K., et al., 2001) lo que hace a esta molécula un medicamento ideal para pacientes con arritmias. Finalmente, a pesar de los fenómenos observados a lo largo de este trabajo y las relaciones y especulaciones realizadas, el porcentaje de pacientes que presentan AIT o AIH no supera el 30%, lo que sugiere que la mayoría de pacientes que toman este medicamento cuentan con una maquinaria de reparación que permite recobrar los daños generados en la membrana por este medicamento y por otro lado, tener un escape al efecto Wolff-Chaikoff dado por el aumento de yoduro en la sangre. Aquellos, que no responden a estos dos fenómenos son aquellos pacientes que presentan o ya sea hipotiroidismo o hipertiroidismo inducido por amiodarona y por eso la prevención del uso de este medicamento en personas con antecedentes de enfermedades tiroideas es ideal y por ende la recomendación de otro tipo de anti-arrítmicos en estos pacientes es benéfica en pro de no inducir alguna de estas patologías en la tiroides. 44 5. Conclusiones El protocolo para obtener folículos de tiroides de ratón muestra diferencias en una misma especie con modificaciones entre la cepa ICR y la C57BL6. El cultivo es viable al tiempo máximo de estudio 72 horas de terminado el cultivo y ni las concentraciones altas de yoduro, ni el DMSO o las concentraciones bajas de amiodarona alteraron la viabilidad celular, solamente la concentración a 25 µM afecta la viabilidad celular de algunos folículos. Los folículos se encuentran en estados funcionales diferentes. Hay diferencias en la viabilidad de los folículos entre los efectos del yoduro con los de la molécula de amiodarona, ya que haciendo una relación, 25 µM de amiodarona, equivalente a 9,25 µM de yodo, empieza a mostrar efectos en la viabilidad de los folículos mientras a concentraciones de 1mM de yoduro no se muestra ningún efecto en la viabilidad de los folículos cultivados 48 horas. En los folículos expuestos a amiodarona se presento: Una disminución en ROS tanto en los tirocitos como en los lúmenes aunque su actividad es mayor que en folículos sin TSH. Disminución de la captación de yoduro en folículos Cambio en la localización de NIS pasando de un ubicación más baso lateral a uno más intracelular Diferencias con lo reportado en captación de yoduro en tiroides con otros modelos no tridimensionales. Los folículos en condiciones control (TSH 0.1 mU/ml, NaI 1x10-10 M) presentaron una disminución significativa de ROS en el lumen a los 2 minutos de haber colocado el yoduro. Se encontró una localización intracelular de NIS entre las altas concentraciones de yoduro y la amiodarona presentando diferencias con respecto a los controles en donde la proteína se encontró baso lateral. Los efectos de la amiodarona en folículos de tiroides parecen entonces tener dos grandes componentes, uno el yoduro, que como lo sugería la literatura se relaciona con el efecto Wolff-Chaikoff y el otro componente es la naturaleza del compuesto, en donde el coeficiente de partición parece jugar un papel notorio en los efectos generados en las membranas de la célula. 45 6. Perspectivas Estudiar el efecto de la amiodarona en algunas de las proteínas presentes en la membrana apical del tirocito TPO, PDS, SLC5A8. Para ello estudiar el efecto en la organificación, expresión y localización de estas proteínas. Evaluar el efecto de altas dosis de yoduro en cultivos expuestos entre 24 y 72 horas para conocer si hay o no aumento de ROS en este modelo. Evaluar análogos de la amiodarona que posean características similares, coeficientes de partición altos y moléculas con estructura molecular similar que no tengan presente el yoduro como dronedarona. Estudiar los mecanismos que permiten al yodo regular la expresión de genes y proteínas. Estudiar más fenómenos descritos en la literatura en líneas celulares o en monocapas sobre filtros para comparar los resultados con estructuras tridimensionales. Estudiar los canales que muestran cambios en cardiomiocitos y que de igual manera se expresan en tiroides como el canal Kir 7.1 que da una corriente de potasio. Estudiar si hay cambios en vías de señalización involucradas con la expresión de proteínas que intervienen en la producción de hormonas tiroideas. 46 7. Bibliografía Arriagada,A.A., Albornoz,E., Bueno,S. & Carrasco,N. Na+/I- symporter (NIS) expression and localization during rapid transport inhibition by iodide excess. En: 14th International Thyroid Congress, Paris, Francia (2010). Baronas,E.T., Lee,J.W., Alden,C. & Hsieh,F.Y. Biomarkers to monitor drug-induced phospholipidosis. Toxicol. Appl. Pharmacol 218, 72-78 (2007). Beckett,G.J., Arthur,J.R. Selenium and endocrine systems. 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Management of cardiac Arrhytmias: Pharmacological, Electrical, and Surgical Techniques.Heart Disease A textbook of cardiovascular medicine Tomo II. 4th ed. United States of America: W. B. Saunders Company 647 (1992). 54 Anexo 1 Objetivos OBJETIVO GENERAL Evaluar los efectos de la amiodarona sobre el transporte de yoduro hacía el lumen y las proteínas involucradas en este proceso en folículos tiroideos de ratón in vitro. OBJETIVOS ESPECIFICOS • Determinar el transporte del yoduro hacía el lumen de folículos tiroideos expuestos a amiodarona. • Encontrar evidencias sobre la dependencia del yoduro en los efectos observados en los folículos tiroideos cuando son expuestos a amiodarona. • Establecer la expresión y localización de las proteínas involucradas en el transporte de yoduro hacia el lumen de los folículos tiroideos expuestos a amiodarona. 55 Anexo 2. Resumen general Objetivo Evaluar los efectos de la amiodarona sobre el transporte de yoduro hacía el lumen y las proteínas involucradas en este proceso en folículos tiroideos de ratón in vitro. Métodos Resultados - Estandarización del cultivo de folículos tiroideos en la cepa de ratón ICR: uso de colagenasa 250 U/ml, Cultivo de folículos dispasa 0.5 U/ml y DNAsa 33 µg/ml. de tiroides - Estandarización del cultivo de folículos tiroideos en la cepa de ratón C57BL6: uso de colagenasa 250 U/ml y DNAsa 33 µg/ml. Los folículos incubados con las condiciones control (TSH 0,1 mU/ml + NaI 1x10-10M), con NaI (1x10-10M, 1x10-7M, 1x10-4M), con DMSO 0,5% y con Amiodarona (1 y 10 µM) por 48 horas no Viabilidad presentaron coloración azul en el lumen y en poca - Azul de Trypan proporción algunas células teñidas. Los folículos incubados con amiodarona 25 µM por 48 horas presentaron algunas células teñidas y algunos folículos con coloración azul. - Algunos folículos incubados con amiodarona 25 µM 48 horas presentaron marcaje con yoduro de propidio. - Anexina V con Yoduro de propidio Determinar el transporte del Sistema redox Medición de Conclusión Se obtienen folículos de tiroides de la cepa ICR y de la cepa C57BL6 por medio de protocolos ligeramente diferentes. - Los folículos incubados con las condiciones control (TSH 0,1 mU/ml + NaI 1x10-10M), con NaI (1x10-10M, 1x10-7M, 1x10-4M), con DMSO 0,5% y con Amiodarona (1 y 10 µM) son viables. - Los folículos incubados con amiodarona 25 µM presentaron una disminución en la viabilidad. -Los folículos incubados con amiodarona 25 µM por 48 horas presentaron una disminución en la viabilidad, algunos folículos - Los folículos incubados con las otras concentraciones presentaron necrosis. de amiodarona (1, 10 µM) por 48 horas presentaron Las células endoteliales marcaje de anexina v en las células endoteliales y presentaron apoptosis y algunos algunos tirocitos marcaje con yoduro de propidio. tirocitos muerte celular. - El sistema muestra diferencias en la cantidad de - El sistema es sensible a unidades arbitrarias de fluorescencia en los condiciones externas controladas. 56 yoduro hacía el lumen de folículos tiroideos expuestos a amiodarona. Encontrar evidencias sobre la dependencia del yoduro en los efectos observados en los folículos tiroideos cuando son expuestos a amiodarona. Establecer la especies ROS por medio de una sonda fluorescente Red CC-1 en presencia de NaI 1x10-4 M Captación de yoduro - I125 - Fenol/ cloroformo/alcohol isoamilico Viabilidad: - Azul de Trypan - Anexina V con Yoduro de propidio folículos incubados con o sin TSH. - Las unidades arbitrarias de fluorescencia en los lúmenes de los folículos control disminuyen a los 2 minutos de estar en contacto con NaI. - Las unidades arbitrarias de fluorescencia del lumen en los folículos con amiodarona están en concordancia con lo esperado de la caída de la sonda fluorescente en el tiempo. - Los folículos en condiciones control captaron en 48 horas 27.75 pg de yodo/mg/ml de proteína total. - Los folículos en amiodarona 25 µM captaron en 48 horas 1.65 pg de yodo/mg/ml de proteína total. - Los folículos incubados con NaI (1x10-10M, 1x10-7 M, 1x10-4M), y con Amiodarona (1 y 10 µM) por 48 horas no presentaron coloración azul en el lumen y en poca proporción algunas células teñidas, mientras la concentración de 25 µM de amiodarona si presento folículos teñidos. Expresión de la proteína NIS Inmunocitoquímica - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con amiodarona (10, 25 µM) es intracelular. - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con NaI (1x10-4M) es intracelular. - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con las condiciones control es basolateral. Expresión de la - La localización de la proteína NIS en los ratones es - Disminución de ROS en los lúmenes de los folículos control a los 2 minutos de estar en contacto con NaI. - Ningún cambio de ROS en los lúmenes de los folículos con amiodarona. Hay una disminución en la captación de yodo en los folículos incubados 48 horas a la concentración de 25 µM. - 25 µM de amiodarona, equivalente a 9,25 µM de yodo, empieza a mostrar efectos en la viabilidad de los folículos mientras a concentraciones de 1x10-4M de yoduro no se muestra ningún efecto en la viabilidad de los folículos. La localización de NIS cambia tanto a altas dosis de yoduro como a diferentes concentraciones de amiodarona siendo esta más intracelular. - La localización de la proteína NIS 57 expresión y localización de las proteínas involucradas en el transporte de yoduro hacia el lumen de los folículos tiroideos expuestos a amiodarona. proteína NIS Inmunohistoquímic a Inmunocitoquímica baso lateralmente. - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con amiodarona (10, 25 µM) es intracelular. - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con NaI (1x10-4M) es intracelular. - La localización de la proteína NIS en los folículos incubados por 48 horas con las condiciones control es basolateral. - - Resultados adicionales Sistema redox en tirocitos y lumen sin transporte de yoduro - - - Los tirocitos de los folículos incubados sin TSH tienen alrededor de 60 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los tirocitos de los folículos incubados con TSH tienen alrededor de 140 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los lúmenes de los folículos incubados sin TSH tienen alrededor de 69 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los lúmenes de los folículos incubados con TSH tienen alrededor de 206 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los tirocitos de los folículos incubados con TSH y amiodarona tienen alrededor de 50 unidades arbitrarias de fluorescencia. Los lúmenes de los folículos incubados con TSH y amiodarona tienen alrededor de 100 unidades arbitrarias de fluorescencia. Cambiando de 123 a 85 en 15 minutos. en los folículos incubados por 48 horas en condiciones control es baso lateralmente como se observo en los ratones. - La localización de NIS cambia tanto a altas dosis de yoduro como a diferentes concentraciones de amiodarona siendo esta más intracelular. - Los folículos sin estimulo de la hormona TSH tienen niveles de ROS más pequeños que los folículos que han sido estimulados con la hormona. - Cuando los folículos son estimulados con TSH los niveles de ROS son mayores en el lumen. - La concentración de ROS en folículos sin TSH es similar entre las células, los tirocitos, y el lumen. - Los folículos incubados con amiodarona presentan un descenso en la producción de ROS.
