Presentación Final

Comparación de metodologías para la determinación de toxinas
paralizantes en bivalvos relacionadas con el Paralytic Shellfish
Poisoning (PSP). Aplicación a la acuicultura en España
Duración del proyecto: 3,5 años.
2007 financiación para inicio actividad
2008 – 2010, período de ejecución del proyecto.
2011‐ Prórroga de 6 meses
2012 – Informe Final
23 investigadores
3 subproyectos:
Andalucía
L.C.C.R.P. – Junta de Andalucía
Cataluña
IRTA (Coordinación)
Departament de Salut Pública
ICM – CSIC
Galicia
CIMA
INTECMAR
CSIC IIM – IEO
Sanidad Exterior
Contexto y objetivos
PSP
•Reglamento 854/2004 establece 800 μg eqSTX/Kg como límite máximo.
•Reglamento 2074/2005 establece el Bioensayo ratón (MBA) como método oficial; aunque se aceptan métodos alternativos si se demuestra su eficacia.
•Directiva 86/609/CEE referente a los animales de experimentación
•Reglamento 1664/2006 se menciona como método alternativo el HPLC con derivatización pre‐columna(Lawrence); AOAC 2005.06
Nombre
Abreviatura
Toxicidad relativa
MU/μmol
(MBA)
Saxitoxina
Alexandrium tamarensis
Alexandrium minutum
Alexandrium catenella
Alexandrium fraterculus
Alexandrium fundyense
Alexandrium cohorticula
Alexandrium andersonii*
Gymnodinium catenatum
Pyrodinium bahamense
STX
2483
1.0000
Gonyautoxina‐2
GTX2
892
0.3592
Gonyautoxina‐3
GTX3
1584
0.6379
Neosaxitoxina
NEO
2295
0.9243
Gonyautoxina‐1
GTX1
2468
0.9940
Gonyautoxina‐4
GTX4
1803
0.7261
Gonyautoxina‐5
GTX5, B1
160
0.0644
N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐2
C1, epiGTX8
15
0.0060
N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐3
C2, GTX8
239
0.0963
Gonyautoxina‐6
GTX6, B2
160
0.0644
N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐1
C3
33
0.0133
N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐4
C4
143
0.0576
dcSTX
1274
0.5131
Decarbamoylonyautoxina‐2
dcGTX2
382
0.1538
Decarbamoylonyautoxina‐3
dcGTX3
935
0.3766
Decarbamoylneosaxitoxina
dcNEO, GTX7
Decarbamoylonyautoxina‐1
dcGTX1
Decarbamoylonyautoxina‐4
dcGTX4
Decarbamoylsaxitoxina
Sector Necesidad
Sector Necesidad
Análisis obligatorios
Aplicación de reglamentos
2007
219.661,05 Tn moluscos
3.900 análisis PSP
Galicia
215.488,17 Tn moluscos
> 3.000 análisis PSP
Seguridad del producto
Fiabilidad del sector
Exportación
Cataluña
3.341,78 Tn moluscos
> 300 análisis PSP
Andalucía
4450 Tn moluscos
> 600 análisis PSP
Metodologías
Métodos oficiales
Comparación
De
Métodos
Oficiales / No oficiales
Toxicológicios / Anticuerpos / Análiticos
Cuantitativos / Cribado
Bioensayo ratón
HPLC con derivatización pre‐columna
Métodos no oficiales
HPLC con derivatización post‐
columna
LC‐MS/MS
Kits comerciales (screening)
Citotoxicidad
Resultados Episodios
Molusco
Fecha
prohibición
Fecha
apertura
Total días
Mejillón batea
23/06/2008
07/07/2008
14
Camariñas
Infaunal
24/06/2008
08/07/2008
14
Vigo IV.1
Infaunal
17/06/2008
26/06/2008
9
Vigo IV.2
Infaunal
19/02/2008
05/03/2008
14
Vigo IV.2
Infaunal
03/06/2008
18/07/2008
45
Vigo IV.2
Infaunal
26/08/2008
10/09/2008
15
Ría/Zona
Gymnodinium catenatum
aparece en el litoral atlántico de la provincia de Cádiz entre los meses de agosto y diciembre, con máximos centrados casi exclusivamente en agosto
Baiona
Especie
fitoplancton
Alexandrium
sp.
Alexandrium
sp.
Alexandrium
sp.
Alexandrium
sp.
Alexandrium
sp.
Alexandrium
sp.
Relación de prohibiciones por toxicidad PSP en zonas de producción de moluscos infaunales y mejillón cultivado en viveros flotantes de Galicia en el 2008.
Especie de
fitoplancton
Molusco
Ría
Periodo
Total días
A. minutun
Infaunal
Ares-Betanzos
junio
30
A. minutun
Infaunal
Camariñas
julio
28
A. minutun
Berberecho
Baiona
VIGO-IV.2
junio-septiembre
88
En la siguiente tabla se resumen los episodios de cierre debidos a toxinas PSP en 2010. Todos han sido debidos a Alexandrium minutum.
Resultados cultivos, muestras, exposiciones mar, exposiciones laboratorio
Molusco
Balones de cultivo de 8 L con Alexandrium minutum.
IEO
IRTA
INTECMAR
Almeja (blanco)
Si
Si
Si
Almeja nivel 420 µg/Kg
Si
Si
Si
Almeja nivel 950 µg/Kg
Si
Si
Si
Berberecho blanco
Si
No
Si
Berberecho nivel 450 µg/Kg
Si
No
Si
Berberecho nivel 1270 µg/Kg
Si
No
Si
Vieira (blanco)
Si
No
Si
Longueirón (blanco)
Si
No
Si
Relación de moluscos naturalmente contaminados con PSP en episodios
de Alexandrium sp.
Sala de “challenge” en la que se realizó la primera exposición en laboratorio
X
Localización de los puntos de
exposición de los bivalvos durante la
floración de A. minutum ocurrida en el
puerto de Vilanova i la Geltrú entre el 8
y el 11 de abril de 2008.
X
%
A.fundyense(CCMP1719)
35
30
25
20
15
10
5
0
ng μL-1
Puerto
GTX4
GTX1
dcGTX3 dcGTX2 neoSTX
STX
toxinas
Se muestra el perfil de toxinas y abundancia de las mismas en porcentaje para la cepa CCMP1719 de Alexandrium fundyense.
Vilanova i
la Geltrú
Vilanova i
la Geltrú
Cambrils
Bivalvo
Mejillón
Ostión
Mejillón
Ostión
Mejillón
Ostión
Almeja
GTX4
GTX1
GTX2
GTX3
0,62
0,16
0,37
0,00
0,00
0,00
3,23
0,66
0,24
0,24
0,01
0,02
0,00
0,00
0,48
0,14
0,24
0,01
0,00
0,00
0,00
0,03
0,01
0,01
0,00
0,00
0,00
0,01
μg STXeq
kg-1
2.702,71
849,12
1.256,91
30,55
45,90
1,46
*4.926,41
Resultados MBA , MIST AlertTM, cultivos celulares
Bioensayo ratón: Método AOAC Official Method 959.08. Paralytic Shellfish Poison. Biological Method. MIST AlertTM: Puede dar falsos positivos en valores cercanos al LMP. (Izquierda). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX. (Derecha). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX con paso adicional de purificación por columna C18.
Resultados Extracciones, LC‐MS/MS
En la fase de preparación de
muestras a partir de moluscos
nos encontramos con un paso
de limpieza no resuelto
actualmente y que limita en
gran medida la duración de las
columnas además de la
habitual presencia de
interferentes no tóxicos.
Análisis de una muestra de Argopecten
purpuratus conteniendo STX, GTX2 y GTX3, por
el método de LC-MS/MS
Es necesario el desarrollo de métodos de
preparación de la muestra adaptados a tanto a
las condiciones cromatográfica (HILIC) como a
las de ionización en el espectrómetro de masas
(ESI), antes de que se pueda utilizar para el
control rutinario de la toxicidad de bivalvos.
Resultados HPLC Pre‐Columna, HPLC Post‐Columna
Pre Columna abreviado
Aplicable con perfiles de
Alexandrium en el
Mediterráneo.
Extracción
Post Columna
Andalucía
Aplicable pero tiempo excesivo
Purificación SPE-C18
Oxidación con periodato
Análisis por HPLC-FLD
AOAC HPLC
Method 2005.06
Presencia picos
No hay picos
Ensayo MBA
Muestra NEGATIVA
Resultados Aplicabilidad Tiempo Costes REVISAR DADES INTECMAR
Tiempo de ejecución del ensayo /análisis
por muestra.
Tiempo de muestra (h)
MBA
HPLC‐Pre
HPLC‐
Pos *
Jellet
Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros
3,7
‐
12,3
2,2
Galicia: Intecmar
1,5
3,5
‐
Galicia: Centro de Investigacións Mariñas ‐
‐
2,1
‐
Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries
‐
1,0
‐
0,5
2,2
‐
‐
1,4
Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona
Coste de ejecución del ensayo /análisis
por muestra.
Coste muestra (euros)
MBA
HPLC‐Pre
HPLC‐
Pos*
Jellet
Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros
105,8
‐
392,7
96,6
Galicia: Intecmar
25,66/ 40,83
59,35
‐
‐
Galicia: Centro de Investigacións Mariñas ‐
‐
144,2
‐
Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries
‐
116,6
‐
47,5
249,6
‐
‐
118,6
Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona
Resultados Adecuación por Autonomías, Futuro
Andalucía: Bioensayo ratón
Posible HPLC Post Columna pero requerimiento de infraestructuras complejas
Galicia: Bioensayo ratón
HPLC Post Columna representaría incremento de costes y nuevas inversiones
Cataluña: Bioensayo ratón actualmente
Posibilidad en un futuro: HPLC Pre Columna como screening
Secundado por Bioensayo ratón
Conclusiones Impacto Sector
Algunas conclusiones:
Consolidación de una red de laboratorios con acceso a diferentes metodologías que fortalece el potencial en España ante episodios por toxinas potencialmente conflictiivos
Los perfiles toxínicos segúna las zonas de estudio pueden condicionar la eleccción de una metodología u otra adaptada a la región.
La mejora e implementación de diferentes metodologías cromatográficas para el análisis de toxinas PSP aporta mayor resolución y definición de las toxinas paralizantes presentes, favoreciendo la predicción de potenciales eventos.
Se identifican estrategias de screnning complementadas con protocolos de cuantificación de toxinas, y potencial aplicabilidad en Cataluña. En las otras comunidades a corto plazo no se preven cambios en cuanto a metodología de análisis.
Sector:
Los laboratorios de control disponen de mayores informaciones para toma de decisiones respecto a estrategias de vigilancia de toxinas PSP
En circunstancias controladas los kits de Jellett podrían ser utilizados por el sector con la limitación de la existencia de algunos falsos positivos en presencia de toxinas PSP por debajo del MLP