polipeptidos capaces de inducir una reaccion inmunologica

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
C12N 9/12 (2006.01)
A61K 38/47 (2006.01)
C07K 16/40 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 280 311
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 01272392 .0
86
Fecha de presentación : 18.12.2001
87 Número de publicación de la solicitud: 1352056
87 Fecha de publicación de la solicitud: 15.10.2003
54 Título: Polipéptidos capaces de inducir una reacción inmunológica contra el cáncer.
30 Prioridad: 22.12.2000 GB 0031430
73 Titular/es: GemVax AS.
Hoffsveien 70
0377 Oslo, NO
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.09.2007
72 Inventor/es: Gaudernack, Gustav;
Saeboe-Larssen, Stein;
Moller, Mona y
Eriksen, Jon, Amund
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Elzaburu Márquez, Alberto
ES 2 280 311 T3
16.09.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Polipéptidos capaces de inducir una reacción inmunológica contra el cáncer.
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La presente invención se refiere a los polipéptidos y a los ácidos nucleicos ADN que codifican estos polipéptidos, capaces de inducir una reacción inmunológica contra el cáncer, a los métodos para generar linfocitos T capaces
de reconocer y destruir las células tumorales, y a las composiciones farmacéuticas para el tratamiento, profilaxis o
diagnóstico del cáncer.
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El cáncer se desarrolla mediante un proceso de múltiples pasos que incluye varios acontecimientos de mutación.
Dichas mutaciones resultan en una expresión/función alterada de genes que pertenecen a dos categorías: los oncogenes
y los genes de supresión tumoral. Los oncogenes aparecen en la naturaleza como derivados de los protooncogenes
después de mutaciones o transiocaciones puntuales, que dan lugar a una célula en estado transformado que alberga la
mutación. Los oncogenes codifican una proteína y funcionan a través de ella. Los protooncogenes son genes normales
de la célula que tienen el potencial de convertirse en oncogenes. En la mayoría de los casos, se ha demostrado que
los protooncogenes pertenecen a vías de transducción de señales. Los oncogenes actúan de forma dominante. Por otro
lado, los genes de supresión tumoral actúan de forma recesiva, es decir, a través de la pérdida de función, y contribuyen
a la oncogénesis cuando se han modificado ambos alelos que codifican la proteína funcional para producir productos
génicos no funcionales.
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En el campo de la inmunología humana contra el cáncer, en las dos últimas décadas se ha invertido mucho esfuerzo
en caracterizar los antígenos genuinamente específicos del cáncer. Concretamente, se ha dirigido este esfuerzo hacía
el análisis de los anticuerpos a antígenos de tumores humanos. El estado de la técnica indica que pueden usarse
dichos anticuerpos con fines diagnósticos o terapéuticos, por ejemplo, en conexión con un agente contra el cáncer. Sin
embargo, los anticuerpos sólo pueden unirse a antígenos tumorales que estén expuestos en la superficie de las células
tumorales. Por esta razón, el esfuerzo para producir un tratamiento del cáncer que se base en el sistema inmune del
cuerpo no ha tenido tanto éxito como era de esperar.
Una característica fundamental del sistema inmune es que puede distinguir entre moléculas propias y no propias
y que normalmente no reacciona contra moléculas suyas. Se ha demostrado que el rechazo de tejidos u órganos
trasplantados de otros individuos es una respuesta inmunológica a los xenoantígenos en la superficie de las células
trasplantadas. La respuesta inmunológica comprende una respuesta humoral, mediada por anticuerpos, y una respuesta
celular. Los anticuerpos son producidos y secretados por los linfocitos B, y típicamente reconocen antígenos libres en
su conformación nativa. Por lo tanto, potencialmente pueden reconocer casi cualquier sitio expuesto en la superficie del
antígeno. A diferencia de los anticuerpos, las células T, que median en la parte celular de la respuesta inmunológica,
reconocen los antígenos sólo en el contexto de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (CPH), y
sólo después de un procesamiento adecuado de los antígenos. El procesamiento de los antígenos normalmente consiste
en la fragmentación proteolítica de la proteína, que resulta en los polipéptidos que encajan en la ranura de las moléculas
del CPH. Esto permite que las células T también reconozcan los polipéptidos derivados de los fragmentos/antígenos
intracelulares de las proteínas.
Las células T pueden reconocer polipéptidos aberrantes derivados de cualquier sitio de la célula tumoral, en el
contexto de las moléculas del CPH en la superficie de la célula tumoral. Después, las células T pueden activarse
para eliminar la célula tumoral que albergue el polipéptido aberrante. En modelos experimentales que involucran
tumores murinos, se ha demostrado que las mutaciones puntuales en las proteínas suyas intracelulares pueden dar
lugar a antígenos de rechazo del tumor, que consisten en polipéptidos que difieren del polipéptido normal en un solo
aminoácido. Las células T que reconocen estos polipéptidos en el contexto de las moléculas de CPH en la superficie
de las células tumorales son capaces de matar a las células tumorales, eliminando así el tumor del huésped (Boon et
al., 1989, Cell 58: 293-303).
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Las moléculas de CPH en humanos normalmente se denominan moléculas de ALH (antígeno al leucocito humano).
Hay dos clases principales de moléculas de ALH: la clase I y la clase II. Las moléculas de ALH de clase I son
codificadas por los sublocus de ALH A, B y C y esencialmente activan las células T CD8+ citotóxicas. Por otro lado,
las moléculas de ALH de clase II activan esencialmente CD4+ (citotóxicas o cooperadores) y son codificadas por los
sublocus de ALH DR, DB y DQ. Normalmente, cada individuo tiene seis moléculas diferentes de ALH de clase I,
generalmente dos alelos de cada uno de los tres subgrupos A, B y C, aunque en algunos casos, el número de moléculas
diferentes de ALH de clase I se reduce debido a que el mismo alelo de ALH se produce dos veces. Para una revisión
general, véase Roitt, I.M. et al., (1998) Immunology, 5ª edicion, Mosby, Londres.
Los productos génicos de ALH son altamente polimorfos. Diferentes individuos expresan distintas moléculas de
ALH que son diferentes a las que se encuentran en otros individuos. Esto explica las dificultades para encontrar
donantes de órganos compatibles en cuanto a los ALH para trasplantes. La importancia de la variación genética de las
moléculas de ALH en la inmunobiología está en el papel que juegan como genes de respuesta inmunológica. A través
de su capacidad para unir polipéptidos, la presencia o ausencia de ciertas moléculas de ALH determina la capacidad de
un individuo para responder a epitopos específicos de polipéptidos. En consecuencia, las moléculas de ALH influyen
en la resistencia o susceptibilidad a las enfermedades.
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Las células T pueden inhibir el desarrollo y crecimiento del cáncer a través de una variedad de mecanismos.
Las células T citotóxicas, tanto CD8+ restringido de ALH de clase I como CD4+ restringido de ALH de clase II,
pueden matar directamente las células tumorales que presentan los antígenos tumorales apropiados. Normalmente, se
necesitan las células T CD4+ cooperadoras para respuestas de las células T CD8+ citotóxicas, pero si el antígeno del
polipéptido es presentado por una CPA indicada, las células T CD8+ citotóxicas pueden activarse directamente, lo que
resulta en una respuesta más rápida, fuerte y eficaz.
En la solicitud internacional PCT/N092/00032 (publicada como WO92/14756), se describen polipéptidos y fragmentos de productos proteicos de oncogenes que tienen una mutación o translocación puntual comparados con su
protooncogen o proteína génica de supresión tumoral. Dichos polipéptidos corresponden a, cubren completamente, o
son fragmentos del fragmento proteico del oncogen procesado o del fragmento del gen de supresión tumoral tal como
son presentados por las células cancerosas u otras células presentadoras de antígenos, y se presentan como un complejo ALH-polipéptido por al menos un alelo en cada individuo. Se demostró que los polipéptidos inducen respuestas
específicas de las células T al actual fragmento proteico del oncogen producido por la célula mediante el procesamiento y presentado en la molécula ALH. En concreto, se describen en WO92/14756 los polipéptidos derivados de la
proteína p21-ras que tenían mutaciones puntuales en posiciones específicas de aminoácido, es decir, las posiciones 12,
13 y 61. Se ha demostrado que estos polipéptidos son efectivos en la regulación del crecimiento de células cancerosas
in vitro. Además, se demostró que los polipéptidos inducen la inmunidad de las células T CD4+ contra las células
cancerosas que alberguen la proteína mutada p21-ras del oncogen mediante la administración de dichos polipéptidos
en programas de vacunación o terapia contra el cáncer. Se ha demostrado después que estos polipéptidos también inducen la inmunidad de las células T CD8+ contra las células cancerosas que alberguen la proteína p21 ras del oncogen
mediante la administración descrita más arriba (Gjertsen, M.K., et al., 1997, Int. J. Cancer 72: 784-790).
La solicitud internacional PCT/NO99/00143 (publicada como WO99/58552) describe polipéptidos sintéticos y
fragmentos de productos proteicos mutantes que resultan de mutaciones del corrimiento del marco de lectura que
ocurren en los genes de células cancerosas. Estos polipéptidos corresponden a, cubren completamente o son fragmentos del fragmento proteico procesado de la mutación del corrimiento del marco de lectura tal como es presentado por
células cancerosas u otras células presentadoras de antígenos, y se presentan como un complejo ALH-polipéptido en
al menos un alelo en cada individuo. Específicamente, se describen los polipéptidos que resultan de mutaciones del
corrimiento del marco de lectura en los genes BAX y hTGFβ-II. Se ha demostrado que dichos polipéptidos estimulan
de forma eficaz y específica las células CD4+ y CD8+.
Sin embargo, los polipéptidos descritos anteriormente serán útiles sólo en un determinado número de cánceres que
involucran oncogenes con mutaciones puntuales, mutaciones del corrimiento del marco de lectura o translocación en
un protooncogen o un gen de supresión tumoral. Existe gran necesidad de disponer de un tratamiento de cáncer o de
una vacuna que sea eficaz contra una gama genérica de cánceres.
La acción concertada de una combinación de oncogenes y genes de supresión tumoral alterados resulta en una
transformación celular y el desarrollo de un fenotipo maligno. Sin embargo, dichas células son susceptibles a la
senescencia y tienen una vida corta. En la mayoría de los cánceres, la inmortalización de las líneas de células tumorales
requiere que se encienda un complejo enzimático que se llama la telomerasa. En células somáticas, normalmente
no se expresa la subunidad catalítica de la holoenzima de telomerasa, TITEh (la retrotrascriptasa de la telomerasa
humana). Acontecimientos adicionales, tales como la acción de las proteínas codificadas por un virus tumoral o la
desmetilización de sitios promotores callados (metilados), pueden resultar en la expresión de genes que codifican los
componentes del complejo funcional de telomerasa en células tumorales.
Debido a la presencia de telomerasa en la mayoría de los tipos de células cancerosas, se ha descrito la enzima como una candidata para ser una vacuna general contra el cáncer (Solicitud internacional de patente número
PCT/NO99/002200, publicada como WO00/02581). La patente WO00/02581 describe un método para prevenir o tratar un cáncer generando una respuesta de las células T contra las células que expresan telomerasa en un mamífero
que padece (o es probable que padezca) cáncer. Se ha demostrado en la patente W000/02581 que las células tanto
CD4+ como CD8+ pueden estimularse administrando polipéptidos que tienen secuencias derivadas de tal proteína
de telomerasa. Vanderheide et al. (Immunity, 10, 673-679, Junio 1999) informan de que la subunidad catalítica de la
telomerasa es un antígeno asociado al tumor reconocido por los linfocitos T citotóxicos.
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Se ha informado de las variantes alternativas de corte y empalme del pre-ARNm de telomerasa en la bibliografía
(Kilian, A., et al., 1997, Hum. Mol. Genet. 6: 2011-2019). Kilian et al. (1997, supra) indicó que era significativo
que varias variantes de corte y empalme se encontraron con el dominio crítico de RT (retrotrascriptasa) de TITEh.
Indicaron, sin embargo, que no se llegó a una comprensión completa del significado de las variantes de corte y empalme
de TITEh y que se precisaba una adicional caracterización funcional.
El análisis de la secuencia genómica completa del gen de TITEh ha verificado que las diferentes variantes de corte
y empalme del ARNm se producen como consecuencia de la utilización de sitios alternativos de corte y empalme en el
pre-ARNm de TITEh (Wick, M, et al., 1999, Gene 232: 97-106). Comparado con el ARNm completo de TITEh, se han
detectado al menos cinco variantes adicionales de corte y empalme. Una representación esquemática de estas variantes
se presenta en la fig. 1, y la fig. 2 representa una alineación de las proteínas codificadas. Dos de las variantes de corte
y empalme, denominadas α-del (o DEL1) y β-del (o DEL2), representan eliminaciones de secuencias codificadoras
específicas. En la variante α-del, se han suprimido los primeros 36 nucleótidos del exón 6 y la variante codifica una
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proteína a la que le falta una cadena de 12 aminoácidos internos. A la variante β-del, le faltan 182 nucleótidos que
representan los exones 7 y 8 enteros, dando lugar a un corrimiento del marco de lectura abierto y una proteína truncada
con un terminal carboxilo de 44 aminoácidos que no están presentes en la proteína TITEh completa. Las otras variantes
de corte y empalme resultan de la inserción de secuencias de intrones en el marco de lectura abierto y la terminación
prematura de traducción. La variante del inserto-σ (o INS1) resulta de la inserción de los primeros 38 nucleótidos
del intrón 4. El inserto-σ no contiene un codón de terminación, pero el marco de. lectura abierto extiende unos 22
nucleótidos en la secuencia normal con un marco de lectura alternativa. La variante del inserto-γ (o INS3) se produce
después de la inserción de los últimos 159 nucleótidos del intrón 14. El lns-4 contiene los primeros 600 nucleótidos
del intrón 14, mientras que, a la vez, tiene suprimido el exón 15 y la mayor parte del exón 16. Las proteínas truncadas
que resultan de la traducción de estas variantes de corte y empalme se presentan en la fig. 2.
Numerosos estudios recientes han investigado la regulación de la actividad de la telomerasa, y algunos han investigado la correlación existente entre la trascripción del ARNm de TITEh y la actividad de la telomerasa en varias líneas
de células y tejidos (Nakamura, T.M., et al., 1997, Science 277: 955-959; Meyerson, M, et al., 1997, Int. J. Cancer 85:
330-335; Nakayama J, et al., 1998, Nature Genet. 18: 65-68; Liu, K, et al., 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA 96: 51475152). Otros estudios han demostrado que la regulación de la actividad de la telomerasa se aumenta a través de la
fosforilación de la proteína TITEh por la proteína quinasa Cα y se reduce en la presencia de inhibidores de la proteína
quinasa C y la fosfatasa 2A (Li, H, et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 16729-16732; Li, H. et al., 1998, J. Biol. Chem.
273: 33436-33442; Bodnar, A.G. et al., 1996, Exp. Cell Res. 228: 58-64; Ku, W.C. et al., 1997, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 241: 730-736). El corte y empalme alternativo del pre-ARN de TITEh representa un mecanismo adicional
para la regulación de la actividad de telomerasa, y se ha demostrado que medía la reducción de actividad durante el
desarrollo fetal del riñón y en el tejido adulto de los ovarios y del útero (Ulaner, G.A. et al., 1998, Cancer Res. 58:
4168-4172; Ulaner, G.A., et al., 2000, Int. J. Cancer 85: 330-335). El enfoque de los estudios descritos anteriormente
ha sido las variantes α y β de corte y empalme, supuestamente porque suprimen secuencias que se piensa que codifican
los grupos críticos de la retrotrascriptasa (Lingner, J., et al., 1997, Science 276: 561-567).
La presente invención proporciona péptidos y ácidos nucleicos que codifican dichos péptidos basados en las variantes γ y σ de corte y empalme de TERT, y el uso novedoso de dichos péptidos y ácidos nucleicos en la medicina.
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Así, según la presente invención, se proporciona un polipéptido para usar en la medicina, comprendiendo dicho
polipéptido una secuencia presentada en la SEQ ID. N◦ 3, 4, 5 ó 6 en la que el polipéptido es capaz de inducir una
respuesta de las células T.
El término “comprende” tal como se utiliza en la presente memoria incluye “consiste”. El polipéptido (o ácido
nucleico) de la presente invención puede tener a cada lado uno o más grupos de aminoácido (o ácido nucleico) a no
ser que se especifique lo contrario. Por ejemplo, el polipéptido puede formar parte de una proteína de fusión que tiene
uno o más dominios a cada lado en el terminal N o C para permitir la purificación de la proteína de fusión.
Cambios o modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de aminoácido en el polipéptido pueden llevarse a cabo,
especialmente, para anclar los residuos que encajen en las moléculas de ALH y CPH para su presentación a las células
T. Una unión y propiedades inmunogénicas potenciadas del polipéptido correspondiente a las moléculas de ALH o
CPH pueden así conseguirse (véase Bristol, J.A., et al., 1998, J. Immunol. 160(5): 2433-2441; Clay, T.M. et al., 1999,
J. Immunol. 162(3): 1749-1755).
También se describen en la presente memoria los polipéptidos que tienen:
a) una identidad de secuencia de al menos el 55% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
1, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con los parámetros de defecto;
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b) una identidad de secuencia de al menos el 55% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
2, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con los parámetros de defecto;
c) una identidad de secuencia de al menos el 40% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
3, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con un valor de expectación de
1000 y los valores defecto de los otros parámetros;
d) una identidad de secuencia de al menos el 40% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
4, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con un valor de expectación de
1000 y los valores defecto de los otros parámetros;
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e) una identidad de secuencia de al menos el 70% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
5, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con un valor de expectación de
100000 y los valores defecto de los otros parámetros;
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f) una identidad de secuencia de al menos el 50% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
6, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con un valor de expectación de
10000 y los valores defecto de los otros parámetros;
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g) una identidad de secuencia de al menos el 40% con una molécula que comprende la secuencia de SEQ ID. N◦
11, tal como se determinó en una búsqueda utilizando el NCBI BLASTP Versión 2.1.2 con un valor de expectación de
1000 y otros parámetros de defecto;
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El programa BCBI BLASTP puede encontrarse en la página web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, y los parámetros de defecto pueden cambiarse con la opción de búsqueda avanzada. Pueden necesitarse valores de “expectación”
más altos que los valores defecto que aparecen en la búsqueda de secuencias diana cortas para que se presenten las
coincidencias. El término “identidad de secuencia” utilizado en la presente memoria se refiere a los residuos de aminoácido en secuencias con una alineación óptima que pueden coincidir exactamente en las posiciones correspondientes
relativas. Por ejemplo, el programa NCBI BLASTP proporciona un valor porcentaje de identidades entre las secuencias diana y las secuencias encontradas.
También están descritos en la presente memoria los polipéptidos que comprenden una secuencia tal como se indica
en la SEQ ID. N◦ 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 11, o que son fragmentos de una secuencia presentada en la SEQ ID. N◦ 1, 3, 5, 6 ó
11.
Mientras que los polipéptidos que presentan las moléculas de ALH de clase II tienen una longitud variable (1225 aminoácidos), los polipéptidos que presentan las moléculas de ALH de clase 1 tienen que ser normalmente de una
longitud de nueve residuos de aminoácidos para que puedan encajar en la ranura de unión de ALH de clase I. Un
polipéptido más largo no se unirá si no puede ser procesado de forma interna por un CPA o una célula diana, tal como
una célula cancerosa, antes de presentarse en la ranura de ALH restringida a la clase I. Se ha descrito sólo un número
limitado de desviaciones de dicho requerimiento de nueve aminoácidos, y en estos casos, la longitud del polipéptido
presentado fue de ocho o diez residuos de aminoácidos. Para revisiones sobre la unión de polipéptidos a moléculas de
CPH, véase Rammensee, H.-G. et al., (1995) Immunogenetics 41: 178-228, y Barinaga (1992), Science 257: 880-881.
Male, D.K. et al. (1996, Advanced Immunology, Mosby, Londres) que proporcionan una información de fondo sobre
el campo de la inmunología.
La respuesta de las células T generadas por el polipéptido descrito anteriormente puede generarse después de la
división intracelular del polipéptido para proporcionar un fragmento que encaja en una ranura de unión de CPH o ALH.
Como alternativa, puede que el polipéptido descrito anteriormente no necesite una división intracelular para encajar
en una ranura de unión de CPH o ALH de clase I. En este caso, el polipéptido puede tener una longitud de 8 a 10
aminoácidos. También se proporciona un polipéptido descrito anteriormente que no necesita una división intracelular
para encajar en una ranura de unión de clase I de CPH o ALH. En este caso, la longitud del polipéptido puede ser de
12 a 25 aminoácidos.
La respuesta de las células T según la presente invención puede aumentar el número y/o la actividad de las células
T cooperadoras y/o T citotóxicas.
También se proporciona un polipéptido que, en un paciente, no estimula una respuesta sustancial de las células T
citotóxicas contra una o más de las siguientes células: células madre de médula ósea, células epiteliales en criptas del
colon o linfocitos.
Además, según la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico para uso en medicina; en
donde la molécula de ácido nucleico:
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a) contiene una cadena que codifica un polipéptido descrito anteriormente como parte de la preestimulación;
b) contiene una cadena que es complementaria, a la cadena tal como se ha descrito anteriormente en a); o
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c) contiene una cadena que se vuelve híbrida en condiciones rigurosas con una molécula tal como se ha descrito
anteriormente en a) o b).
Las condiciones rigurosas de hibridación se describen en detalle en las pág. 1101-1110 y 1145-1161 de Sambrook,
J. et al. (1989, Molecular Cloning, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Un ejemplo
de las condiciones de hibridación que pueden darse implica usar una solución de prelavado de 5 X SSC, 0,5% de SDS,
1,0 mM EDTA (pH 8,0) e intentar llevar a cabo la hibridación durante la noche a 55◦ C con 5 X SSC. La hibridación de
secuencias de ácido nucleico en el ámbito de la presente invención incluye sondas, cebadores o fragmentos de ADN.
El término cebador incluye un oligonucleótido monocatenario que actúa como un punto de iniciación de una síntesis
de ADN dirigida por un patrón en condiciones apropiadas (por ejemplo, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfato
diferentes y un agente de polimerización, tal como la polimerasa ADN o ARN o retrotrascriptasa) en una solución
tampón indicada y a una temperatura indicada.
También se proporciona un vector o una célula para usar en la medicina que comprende una molécula de ácido
nucleico según la presente invención.
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También se proporciona un agente de unión para usar en la medicina, en donde dicho agente de unión se une a
un polipéptido descrito anteriormente. Dicho agente de unión puede ser específico para un polipéptido tal como se ha
descrito anteriormente. Dicho agente de unión puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo. Dicho agente de
unión puede ser lectina.
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El término anticuerpo en varias de sus formas gramaticales se utiliza en la presente memoria para referirse a
moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir,
moléculas que contienen un sitio de unión del anticuerpo o paratopo. Dichas moléculas también se denominan “fragmentos de unión al antígeno” de moléculas de inmunoglobulina. Moléculas ilustrativas de anticuerpos son moléculas
de inmunoglobulina intactas, las moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una
molécula de inmunoglobulina que contiene el paratopo, conocidas en el estado de la técnica como Fab, Fab’, F(ab’)2
y F(v). Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales. Se pretende que el término
anticuerpo también englobe a los anticuerpos monocatenarios, los anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados (con injerto de CDR) y parecidos, así como anticuerpos monocatenarios quiméricos o con injerto de CDR, que
comprenden porciones de diferentes especies. Para la preparación de los anticuerpos, véase Harlow, E. y Lane, D.
(1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) y Harlow. E. y
Lane, D. (1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
Los adyuvantes inmunológicos para las vacunas que comprenden lecitina pueden usarse para estimular la producción
de anticuerpos (véase por ejemplo, US4803070).
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También se ha proporcionado según la presente invención un linfocito T para usar en la medicina; en donde
el linfocito T es capaz de matar a una célula que expresa un polipéptido descrito anteriormente según la presente
invención o de cooperar en matar a semejante célula. Dicho linfocito T puede ser una célula T citotóxica o una célula
T cooperadora.
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También se describe una línea de células clonal para usar en la medicina que comprende una pluralidad de linfocitos
T tal como se ha descrito anteriormente. Del mismo modo se proporciona una mezcla de linfocitos T para usar en la
medicina que comprende una célula T cooperadora o una línea de células clonal de dichas células y una célula T
citotóxica o una línea de células clonal de semejantes células.
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También se describe un método para generar linfocitos T que son capaces de reconocer y destruir células tumorales
en un mamífero, que comprende recoger una muestra de linfocitos T de un mamífero y cultivar la muestra de linfocitos
T en presencia de al menos un polipéptido descrito anteriormente en una cantidad suficiente como para generar linfocitos T específicos para la proteína de inserción de TITEh-γ y/o linfocitos específicos para la proteína de inserción de
TITEh-σ.
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También se describe un linfocito B que puede ser útil para la generación de anticuerpos. Hibridomas que son
capaces de generar anticuerpos también se describen (véase por ejemplo Koehler et al., 1975, Nature 256: 495-497;
Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA 80: 2026-2030; Cole et al., 1985, Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., Nueva York, pág. 77-96).
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45
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También proporcionado por la presente invención está el uso de un polipéptido tal como se ha descrito anteriormente, y del ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, o un vector o una célula tal como se ha descrito
anteriormente en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer, o en la preparación de un sistema de diagnóstico para la diagnosis del cáncer. El cáncer puede ser un cáncer mamífero. En particular, el cáncer puede ser un
cáncer humano. Por ejemplo, el cáncer puede ser cáncer de mama, cáncer de la próstata, cáncer pancreático, cáncer
del colon o recto, cáncer del pulmón, melanoma maligno, leucemia, linfoma, cáncer de los ovarios, cáncer cervical, o
carcinoma del tracto biliar.
Dicho medicamento puede ser una vacuna.
Los polipéptidos descritos en la presente memoria son especialmente apropiados para utilizarse en una vacuna
capaz de inducir de forma segura inmunidad contra las células T CD4+ o CD8+. Dado que los polipéptidos pueden
producirse sintéticamente, los medicamentos que incluyen los polipéptidos no incluyen los genes de transformación
del cáncer u otros sitios o materiales que pueden producir efectivos dañinos. Los polipéptidos pueden ser la diana para
un tipo concreto de respuesta de las células T sin los efectos secundarios de otras respuestas no deseadas.
Dicho medicamento puede ser una molécula antisentido o capaz de generar una molécula antisentido in vivo.
55
Dicho diagnóstico puede suministrarse en forma de un equipo. El equipo puede comprender medios para generar
una señal detectable (por ejemplo, un marcaje fluorescente o radioactivo) o un cambio detectable (por ejemplo, un
cambio catalizado por una enzima). El equipo puede incluir instrucciones para diagnosticar el cáncer.
60
También se ha proporcionado una composición farmacéutica que comprende un polipéptido tal como se ha descrito
anteriormente, y ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, o un vector o una célula tal como se ha descrito
anteriormente.
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Dicha composición farmacéutica puede comprender un polipéptido capaz de inducir una respuesta de las células
T dirigida contra un polipéptido producido por un encogen o contra una proteína de supresión tumoral mutante, o
un ácido nucleico que codifica semejante polipéptido. Ejemplos de estos oncogenes o proteínas de supresión tumoral
mutantes incluyen p21-ras, RB, p53, abl, gip, gsp, ret o trk. La diana del encogen pueden ser los polipéptidos p21-ras
descritos en la solicitud internacional núm. PCT/NO92/00032 (núm. de publicación WO92/14756).
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También se ha descrito una preparación combinada que comprende un componente de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente para usar simultáneamente o de forma separada o secuencial en la terapia del cáncer.
5
Se proporciona adicionalmente una composición farmacéutica tal como se ha descrito anteriormente que también comprende un vehículo, diluyente, aditivo, estabilizador, y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptables; dicha
composición o preparación combinada incluyendo adicionalmente y de forma opcional uno o más de los siguientes
elementos: una citoquina o factor de crecimiento (por ejemplo, IL-2, IL-12 y/o GM-CSF) y otro polipéptido producido
en una mutación del corrimiento del marco de lectura (por ejemplo, una mutación del corrimiento del marco lectura
en el gen BAX o hTGFβ-RII).
10
Se describe el efecto estimulador sobre las células T CD4+ y CD8+ de una forma específica de los polipéptidos
que resultan de la mutación del corrimiento del marco de lectura en los genes BAX y hTGFβ-RII en la publicación
WO92/14756 (véase anteriormente).
15
La composición farmacéutica descrita anteriormente puede ser una vacuna.
La composición farmacéutica descrita anteriormente puede comprender o ser capaz de producir moléculas antisentido.
20
También se proporciona un método para la preparación de una composición farmacéutica tal como se ha descrito
anteriormente, que comprende los pasos de combinar los componentes descritos arriba con un vehículo, diluyente,
aditivo, estabilizador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables.
Una composición farmacéutica puede comprender cualquiera de las siguientes mezclas:
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a) una mezcla de al menos un polipéptido descrito anteriormente junto con otro polipéptido que contiene una
secuencia diferente;
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b) una mezcla de al menos un polipéptido descrito anteriormente junto con otro polipéptido que contiene una
secuencia que se solape con el primero, de tal forma que los polipéptidos son apropiados para encajar en diferentes
alelos de CPH o ALH;
c) una mezcla de las dos mezclas de a) y b);
35
d) una mezcla de varias mezclas de a);
e) una mezcla de varias mezclas de b); o
f) una mezcla de varias mezclas de a) y varias mezclas de b).
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Los polipéptidos en las mezclas pueden estar unidos entre sí con enlaces covalentes para formar polipéptidos más
largos o incluso polipéptidos cíclicos. Los polipéptidos pueden tener una forma lineal o cíclica.
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También se ha proporcionado en la presente memoria una composición diagnóstica que comprende un polipéptido
tal como se ha descrito anteriormente, y ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, un vector o una célula
tal como se ha descrito anteriormente, aglutinante tal como se ha descrito anteriormente, y linfocito T tal como se ha
descrito anteriormente, una línea de células tal como se ha descrito anteriormente, o una mezcla de linfocitos T tal
como se ha descrito anteriormente.
También se ha proporcionado en la presente memoria un equipo diagnóstico tal como se ha descrito anteriormente.
También se ha proporcionado en la presente memoria un método para el tratamiento o profilaxis de cáncer en
un cuerpo humano o animal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz y suficiente de dicha
composición descrita anteriormente a un paciente o animal necesitado de la misma. La descripción también incluye
un método para el tratamiento o profilaxis de un paciente o animal que padece cáncer, comprendiendo dicho método
administrar a dicho paciente o animal una composición farmacéutica descrita anteriormente en una cantidad suficiente
como para inducir una respuesta de las células T contra dicho cáncer. El método del tratamiento puede incluir también
la estimulación in vivo o ex vivo con una composición farmacéutica descrita anteriormente. La terapia ex vivo puede
incluir aislar las células dendríticas u otras células presentadoras del antígeno apropiadas de un paciente o animal,
cargar dichas células con al menos un polipéptido o ácido nucleico descrito anteriormente, y infundir dichas células
cargadas otra vez en el paciente o animal. Los polipéptidos o ácidos nucleicos descritos anteriormente pueden utilizarse
también en un método de vacunación de un paciente con tal de otorgar resistencia contra el cáncer. A veces, los
oncogenes están asociados con los virus. La presente invención también es apropiada para el tratamiento de ciertos
trastornos virales.
65
Los polipéptidos según la presente invención pueden administrarse en una cantidad en el intervalo de 1 microgramo
(1 µg) a 1 gramo (1 g) a un paciente humano o individuo tipo a ser vacunado. Se prefiere que se utilice una dosis menor
en el intervalo de 1 microgramo (1 µg) a 1 miligramo (1 mg) en cada administración.
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Las dosis exactas, es decir, las dosis farmacéuticamente aceptables, y la pauta de administración de composiciones
farmacéuticas y medicamentos de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por una persona experta
en la materia, por ejemplo, mediante el uso de un ensayo de dosis-respuesta.
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La administración puede efectuarse una vez o varias veces según lo indicado para establecer o mantener la inmunidad deseada contra las células T. Los polipéptidos según la presente invención pueden administrarse juntos, bien
simultáneamente o de forma separada, con compuestos tales como citoquinas y/o factores de crecimiento, es decir,
interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-12 (IL-12), el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos o
semejantes con el fin de reforzar la respuesta inmunológica tal como se conoce en el estado de la técnica. Los polipéptidos pueden utilizarse en una vacuna o una composición terapéutica bien solos o en combinación con otros materiales.
Por ejemplo, el polipéptido o los polipéptidos pueden suministrarse en forma de un conjugado de un lipopéptido que
se sabe que induce una respuesta citotóxica de las células T de alta afinidad (Deres, K. et al., 1989, Nature 342: 561564).
Los polipéptidos según la presente invención pueden administrarse a un individuo o animal en forma de vacunas
de ADN. El ADN que codifica el/los polipéptido/s puede estar en forma de ADN clonado en plásmido o de un
oligonucleótido sintético. El ADN puede suministrarse junto con citoquinas, tales como IL-2, y/o otras moléculas coestimuladoras. Las citoquinas y/o moléculas co-estimuladoras pueden suministrarse en forma de plásmido o ADN
oligonucleótido.
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Se ha demostrado que la respuesta a una vacuna de ADN aumenta con la presencia de secuencias inmunoestimuladoras (SIS) de ADN. Estas pueden estar en forma de grupos hexaméricos que contienen CpG metilado según la
fórmula: 5’-purina-purina-CG-pirimidina-pirimidina-3’. Por lo tanto, las vacunas de ADN según la presente invención
pueden incorporar éstas u otras SIS en el ADN que codifica la proteína de inserción de TITEh-γ y/o la proteína de inserción de TITEh-σ, en el ADN que codifica una citoquinina u otras moléculas co-estimuladoras, o en ambas. Una revisión de las ventajas de la vacunación con ADN puede leerse en Tighe et al. (1998, Immunology Today, 19(2): 89-97).
La presente invención también proporciona el polipéptido descrito anteriormente, opcionalmente de una forma
aislada, en donde el polipéptido no es un polipéptido que consiste en las secuencias mostradas en la figura 4.
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La secuencia de polipéptidos mostrada en la figura 4 representa lo descrito en la figura 5C de Kilian et al. (1997,
supra) de 46 residuos de aminoácidos en el extremo terminal C de la variante de inserción de corte y empalme de
TITEh γ de aproximadamente 1100 aminoácidos, que incluye 44 aminoácidos de la SEQ ID. N◦ 1. La secuencia
proporcionada en Kilian et al. (1997, supra) muestra el “terminal C alternativo” de la variante correspondiente a la
proteína de inserción de corte y empalme de TITEh γ. (Kilian et al. 1997 supra indican que la secuencia correspondiente de ADN se proporciona con el número de accesión al GeneBank AF015950). Kilian et al. (1997, supra) no
describen como una entidad distinta el polipéptido según las SEQ ID Nos: 1, 2 ó 5 en el extremo terminal C de la
variante correspondiente a la proteína de inserción de corte y empalme de TITEh γ, y no describen o sugieren un uso
medicinal del polipéptido según las SEQ ID Nos: 1, 2 ó 5.
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Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden producirse mediante procesos convencionales, por ejemplo, mediante varios métodos de síntesis de polipéptidos conocidos en el estado de la técnica. Como alternativa, pueden
ser fragmentos de una proteína de inserción de TITEh-γ y/o una proteína de inserción de TITEh-σ producida por la
división, por ejemplo, con bromuro de cianógeno seguido de su purificación. También puede utilizarse la división
enzimática. La proteína de inserción de TITEh-γ y la proteína de inserción de TITEh-σ también pueden aparecer en
forma de proteína recombinante o de polipéptidos expresados.
También se ha proporcionado un ácido nucleico tal como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en una
forma aislada; en donde el ácido nucleico no es un ácido nucleico que codifica el polipéptido excluido anteriormente
y además no es un ácido nucleico tal como se muestra en la figura 4 o la figura 5.
La secuencia del ácido nucleico en el extremo 3’ de la variante correspondiente a la inserción de corte y empalme
de TITEh-γ, parte de la cual codifica el extremo terminal C de la proteína correspondiente que incluye la SEQ ID.
N◦ 1, se describe en la figura 4 de Kilian et al. (1997 supra). La secuencia del ácido nucleico en el límite exón-intrón
de las variantes de corte y empalme de TITEh INS1 (equivalente a la variante de corte y empalme con inserción γ) y
INS3 (equivalente a la variante de corte y empalme con inserción γ), tal como se describió en la figura 2B de Wick et
al. (1999, supra) se muestran en la figura 5. Los ácidos nucleicos mostrados en la figura 5 tal como se describen en
la figura 2B de Wick et al., (1999, supra) incluyen nucleótidos que codifican residuos de aminoácidos presentes en la
SEQ ID Nos: 1-6 y 11. Wick et al. (1999, supra) no hacen referencia especial a la existencia de los ácidos nucleicos
mostrados como entidades distintas o a su uso medicinal. Wick et al., 1999, supra, hacen referencia a la secuencia
completa de nucleótidos de su gen de TITEh en los números de accesión a GenBank AF128893 y AF128894.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención pueden hacerse mediante la síntesis
de oligonucleótidos. Esto puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de los diversos métodos disponibles en el estado
de la técnica. Un ácido nucleico que codifica una proteína telomerasa puede clonarse de una biblioteca genómica o
de ADNc mediante el rastreo convencional de bibliotecas. La sonda puede corresponder a una porción de cualquier
secuencia de un gen conocido de inserción de TITEh-γ y/o un gen conocido de inserción de TITEh-σ. Como alternativa, el ácido nucleico puede obtenerse mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP). El ácido nucleico
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es preferiblemente el ADN, y puede clonarse adecuadamente en un vector. Pueden generarse subclones mediante el
uso de enzimas de restricción indicadas. El ADN clonado o subclonado puede propagarse en un huésped no humano
indicado, por ejemplo, en un huésped bacteriano. Como alternativa, el huésped no humano puede ser un organismo
eucariótico, tal como una levadura o un baculovirus. La proteína de inserción de TITEh-γ y la proteína de inserción
de TITEh-σ o los polipéptidos pueden producirse mediante la expresión en un huésped no humano indicado. En este
caso, el ADN se clona en un vector de expresión. Se dispone de una variedad de equipos comerciales de expresión.
Los métodos descritos en Sambrook, J. et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor) pueden utilizarse para estos fines.
También se ha proporcionado el vector o la célula tal como se ha descrito en la presente memoria, opcionalmente
en forma aislada.
Adicionalmente se ha proporcionado un aglutinante tal como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma
aislada.
15
De mismo modo se ha proporcionado el linfocito T tal como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en forma
aislada.
20
También se ha proporcionado la línea clonal de células tal como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en
forma aislada.
Del mismo modo, se ha proporcionado la mezcla de linfocitos T tal como se ha descrito en la presente memoria.
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También se describe un sistema de almacenaje de datos que una maquina pueda leer (por ejemplo, un disquete)
que comprenda la secuencia de un polipéptido o de un ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria.
Adicionalmente se describe un método que comprende utilizar la secuencia de polipéptidos o una molécula de
ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria para llevar a cabo estudios de identidad de secuencia,
estudios de secuencias homólogas, o estudios de hibridación. Dicho método puede incluir el uso de ésta secuencia para
predecir la estructura y/o la función (por ejemplo, para predecir la actividad contra el cáncer). También proporcionada
es la utilización de este método en el procedimiento del desarrollo del fármaco o del rastreo.
También se describe un ordenador o una base de datos que visualiza o almacena una secuencia de un polipéptido o
un ácido nucleico tal como se describe en la presente memoria o que está puesto a punto para llevar a cabo un método
tal como se ha descrito anteriormente.
Los términos “residuo de aminoácido” y “aminoácido” se definen en su sentido amplio para incluir aminoácidos
modificados o poco comunes tal como se define en la norma WIPO ST.25, que se incorpora en la presente memoria
como referencia.
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El término tratamiento o terapia utilizado en la presente memoria incluye tratamiento profiláctico o terapia según
lo indicado.
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El contenido de cada una de las referencias a las que la presente memoria cita, incluyendo las referencias citadas
en las propias referencias, se incorpora enteramente como referencia.
La invención se clarifica mejor en la siguiente descripción, con referencia a varias figuras acompañantes, que
demuestran sólo a título de ejemplo, varios polipéptidos y su uso según la presente invención.
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Sobre las figuras:
La figura 1 es un dibujo esquemático del ARNm completo de TITEh y las variantes de corte y empalme encontradas
en líneas de células cancerosas.
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La figura 2 muestra una alineación de proteínas entre una porción de la proteína TITEh y las proteínas que resultan
de la traducción de variantes de corte y empalme;
La figura 3 muestra los extremos terminales carboxilos de las proteínas correspondientes a las variantes de corte y
empalme de inserción de TITEh γ de TITEh;
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La figura 4 muestra el estado de la técnica referente a la variante de corte y empalme de inserción de TITEh γ tal
como se describe en la figura 5C de Kilian et al. (1997 supra);
La figura 5 muestra las secuencias del estado de la técnica referente a las variantes de corte y empalme de inserción
de TITEh γ y de inserción de TITEh σ tal como se describe en la figura 5C de Kilian et al. (1997 supra);
La figura 6 muestra los resultados del análisis de RT-RCP de las regiones que comprenden las variantes de corte y
empalme de inserción de TITEh γ y de inserción de TITEh σ;
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La figura 7 muestra las respuestas proliferativas de las células T inducidas en muestras de sangre humana mediante
un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID. N◦ 11;
5
La figura 8 muestra la proliferación de clones de las células T inducidos por un polipéptido que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID. N◦ 11; y
La figura 9 muestra la proliferación de otros clones de células T inducidos por un polipéptido que tiene la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID. N◦ 11.
10
En la figura 1, la posición de los intrones presentes en el pre-ARN de TITEh se indica mediante la letra “i” seguida
del número indicado. Las variantes de inserción y eliminación se muestran como cuadros; un relleno sombreado
representa las secuencias que codifican una secuencia de proteínas que no está presente en la proteína TITEh completa.
La posición y orientación de los cebadores de oligonucleótidos utilizados para analizar las diferentes variantes de corte
y empalme se indican con flechas.
15
En la figura 2, la numeración de los aminoácidos se indica encima de la secuencia. Los aminoácidos se representan
mediante su abreviatura estándar de una letra conocida en el estado de la técnica.
20
En la figura 3, SEQ ID. N◦ 1 refleja la cola truncada de la proteína de inserción de TITEh γ y la SEQ ID. N◦ 2 refleja
el mismo polipéptido con una extensión en el extremo amino con los nueve aminoácidos encontrados normalmente en
estas posiciones en el producto de expresión de la inserción de TITEh γ que ocurre naturalmente (subrayado). La SEQ
ID. N◦ 3 refleja la cola truncada de la proteína de inserción de TITEh σ. La SEQ ID. N◦ 4 refleja la SEQ ID. N◦ 3 con
una extensión en el extremo amino con los nueve aminoácidos que normalmente se encuentran en estas posiciones en
el producto TITEh de expresión de la inserción σ que ocurre naturalmente (subrayado).
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En la figura 4, se muestran los límites exón/intrón de la variante de corte y empalme de inserción 3 (equivalente
a la variante de corte y empalme de inserción γ) tal como se proporciona en la Figura 5C de Kilian et al. (1997
supra). La siguiente información se proporciona en Kilian et al. (1997, supra): la secuencia de ácidos nucleicos se
muestra por encima de una secuencia de traducción de proteínas, con el intrón putativo no cortado ni empalmado
representado en negrita; los límites exón/intrón putativos se marcan con |; la numeración de la secuencia de ácidos
nucleicos corresponde a lo siguiente: el nucleótido 1 corresponde al nucleótido 139 de la secuencia en el número de
accesión a GenBank AF015950; y se subrayan los aminoácidos que corresponden al sitio putativo de unión de cAb1/SH3. La secuencia de aminoácidos indicadas en Kilian et al. (1997, supra) representa el extremo terminal C de
una proteína que corresponde a una variante de inserción de corte y empalme de TITEh γ con aproximadamente 1100
aminoácidos.
En la figura 5, se representan los nucleótidos de los límites exón-intrón de las variantes de corte y empalme de
TITEh INS1 (equivalente a la variante de corte y empalme de inserción σ) y INS3 (equivalente a la variante de
corte y empalme de inserción γ) tal como se describe en la figura 2B de Wick et al. (1999, supra). Las secuencias
intrónicas y extrónicas se muestran en minúsculas y mayúsculas, respectivamente. Wick et al. (1999, supra) indican
que la secuencia de nucleótidos de su gen TITEh se ha depositado como números de accesión a GenBank AF128893
y AF128894.
Se ha establecido que las variantes de inserción de corte y empalme γ y σ se expresan en líneas de células cancerosas y en tumores pero que no se pueden detectar, o que tienen niveles muy bajos, en células normales. Por lo tanto, la
presente solicitud describe candidatos a una vacuna general de cáncer con una especificidad mejorada en comparación
con las vacunas basadas en la variante funcional de la proteína telomerasa (TITEh). Tanto las inserciones y como a
resultan en la formación de un codón de terminación temprano y la expresión de una proteína que está truncada en
el terminal carboxilo. Las proteínas de inserción de TITEh γ y σ truncadas no tienen actividad telomerasa propia. En
el caso de una inserción γ, la cola truncada de la proteína es una secuencia de 44 aminoácidos (SEQ ID. N◦ 1). Una
inserción σ da como resultado una proteína en que la cola truncada es una secuencia de 20 aminoácidos (SEQ ID.
N◦ 3). Se expresan principalmente en líneas de células cancerosas pero no se pueden detectar, o están presentes en
niveles muy bajos, en células normales y por lo tanto son diana para una inmunoterapia específica. Según la presente
invención, los polipéptidos que corresponden al extremo carboxilo (la cola truncada) de las proteínas expresadas por
las variantes de inserción de corte y empalme de TITEh γ y σ son útiles como agentes anticancerígenos o vacunas con
la función de desencadenar el brazo celular del sistema inmunológico (las células T) en humanos contra las células
cancerosas. En una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende la secuencia según la SEQ ID. N◦
5. En otra realización preferida de la invención, el polipéptido comprende la secuencia según la SEQ ID. N◦ 6. En otra
realización preferida adicional, el polipéptido comprende la secuencia según la SEQ ID. N◦ 11.
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Experimental
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Los experimentos resumidos en esta memoria describen la caracterización de las variantes de corte y empalme de
TITEh en varias líneas de células comparada con células normales. Se detallan la síntesis de los polipéptidos según
la presente invención y los experimentos para ensayar la eficacia de los polipéptidos para usar en la terapia contra el
cáncer. Se describe un experimento que demuestra la inducción y proliferación de células T humanas por un péptido
que tiene una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID. N◦ 11.
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Análisis RT-RCP de las variantes de inserción de corte y empalme de TITEh
Análisis del ARN
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Se aisló ARNm poli(A)+ de células completamente Usadas directamente de los lisados con bolitas magnéticos
oligo(dT) (Dynal AS; Jakobsen, K.S., et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 3669). Fracciones citosólicas de ARNm
se prepararon incubando las células en IGEPAL al 1% (Sigma) a 0◦ C durante un minuto, seguido de centrifugación
(10000 g; 1 min.; 4◦ C) para eliminar los núcleos. A continuación, se aisló el ARNm poli(A)+ del sobrenadante utilizando las bolitas oligo(dT) tal como se ha descrito anteriormente.
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Síntesis de ADNc y RCP
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La síntesis de la cadena inicial de ADNc se llevó a cabo con procedimientos estándar utilizando retrotrascriptasa
m-MLV ARNasaH+ (Promega Corp.) y las reacciones de RCP se llevaron a cabo con ADN polimerasa HotStar Taq
(Qiagen) y efectuando 35 ciclos en un ciclador térmico PTC-2000 (MJ Research). Para obtener productos detectables
de MSP y las células CD34+ , el 10% de la reacción se utilizó como patrón en una segunda reacción RCP y se amplificó
con 15 ciclos adicionales.
Para el análisis de la variante de inserción de corte y empalme γ, se utilizó el cebador de cadena positiva TITEhp315 (5-GCC TCC CTC TGC TAC TCC ATC CT - SEQ ID. N◦ 7) y el cebador de cadena negativa TITEh-m3652
(5-CGT CTA GAG CCG GAC ACT CAG CCT TCA - SEQ ID. N◦ 8). Aplicados al ADNc de TITEh completo y
a la variante de inserción γ, dichos cebadores producen fragmentos de 465 y 624 nucleótidos, respectivamente. El
análisis de la variante de inserción σ se llevó a cabo con los cebadores TITEh-P6 (5-GCC AAG TTC CTG CAC TGG
CTG A - SEQ ID. N◦ 9) y TITEh-m2044 (5-GCT CTA GAA CAG TGC CTT CAC CCT CG - SEQ ID. N◦ 10). El
producto de amplificación que resulta de la utilización de estos cebadores con ADNc TITEh completo y la variante de
inserción a comprende 369 y 407 nucleótidos, respectivamente. Para verificar que estos productos de RCP representan
variantes genuinas de variantes de corte y empalme, los fragmentos se aislaron del gel y se analizaron mediante una
secuenciación directa con un secuenciador automatizado ABI Prism 310 (PE Corp.).
Resultados
La actividad de la telomerasa depende de una regulación compleja a nivel de la postranscripción, y los métodos
que se usan para detectar la presencia o ausencia de las proteínas telomerasa deberían involucrar la medición directa
de la propia proteína, o como alternativa, las variantes de ARNm. Además, la abundancia de las diferentes variantes
de corte y empalme de TITEh que se encuentran en las células no se correlaciona necesariamente con los niveles que
se encuentran en la fracción citosólica de las mismas células (véase la figura 6). Estas desviaciones pueden explicarse
mediante las diferencias en la eficacia con la que las variantes de ARNm se transportan del núcleo al compartimiento
citosólico, y/o mediante la estabilidad diferencial de las variantes específicas de corte y empalme en el citosol. En
el estado de la técnica, se sabe bien que dichos mecanismos forman parte del concepto de la regulación génica. No
obstante, los estudios llevados a cabo para explicar la regulación de TITEh, incluyendo los citados anteriormente, han
usado el ARN total o ARNm aislados de células completamente lisadas para su análisis. Los equipos y reactivos que
son necesarios para llevar a cabo este tipo de aislamiento de ARN están disponibles en muchos sitios en el mercado
comercial. Para obtener una visión correcta de la expresión génica, los estudios en la abundancia de ARNm deben
incluir un análisis del ARNm específico para el compartimiento citosólico.
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La figura 6 muestra los resultados del análisis de RT-RCP de las regiones que comprenden las variantes de inserción
de TITEh γ (A) y σ (B). HL60, K562 y Jurkat indican las líneas de células cancerosas analizadas. HL60 es una línea
promielocítica de leucemia (Sokoloski, J.A. et al., 1993, Blood 82: 625-632), K562 una línea de células eritroides
de leucemia (Lozzio, C.B. et al., 1975, Blood 45: 312-324), mientras que Jurkat se deriva de las células agudas de
linfocitos T de leucemia (Gillis, S. et al., 1980, J. Exp. Med. 152: 1709-1719). Las líneas de células cancerosas
HL60, K562 y Jurkat están disponibles comercialmente (por ejemplo, del ATCC, Oslo). MSP1, MSP2, MSP3 y MSP4
representan poblaciones de células mononucleares de sangre periférica (MSP) aisladas de cuatro diferentes donantes
sanos. CD34 indica células madre positivas para CD34 aisladas de un donante sano, y CC1/CC2 indica biopsias de
cáncer del colon obtenidas de dos pacientes con cáncer en el Norwegian Radium Hospital, Oslo, siendo CC2a y CC2b
dos muestras de tejido diseccionadas del mismo tumor. Las reacciones RT-RCP llevadas a cabo con el ARNm aislado
de la lisis completa de células y con el ARNm aislado de las fracciones citosólicas se indican con las letras “T” y “C”,
respectivamente. La “M” indica el carril con el marcador de peso molecular. La posición de fragmentos de RCP que
representan las variantes de inserción de corte y empalme γ y σ y los respectivos productos completos de TITEh (+)
se indican en el lado derecho de los cuadros.
El análisis por RT-RCP mostró que las variantes de inserción por corte y empalme tanto γ como σ se detectaron
fácilmente en todas las líneas de células cancerosas y en una de las muestras de tumor analizadas (CC2b), apareciendo
la variante de inserción σ como la más abundante en las fracciones citosólicas. Al contrario, no pudimos detectar estas
variantes en las poblaciones citosólicas de ARNm aisladas de las células MSP a pesar de una amplificación extensiva
por RCP llevada a cabo en estas muestras. La identidad del fragmento débil de 395 bp producido con los cebadores de
inserción σ en las células MSP y CD34-positivas no se conoce en la actualidad.
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Síntesis de polipéptidos y su análisis para las aplicaciones relacionadas con el cáncer
La síntesis de polipéptidos
5
10
Los polipéptidos se sintetizaron mediante una síntesis de flujo continuo sobre fase sólida. Se utilizaron aminoácidos N-a-Fmoc con una protección indicada de las cadenas laterales. Los aminoácidos Fmoc se activaron para acoplar
como esteres de pentafluorofenilo o mediante el uso de activación con TBTU o diisopropilo carbodiimido antes del
acoplamiento. Se utilizó piperidina al 20% en DMF para la eliminación selectiva de Fmoc después de cada acoplamiento. La división de la resina y la eliminación final de la protección de las cadenas laterales se llevaron a cabo con
TFA 95% que contenía antioxidantes apropiados. Los polipéptidos se purificaron y analizaron mediante una HPLC
de fase inversa. La identidad de los polipéptidos se confirmó mediante la espectroscopia de masas con rociado de
electrones.
Ensayos de polipéptidos y terapia contra el cáncer
15
Para que una vacuna según la presente invención y los métodos para una terapia específica contra el cáncer basada
en la inmunidad de las células T sean eficaces, tienen que darse dos condiciones:
20
(a) el polipéptido contiene al menos 8 aminoácidos y es un fragmento de la proteína de inserción de TITEh γ o de
la proteína de inserción de TITEh γ, y
(b) el polipéptido es capaz de inducir, bien en su forma completa bien después del procesamiento por células
presentadoras de antígenos, respuestas de las células T.
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Los siguientes métodos experimentales pueden utilizarse para determinar si se cumplen estas dos condiciones en
el caso de un polipéptido en concreto. Primero, hay que determinar si el polipéptido concreto da lugar a respuestas
de las células T in vitro. También hará falta establecer si los polipéptidos sintéticos corresponden a, o son capaces
de proporcionar después de su procesamiento, fragmentos de polipéptidos que corresponden a los fragmentos de
polipéptidos que ocurren en las células cancerosas que alberguen la proteína de inserción de TITEh γ y/o la proteína
de inserción de TITEh σ o células presentadoras de antígenos que han procesado la proteína de inserción de TITEh
γ y/o la proteína de inserción de TITEh σ que ocurren de forma natural. Del mismo modo, puede determinarse la
especificidad de las células T inducidas in vivo por la vacunación con el polipéptido de inserción de TITEh γ y/o de
TITEh σ.
Análisis de la respuesta de las células T in vitro
Es necesario determinar si las líneas de células tumorales que expresan el TITEh de inserción γ y/o el TITEh de
inserción σ pueden ser matadas por los clones de las células T obtenidas de la sangre periférica de pacientes con
carcinomas después de la vacunación con un polipéptido de inserción de TITEh γ y de inserción de TITEh σ. Los
clones de las células T se obtienen después de donar los blastos de las células T presentes en las células mononucleares
de sangre periférica (CMSP) de un paciente con carcinoma después de la vacunación con un polipéptido de inserción
de TITEh γ y/o de inserción de TITEh σ. El protocolo de vacunación con el polipéptido incluye varias inyecciones
intracutáneas in vivo de polipéptidos con FEC-GM u otro adyuvante utilizado de forma común. Se lleva a cabo el
donado de las células T mediante la introducción de 5 blastos de células T que dan respuesta en cada pocillo de unas
placas Terasaki. Cada pocillo contiene 2 x 104 CMSP autólogas irradiadas (30 Gy) como células de alimentación. Las
células se propagan con el polipéptido candidato de inserción de TITEh γ y/o de inserción de TITEh σ a 25 µM y 5
U/ml de interleuquina-2 recombinante (rIL-2) (Amersham, Aylesbury, UK) en un volumen total de 20 ml. Después de 9
días, los clones de las células T se transfieren en unas places de 96 pocillos con fondos llanos (Costar, Cambridge, MA)
con 1 mg/ml de fitohemaglutinina (PHA, Wellcome, Dartford, UK), 5 U/ml de rIL-2 y CMSP alogénicas irradiadas
(30 Gy) (2 x 105 ) por pocillo como células de alimentación. Los clones en crecimiento se expandieron más en placas
de 24 pocillos con PHA/rIL-2 y 1 x 106 de CMSP alogénicas irradiadas como células de alimentación y se ensayaron
para especificidad polipeptídica después de 4 a 7 días.
Los clones de las células T se seleccionan para una caracterización adicional. Se determinó el fenotipo de la
superficie de la célula para averiguar si el clon de la célula T es CD4+ o CD8+. El clon de la célula T se incubó con
dianas de células tumorales autólogas a diferentes relaciones de efector a diana para determinar si se produce la lisis de
las células tumorales. La lisis indica que la célula T tiene reactividad dirigida contra un antígeno derivado del tumor,
por ejemplo, la proteína de inserción de TITEh γ y/o la proteína de inserción de TITEh σ.
Correlación entre los polipéptidos y fragmentos de inserción TITEh in vivo
Con tal de verificar que el antígeno reconocido se asocia con la proteína de inserción de TITEh γ o la proteína
de inserción de TITEh σ, y para identificar la molécula de ALH de clase I o de clase II que presenta el putativo
polipéptido de inserción de TITEh γ o de TITEh σ al clon de la célula T, diferentes líneas de células tumorales que
expresan la proteína de inserción de TITEh γ o de TITEh σ y que llevan una o más moléculas de ALH de clase I o
de clase II en común con los del paciente se utilizan como células diana en los ensayos de citotoxicidad. Las células
diana se marcan con 51 Cr o 3 H-timidina (9,25 x 104 Bq/mL) durante la noche, se lavan una vez y se introducen en los
pocillos a una concentración de 5000 células por pocillo en placas en 96 pocillos. Las células T se añaden a relaciones
12
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5
de efector a diana diferentes y las placas se incuban durante 4 horas a 37◦ C y se cosechan antes del recuento en un
contador de centelleo líquido (Packard Topcount). Por ejemplo, la línea de carcinoma de la vejiga T24 (12Val+ , ALHA1+ , B35+ ), la línea de células de melanoma FMEX (12Val+ , ALH-A2+ , B35+ ) y la línea de carcinoma del colon SW
480 (12Val+ , ALH-A2+ , B8+ ) o cualquier otra línea de células tumorales positivas para la telomerasa pueden utilizarse
como células diana. Una línea de células apropiada que no exprese la proteína de inserción de TITEh γ o de TITEh
σ puede utilizarse como control, y no debe lisarse. La lisis de una línea de células en particular indica que el clon de
la célula T a ensayar reconoce un epitopo de inserción de TITEh γ o el epitopo de inserción de TITEh σ procesado
endógenamente en el contexto del subtipo de la molécula de ALH de clase I o de clase II que se expresa en dicha línea
de células.
10
Caracterización de los clones de las células T
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La restricción por moléculas de ALH de clase I o de clase II de un clon de células T puede determinarse mediante
experimentos de bloqueo. Pueden usarse los anticuerpos monoclonales contra los antígenos de ALH de clase I, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ALH de clase I panreactivo W6/32, o contra antígenos de clase II, por ejemplo,
anticuerpos monoclonales dirigidos contra los antígenos de ALH de clase II DR, DQ y DP (B8/11, SPV-L3 y B7/21).
La actividad del clon de la célula T contra la línea de células tumorales autólogas se evalúa con anticuerpos monoclonales dirigidos contra las moléculas de ALH de clase I y de clase II a una concentración final de 10 µg/ml. Los
ensayos se ponen a punto tal como se ha descrito anteriormente por triplicado en placas de 96 pocillos y las células
diana se preincuban durante 30 minutos a 37◦ C antes de la adición de las células T.
La especificidad fina del clon de la célula T puede determinarse con experimentos de polipéptidos pulsados. Para
identificar el polipéptido de inserción de TITEh γ o el polipéptido de inserción de TITEh σ que realmente es reconocido por un clon de células T, se ensaya con una serie de polipéptidos nonámeros. Se introducen fibroblastos autólogos
eluídos con un ácido débil y marcados con 51 Cr o 3 H-timidina a una concentración de 2500 células por pocillo en
placas de 96 pocillos y se pulsan con los polipéptidos a una concentración de 1 µM junto con b2-microglobulina (2,5
µg/mL) en un incubador con CO2 al 5% a 37◦ C antes de la adición de las células T. Los ensayos se ponen a punto
por triplicado en placas de 96 pocillos y se incuban durante 4 horas con una relación de efector a diana de 5 a 1.
Los controles pueden incluir el clon de las células T cultivado solo, con CPA en ausencia de polipéptidos o con un
polipéptido MART-1/Melan-A asociado con un melanoma irrelevante.
Puede utilizarse también un protocolo alternativo para determinar la especificidad fina de un clon de células T.
En este protocolo alternativo, la línea de células deficiente en TAP T2 se utiliza como las células presentadoras de
antígenos. Esta línea de células expresa sólo cantidades pequeñas del antígeno ALH-A2, pero niveles elevados de
antígenos de ALH de clase 1 en la superficie de la célula pueden inducirse mediante la adición de b2-microglobulina.
Las células diana marcadas con 3H se incuban con los diferentes polipéptidos a ensayar y los polipéptidos de control
a una concentración de 1 µM junto con b2-microglobulina (2,5 µg/mL) durante una hora a 37◦ C. Después de pulsar el
polipéptido, las células diana se lavan extensivamente, se recuentan y se introducen en los pocillos de la placa a 2500
células por pocillo en placas de 96 pocillos antes de la adición de las células T. Las placas se incuban durante 4 horas
a 37◦ C en CO2 al 5% antes de la cosecha. Los controles incluyen clones de las células T cultivados solos o con las
células diana en ausencia de los polipéptidos. Los ensayos se pusieron a punto por triplicado en placas de 96 pocillos
con una relación de efector a diana de 20 a 1.
La sensitividad del clon de las células T a un polipéptido en particular identificado anteriormente puede determinarse también usando un experimento de respuesta a dosis. Fibroblastos sensibilizados al polipéptido pueden usarse
como células diana. Las células diana se pulsan con el péptido en particular para una determinación fina de especificidad tal como se ha descrito anteriormente, salvo que los péptidos se añadan a concentraciones diferentes antes de
la adición de las células T. Los controles incluyen las células diana solas y las células diana pulsadas con el péptido
Melan-A/Mart-1 asociado al melanoma irrelevante.
Inducción y proliferación de la respuesta de células T humanas al péptido de inserción de TITEh σ
En este experimento, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de cuatro donantes humanos sanos
(donantes “14328”, “14313”, “23244” y “23255”) se aislaron y se cebaron durante siete días con células dendríticas
pulsadas con el péptido de la SEQ ID. N◦ 11 derivado del polipéptido de inserción de TITEh σ, seguido de dos ciclos
que consistían en siete días de re-estimulación con las CMSP autólogas pulsadas con el péptido. Las células dendríticas
se derivaron de los monocitos de la sangre periférica. Las células T del cultivo a granel resultante se ensayaron por
triplicado con o sin las células presentadoras de antígenos (CPA) pulsadas con los péptidos antes de la cosecha después
de 3 días. Para medir la capacidad proliferativa de los cultivos, se añadió 3 H-timidina (3,7 x 104 Bq/pocillo) al cultivo
durante la noche antes de la cosecha. Los cultivos con las CPA no pulsadas o sin las CPA actuaron como controles.
Los resultados que muestran la capacidad proliferativa de los cultivos se presentan en la figura 7. Detalles adicionales
del protocolo utilizado se presentan abajo.
Los clones de las células T se obtuvieron de los cultivos a granel resultantes de los donantes 14313 y 23255. Los
clones se obtuvieron de los blastos de las células T en las CMSP tal como se ha descrito en la sección “Análisis de
la respuesta de las células T in vitro”. Los resultados de la proliferación de los clones de las células T con células
presentadoras de antígenos pulsadas con péptidos y no pulsadas con péptidos se presentan en la figura 8 (donante
14313) y la figura 9 (donante 23255).
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Los resultados en las figuras 7, 8 y 9 se presentan como recuento medio por minuto (rmm) de las mediciones
por triplicado. Los datos indican que la sangre de humanos contiene células T circulantes específicas para un péptido
(SEQ ID. N◦ 11) derivado de un péptido que se deriva de un polipéptido de inserción de TITEh σ, y además que dichas
células T pueden expandirse in vitro después de la estimulación con el péptido relevante.
5
10
Así, los experimentos de las figuras 7, 8 y 9 muestran que el polipéptido de inserción de TITEh σ es inmunogénico
en los humanos. Una estimulación in vitro (o in vivo) puede proporcionar respuestas de las células T específicas a
la proteína de inserción de TITEh σ con la potencial de reconocer el mismo antígeno cuando se sobreexpresa en un
tumor que crece en un paciente con cáncer. Este experimento en particular demuestra que, en un principio, el péptido
de la SEQ ID. N◦ 11 podría desarrollarse como una vacuna contra el cáncer en humanos.
Protocolo de inducción de respuesta de las células T limitada a CPH de clase II
Día 0
15
20
Las CMSP se separaron de 50 ml de sangre (de la capa leucocítica). Las células se contaron y se re-suspendieron
en RPM1-1640 completo/suero de combinación al 15%.
Se pusieron a punto cultivos a granel con 1-2 pocillos de CMSP a 2 x 106 células/ml en 1-1,5 ml en una placa de
24 pocillos. Se añadieron 25 µM del péptido de la SEQ ID. N◦ 11 derivado del polipéptido de inserción de TITEh σ.
Días 9-10
25
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Se cosecharon los cultivos a granel y se estimularon con CMSP irradiadas y péptido. Si existía una alta muerte
celular, los cultivos se separaron mediante Lymphoprep o, en el caso contrario, se contaron y se re-suspendieron en
RPM1-1640 completo/suero de combinación al 15%. (La centrifugación de Lymphoprep de cultivos a granel se lleva
a cabo en tubos Falcon de 15 ml mediante 1; la adición de 8 ml de suspensión celular, y 2; revestimiento con 2 ml de
Lymphoprep; centrifugar a 150 rpm durante 30 minutos y lavar dos veces con agua salada). Se descongeló un vial de
CMSP autólogas, éstas se lavaron, se contaron y se re-suspendieron en RPMI/FCS al 15%. Las CMSP se irradiaron
(25 GY, 5 minutos 58 segundos). Las células se introdujeron en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Se estimularon
0,5-2,0 x 106 células T de los cultivos a granel con 1 x 106 células de alimentación irradiadas (CMSP) y 25 µM del
péptido de la SEQ ID. N◦ 11. El volumen final fue 1 ml.
Se añadió IL-2 (10 U/ml). También se añadió más medio si se precisó, reemplazando la mitad del volumen. Se
dividieron los cultivos cuando fue necesario.
35
Día 17
Las células T en el cultivo a granel se re-estimularon tal como ya se había hecho en el día 10, con CMSP autólogas
irradiadas y el péptido de la SEQ ID. N◦ 11.
40
Día 19
Se añadió IL-2 (10 U/ml) a los cultivos a granel re-estimulados del día 17.
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Día 24
Se puso a punto un experimento de proliferación para ensayar las células T por su especificidad peptídica en placas
de 96 pocillos, cada condición por triplicado.
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En el día 2-3 del ensayo de proliferación, se añadió 3 H-timidina, y se incubó a 37◦ C durante la noche antes de la
cosecha.
En una variante del protocolo (tal como se utilizó en el ejemplo anterior), las CMSP se cebaron en el día 0 con
células dendríticas pulsadas con el péptido de la SEQ ID. N◦ 11.
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REIVINDICACIONES
5
1. Un polipéptido para uso en medicina, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de la SEC ID. N◦ 3, 4, 5
ó 6, y siendo dicho polipéptido capaz de inducir una respuesta de las células T.
2. Un polipéptido para uso en medicina según la reivindicación 1, en donde el polipéptido no precisa una división
intracelular para encajarse en una ranura de unión de CPH o ALH y tiene una longitud de 12 a 25 aminoácidos.
10
3. Un polipéptido para uso en medicina según la reivindicación 1 ó 2, en donde la respuesta de las células T
aumenta el número y/o la actividad de las células T cooperadoras o citotóxicas.
4. Una molécula de ácidos nucleicos para uso en medicina, en donde la molécula de ácidos nucleicos:
15
a) tiene una cadena que codifica un polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3;
b) tiene una cadena que es complementaria a una cadena tal como se ha descrito en a) anteriormente; o
20
c) tiene una cadena que forma un híbrido bajo condiciones estrictas con una molécula tal como se ha descrito
en a) o b) anteriormente.
5. Un vector o una célula para uso en medicina que comprende una molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 4 en forma recombinante.
25
30
6. Un linfocito T para uso en medicina, en donde el linfocito T es capaz de matar a una célula que expresa un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de cooperar en matar semejante célula.
7. El uso de un polipéptido tal como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico tal
como se ha descrito en la reivindicación 4, o un vector o una célula tal como se ha descrito en la reivindicación 5, en la
preparación de un medicamento para tratar el cáncer, o en la preparación de un sistema diagnóstico para diagnosticar
el cáncer.
8. El uso según la reivindicación 7, en donde el cáncer es un cáncer mamífero.
35
40
9. El uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer es un cáncer humano.
10. El uso según cualquiera de las reivindicación 7 a 9, en donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de la
próstata, cáncer pancreático, cáncer del colon o recto, cáncer del pulmón, melanoma maligno, leucemia, linfoma,
cáncer de ovario, cáncer cervical, o carcinoma del tracto biliar.
11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el medicamento es una vacuna.
45
12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el sistema diagnóstico viene en forma de un
equipo.
13. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico tal como se describe en la reivindicación 4, o un vector o una célula tal como se
describe en la reivindicación 5.
50
55
60
14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13 que comprende adicionalmente un polipéptido capaz
de inducir una respuesta de las células T dirigida contra un polipéptido producido por un oncogen o contra una proteína
de supresión tumoral mutante, o un ácido nucleico que codifica semejante polipéptido.
15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 14, en donde dicho oncogen o proteína de supresión
tumoral mutante es p21-ras, Rb, p53, abl, gip, gsp, ret o trk.
16. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 13 a 15, que comprende un vehículo, diluyente,
aditivo, estabilizador, y/o adyuvante farmacéuticamente aceptables, opcionalmente incluyendo dicha composición o
preparación combinada uno o más de una citoquina o un factor de crecimiento.
17. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que es una vacuna.
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> GemVaxAS
5
<120> Polipéptidos
<130> SJWI58035
10
<160> 11
<170> PatentIn versión 3.1
15
20
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
25
30
35
Ala Glu Glu Asn Ile Ser Val Val Thr Pro Ala Val Leu Gly Ser Gly
1
5
10
15
Gln Pro Glu Met Glu Pro Pro Arg Arg Pro Ser Gly Val Gly Ser Phe
20
25
30
Pro Val Ser Pro Gly Arg Gly Ala Gly Leu Gly Leu
35
40
<210> 2
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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45
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60
65
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Val Ala Val Leu Trp Phe Asn Phe Leu Phe Lys Gln Lys Pro Ser Val
1
5
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Ser Pro Arg Gly
20
<210> 4
1
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<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
5
<400> 4
10
15
20
Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Val Ala Val Leu Trp Phe Asn
1
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Phe Leu Phe Lys Gln Lys Pro Ser Val Ser Pro Arg Gly
20
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<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Phe Leu Phe Lys Gln Lys Pro Ser Val
1
5
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<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
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Arg Val Ala Val Leu Trp Phe Asn Phe Leu Phe Lys Gln Lys Pro Ser
1
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Val Ser
<210> 7
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
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gcctccctct gctactccat cct
23
<210> 8
<211> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
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cgtctagagc cggacactca gccttca
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<210> 9
<211> 22
<212> ADN
<213> Homo sapiens
2
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<400> 9
gccaagttcc tgcactggct ga
5
10
22
<210> 10
<211> 26
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
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gctctagaac agtgccttca ccctcg
26
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
25
Arg Val Ala Val Leu Trp Phe Asn Phe Leu Phe Lys Gln Lys Pro Ser
1
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Val Ser Pro Arg Gly
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3