fiebre del valle del rift

CAPÍTULO 2.1.14.
FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT
RESUMEN
La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoonosis aguda o hiperaguda de los rumiantes domésticos
de África. Está causada por un único serotipo de un bunyavirus del género Phlebovirus que es
transmitido por los mosquitos. La enfermedad se presenta en condiciones climáticas que favorecen
la reproducción de los mosquitos vectores y se caracteriza por las lesiones hepáticas. La
enfermedad es más grave en las ovejas, las cabras y el ganado bovino, en los que origina abortos
en los animales gestantes y una alta tasa de mortalidad de los recién nacidos. Los animales
adultos no gestantes, aunque son susceptibles a la infección, son más resistentes a las
manifestaciones clínicas de la enfermedad. Existe una amplia variación en la susceptibilidad a la
FVR entre los animales de distintas razas. Aquellas razas o cepas que son exóticas en África o
que proceden de áreas donde la FVR no es endémica tienden a ser más susceptibles. Los
camellos sufren una infección asintomática por la FVR, pero la tasa de abortos puede ser tan alta
como en el ganado bovino. Entre los rumiantes, la búfala también aborta durante la infección
asintomática con la FVR.
Los humanos resultan sensibles a la infección mediante el contacto con material infectado o por las
picaduras de los mosquitos. La infección humana por vectores es una característica llamativa en
países con una población relativamente pequeña de animales hospedadores. En tales áreas, la
FVR puede manifestarse en primer lugar en los humanos. Ha causado una enfermedad grave en el
personal de laboratorio y debe ser manejada con un alto nivel de bioseguridad. Se recomienda que
el personal de laboratorio esté vacunado.
Identificación del agente: el virus de la FVR representa un único serotipo de un bunyavirus del
género Phlebovirus y tiene las propiedades morfológicas y fisicoquímicas típicas de los bunyavirus.
El virus se puede aislar de la sangre, recogida preferentemente con anticoagulante, durante la fase
febril de la enfermedad, o del hígado, el bazo y los tejidos cerebrales de los animales muertos o de
los órganos de los fetos abortados. Los aislamientos primarios se hacen normalmente en cultivos
celulares de varios tipos, tales como células de riñón de mono verde africano (células Vero),
células de riñón de hámster neonato, retículo de embrión de pollo o en células primarias de origen
ovino o bovino. Alternativamente, para el aislamiento primario del virus, se pueden utilizar
hámsteres, ratones adultos o lactantes, huevos de gallina embrionados o corderos de dos días de
edad.
Se puede efectuar un diagnóstico rápido utilizando como antígeno el sobrenadante de las
muestras homogenizadas en pruebas de neutralización vírica (NV); mediante la tinción
inmunofluorescente de frotis de hígado, bazo, cerebro o cultivos celulares infectados; o mediante la
demostración del virus en el suero tomado durante la fase febril de la enfermedad por medio del
enzimoinmunoensayo o la inmunodifusión.
La presencia de lesiones histopatológicas características en el hígado sirve de ayuda para el
diagnóstico.
Pruebas serológicas: Los animales infectados desarrollan anticuerpos específicos que pueden
ser demostrados mediante la NV a los 3 días de la infección o mediante el enzimoinmunoensayo a
los 6–7 días, y mediante la inhibición de la hemoaglutinación. Otras pruebas serológicas menos
usadas incluyen la inmunofluorescencia, la fijación de complemento y la inmunodifusión.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: Las vacunas con virus vivos y los
antígenos para el uso en países donde la FVR es endémica o en otros durante los brotes
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epidémicos, deben prepararse a partir de cepas no patógenas del virus de la FVR crecidas en
cultivos celulares de ratón o atenuadas por mutación. La cepa de la FVR atenuada por mutación se
encuentra todavía en una fase en la que no se recomienda su utilización.
En los países que están libres del virus de la FVR, las vacunas y las pruebas de diagnóstico deben
limitarse a aquellas en las que se utiliza el virus inactivado. Se pueden obtener cepas adecuadas
del virus en el laboratorio de referencia para la FVR de la OIE (véase el cuadro presentado en la
parte 3 de este Manual).
A. INTRODUCCIÓN
El virus de la FVR consta de un único serotipo de bunyavirus del género Phlebovirus y tiene las propiedades
morfológicas y físico-químicas típicas de los bunyavirus. El virus tiene una envoltura, es esférico, con un diámetro
de 80–120 nm. Unas espículas cortas de glicoproteína sobresalen de una envoltura lipídica de doble capa, y el
virus se inactiva fácilmente con disolventes de lípidos cuando el pH es inferior a 6. El virus tiene un genoma
segmentado con ARN de cadena única y polaridad negativa y consta de tres segmentos: L (grande), M (medio) y
S (pequeño), cada uno de los cuales está contenido en una nucleocápsida separada dentro del virión. El
segmento S es un ARN de doble sentido, es decir, presenta una codificación bidireccional (12).
La Fiebre del Valle del Rift (FVR) es una enfermedad febril zoonósica aguda o hiperaguda, transmitida por los
mosquitos, y causada por un virus de la familia Bunyaviridae, género Phlebovirus. Normalmente se presenta en
forma epizoótica en áreas extensas de un país después de fuertes lluvias e inundaciones, y se caracteriza por
las altas tasas de abortos y de mortalidad neonatal, principalmente en las ovejas, las cabras y el ganado bovino.
La susceptibilidad a la FVR varía considerablemente de unas razas a otras. Algunos animales autóctonos de
África muestran solo infecciones asintomáticas, mientras que los foráneos o los de otras razas sufren una
sintomatología clínica grave con mortalidad y aborto. Los animales susceptibles no gestantes y de mayor edad y
algunas otras especies, no muestran los síntomas de la enfermedad. Con frecuencia se ha relacionado a los
camellos con las epidemias de la FVR en el este de África y en Egipto. La enfermedad clínica no aparece en los
camellos adultos, pero se presentan abortos y se han observado algunas muertes postnatales tempranas.
Los síntomas de la enfermedad suelen ser poco específicos, lo que hace difícil el reconocimiento de los casos
individuales (8, 11, 13, 22, 34) durante la epidemia; sin embargo, es típica la existencia de numerosos abortos y
de mortalidad entre animales jóvenes, así como la enfermedad en los humanos. La FVR tiene un período de
incubación corto: 12–36 horas en los corderos. Puede aparecer una fiebre bifásica de hasta 41°C, y esta
permanece alta hasta poco antes de la muerte. Los animales afectados muestran anorexia y postración y pueden
presentar inflamación de los nódulos linfáticos superficiales y dolor abdominal. Los corderos raramente
sobreviven más de 36 horas tras la aparición de los síntomas de la enfermedad. Los animales mayores de
2 semanas pueden morir con manifestaciones agudas o hiperagudas, o desarrollar una infección asintomática.
Algunos animales pueden regurgitar la ingesta y presentar una diarrea hemorrágica o sanguinolenta de olor
nauseabundo junto con una rinorrea mucopurulenta con restos de sangre. A veces se puede observar la
presencia de ictericia, especialmente en los bóvidos. Además de estos síntomas, el ganado adulto puede
presentar lagrimeo, salivación y falta de producción láctea. En las ovejas gestantes, la mortalidad y la frecuencia
del aborto varían del 5% al casi 100% en diferentes brotes y en diferentes manadas. La tasa de mortalidad en el
ganado vacuno es normalmente inferior al 10%.
Las lesiones hepáticas de la FVR son muy similares en todas las especies, variando principalmente según la
edad del individuo infectado (9). Las lesiones más notables se presentan en los fetos abortados y en los corderos
recién nacidos, y consisten en un incremento moderado o grande del tamaño del hígado, que se presenta blando
y sin consistencia, con un color que varía del marrón amarillento al marrón rojizo y con manchas irregulares
debidas a la congestión. En el parénquima, siempre se presentan numerosos focos necróticos de color blanco
grisáceo, que pueden no ser fácilmente discernibles. En la oveja adulta, las lesiones son menos graves y
aparecen focos necróticos de color rojizo o blanco grisáceo distribuidos por todo el parénquima. Por lo general, la
pared de la vesícula biliar presenta hemorragias y edema. Las lesiones hepáticas en los corderos se acompañan
casi siempre de numerosas hemorragias pequeñas en la mucosa del rumen. El contenido del intestino delgado y
del rumen es de color chocolate oscuro debido a la presencia de sangre digerida de forma parcial. En todos los
animales, el bazo y los nódulos linfáticos periféricos se inflaman, están edematosos y pueden presentar
petequias.
La lesión más evidente de la FVR visualizada en el microscopio, tanto en los animales como en los humanos, es
la necrosis hepática. En los fetos y neonatos del ganado vacuno y ovino, los focos necróticos consisten en
agregados densos de restos celulares y nucleares, algo de fibrina y unas cuantas células inflamadas. Existe una
importante necrosis lítica en la mayoría de los hepatocitos desapareciendo la arquitectura normal del hígado. En
casi el 50% de los hígados afectados, se encuentran cuerpos de inclusión intranuclear que son eosinófilos y
ovales o bacilares. También se observa una mineralización de los hepatocitos necrosados. En los animales
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adultos, la necrosis hepática es menos difusa, y la ictericia es más frecuente en las ovejas que en los corderos
(32).
En los humanos, las infecciones por la FVR son normalmente asintomáticas o asociadas a unas manifestaciones
no fatal similares a la gripe que varía de moderada a grave (19, 21). Una minoría de los pacientes puede
desarrollar lesiones oculares, encefalitis o una enfermedad hepática grave con hemorragias que, por lo general,
es fatal. En los humanos, el virus de la FVR ha causado una infección grave entre el personal de laboratorio. Ese
personal debe ser vacunado y trabajar con un nivel 3 de contención, en condiciones de un nivel 4 de contención,
o llevar protección respiratoria. Se necesita tener un cuidado especial cuando se trabaja con los animales
infectados o cuando se realizan manipulaciones post mórtem (véase el capítulo 1.1.2. Bioprotección y seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales).
No se ha demostrado ninguna diferencia antigénica significativa entre los aislamientos de la FVR y las cepas
cultivadas en los laboratorios de muchos países, pero se han hallado diferencias relacionadas con la
patogenicidad (5, 33).
La infección de los humanos por mediación de los mosquitos vectores es una característica propia de los países
que, como Egipto, tienen una población relativamente escasa de animales hospedadores y una gran población
de mosquitos.
La FVR se presenta normalmente como una epizootia en África, y puede afectar de forma simultánea a varios
países de ese continente. Estas manifestaciones se producen tras los ciclos periódicos de lluvias
excepcionalmente fuertes, que pueden ocurrir muy raramente en las zonas semiáridas (ciclos de 25–35 años), o
más frecuentemente (ciclos de 5–15 años) en las praderas de la sabana. En los períodos que transcurren entre
las epizootias puede presentarse un nivel bajo de la FVR, que puede ser indetectable. Se debe sospechar de la
existencia de la FVR cuando a las lluvias extraordinariamente fuertes les sigue la presentación de abortos junto
con una enfermedad fatal caracterizada por la necrosis y las hemorragias hepáticas, que afecta sobre todo a los
corderos, los cabritos y los terneros, y que es paralela a la aparición de una enfermedad semejante a la gripe en
los trabajadores de las granjas y en el personal que maneja la carne cruda.
Cuando existan sospechas de que se manipula la carne y las muestras de tejido infectadas por el virus de la
FVR, se deben utilizar las medidas preventivas adecuadas para proteger a los trabajadores contra la infección.
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
El virus de la FVR se puede aislar del suero y de la sangre recogida con anticoagulante durante la fase febril de
la enfermedad, del hígado, del bazo, y del cerebro de los animales muertos, o de los fetos abortados.
Normalmente el aislamiento primario se realiza en hámsteres, ratones jóvenes o adultos, o en cultivos celulares
de varios tipos.
a)
Cultivo
Para el aislamiento de virus debe disponerse de aproximadamente 5 ml de sangre recogida durante el
estado febril de la enfermedad o unos 5 g de hígado, bazo o cerebro recogidos tras la muerte del animal.
Las muestras deben mantenerse a 0–4°C durante el transporte. Si es probable que dicho transporte dure
más de 24 horas, la muestra se debe congelar y enviar en hielo seco.
Se suspende aproximadamente 1 g de tejido homogenizado al 1/10 en un medio de cultivo celular o en una
solución salina tamponada, pH 7.5, que contenga penicilina sódica (1.000 Unidades Internacionales [UI]/
ml), sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ ml) o fungizona (2.5 µg/ml). La suspensión se
centrifuga a 1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante líquido se inocula en el cerebro de ratones de 1–
5 días o en el peritoneo de hámsteres o ratones adultos. Los ratones jóvenes morirán o estarán
manifiestamente enfermos a los dos días. Los ratones adultos muestran síntomas de la afección 1-3 días
más tarde. Aunque los animales de laboratorio preferidos son los ratones y los hámsteres, también se
pueden utilizar corderos y huevos de gallina embrionados.
Para el cultivo del virus de la FVR pueden utilizarse varias células en monocapa, entre las que se incluyen
células de riñón de mono verde africano (Vero), de riñón de hámster neonato (BHK), de retículo de embrión
de pollo (CER: células desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological
Research, Tokio, Japón, recaracterizadas como una línea celular de hámster) (4) y células primarias de
riñón o testículo de ternero y cordero, que se inoculan con 1 ml de sobrenadante de la muestra y se incuban
a 37°C durante 1 hora. Se aconseja inocular también algunos cultivos con una dilución 1/100 del inóculo.
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Con esto se evita la producción de partículas defectivas que se deriva del uso de inóculos que tienen una
concentración muy alta de virus. También deben prepararse algunos tubos con cubreobjetos. Los cultivos
se lavan con tampón fosfato salino a temperatura ambiente y se recubren con un medio que contenga un
2% de suero exento de anticuerpos contra la FVR. Los cultivos se observan microscópicamente durante 5–
6 días. El virus de la FVR produce un efecto citopático (ECP) caracterizado por provocar un ligero
redondeamiento de las células y, a continuación, la destrucción de toda la monocapa celular en 12–
24 horas. La identificación específica del antígeno del virus de la FVR se puede realizar 18–24 horas
después de la infección mediante la tinción por inmunofluorescencia de las preparaciones en los cubres.
El virus también puede detectarse mediante la inmunofluorescencia en los frotis de hígado, bazo y cerebro.
A veces se puede hacer un diagnóstico rápido demostrando la presencia del antígeno vírico en los tejidos o
sueros de los animales febriles mediante las pruebas de fijación del complemento o de inmunodifusión en
gel de agar (IGDA). También se puede lograr un diagnóstico rápido mediante la detección del ARN vírico
utilizando una reacción en cadena de la polimerasa con trascripción inversa (RT-PCR).
b)
Inmunodifusión en gel de agar
La prueba IGDA es de utilidad en los laboratorios que no disponen del servicio de cultivo de tejidos. Se
homogeniza aproximadamente 1 gramo de tejido, preferentemente del hígado, y se hace una suspensión al
10-20% en tampón borato salino, pH 9,0. El material se centrifuga a 1.000 g y el sobrenadante se utiliza en
la prueba. Las versiones de micro-IGDA se realizan en portas estándar para microscopía que se cubren con
3 ml de agarosa al 1% en tampón borato salino. Se preparan diseños de seis pocillos periféricos y un pocillo
central que se llenan con los reactivos del siguiente modo: un suero positivo, preferentemente hiperinmune,
en el pocillo central, un control positivo de antígeno en los pocillos 1 y 4, los tejidos problema en los pocillos
2 y 5, y los tejidos negativos en los pocillos 3 y 6. Se debe formar una línea continua de precipitado entre el
antígeno control y el suero positivo que debería extenderse hasta incluir una línea entre el tejido problema y
el suero en el caso de que la prueba fuera positiva.
c)
Reacción en cadena de la polimerasa
También se puede conseguir un diagnóstico rápido mediante la detección del ARN vírico (30) utilizando una
prueba RT-PCR. La PCR se utilizó, entre otras técnicas, para la detección de antígeno en dos brotes
recientes de la FVR en África – uno en Kenia en 1998 y un brote limitado en Sudáfrica en 1999. También se
puede utilizar para detectar el virus de la FVR en las charcas en las que hay mosquitos (18). La RT-PCR
seguida por la secuenciación de la región que codifica la proteína NS (S) se ha empleado en los análisis
filogenéticos para caracterizar dos ramas distintas del virus de la FVR – una egipcia y otra subsaharianaconvirtiendo a esta técnica en un poderoso instrumento de epidemiología molecular (29).
d)
Histopatología
El examen histopatológico del hígado de los animales afectados revelará una citopatología característica, y
la inmunotinción permitirá la identificación específica del antígeno viral de la FVR en las células infectadas.
Esta es una herramienta diagnóstica importante, porque el hígado y otros tejidos se pueden mantener en
formol salino en condiciones de campo y con fines de diagnóstico, lo que facilita el manejo y el transporte
en las áreas alejadas del laboratorio.
2.
Pruebas serológicas
Se han utilizado las pruebas de neutralización del virus (NV), incluidas la microneutralización, la neutralización
por reducción de placas (PRN) y la neutralización en ratones, para detectar anticuerpos contra el virus de la FVR
en el suero de varias especies. Las pruebas de neutralización son muy específicas y reflejarán las respuestas
más precoces, pero estas pruebas solo pueden llevarse a cabo con virus vivos y su utilización no es
recomendable fuera de las áreas endémicas o en los laboratorios sin los servicios adecuados de bioseguridad y
sin que el personal esté vacunado.
Otras pruebas disponibles son el enzimoinmunoensayo (ELISA), la inhibición de la hemoaglutinación (IH), la
IGDA, la inmunofluorescencia, el radioinmunoensayo y la fijación del complemento. Sin embargo, en estas
pruebas pueden ocurrir reacciones cruzadas entre el virus de la FVR y otros flebovirus. Una ventaja de estas
pruebas es el hecho de que pueden realizarse con antígeno inactivado y, por consiguiente, pueden ser utilizadas
en países exentos de la FVR.
La técnica ELISA es un método seguro y sensible que puede usarse con varias especies para detectar
anticuerpos contra el virus de la FVR. Una prueba ELISA con captura de IgM permite diagnosticar una infección
reciente en una única muestra de suero.
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La prueba de IH puede emplearse con gran seguridad en las áreas no endémicas. No obstante, los sueros de
individuos que han tenido infecciones previas con flebovirus distintos de FVR pueden reaccionar con el antígeno de
la FVR a títulos tan altos como 40 y, más raramente, a títulos de 320 (33). En casos sospechosos, el laboratorio de
referencia de la OIE para la FVR (véase el cuadro mostrado en la parte 3 de este Manual) puede ayudar a realizar
pruebas de neutralización para determinar la especificidad. El título de los anticuerpos por IH tras la vacunación
contra el virus de la FVR puede llegar a 640 o, raramente, a 1.280, mientras que los títulos que se alcanzan tras las
infecciones naturales por el virus de la FVR son, por lo general, significativamente más altos.
a)
Neutralización vírica (la prueba recomendada para el comercio internacional)
La prueba de NV se puede utilizar para determinar la presencia de anticuerpos en los animales infectados
por vía natural y en los animales vacunados con la vacuna de la VRF. La prueba es muy específica y se
puede utilizar para probar sueros de cualquier especie. Normalmente se utiliza para medir la eficacia de la
vacuna. Algunos factores, además de los anticuerpos neutralizantes, pueden jugar un papel en la
resistencia frente a la FVR. Como antígeno, se utiliza una cepa neurotrópica para cerebro de ratón muy
atenuada del virus de la FVR denominada cepa Smithburn (31), también conocida como virus vivo
modificado y adaptado a los cultivos celulares. El antígeno se guarda a –80°C o 4°C en forma liofilizada.
Este stock se titula para determinar la dilución que producirá 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo
de tejidos) en 25 µl bajo las condiciones de la prueba.
•
Procedimiento de la prueba
i)
Se inactiva el suero problema durante 30 minutos en un baño a 56°C.
ii)
Se añaden 25 µl del medio de cultivo celular con el 5% de suero negativo para la FVR y antibióticos en
cada uno de los 96 pocillos de una placa de cultivo celular.
iii)
Se añaden 25 µl del suero problema al primer pocillo de cada fila y se hacen diluciones dobles. Se
titula cada suero por duplicado de 1/10 a 1/80 a los efectos de la prueba o por cuadruplicado y a
diluciones más altas para determinar el título de punto final. Se incluyen los controles positivos y
negativos de los sueros conocidos.
iv)
Se añaden 25 µl de antígeno vírico FVR (diluido con un medio del cultivo celular y calculado para
suministrar 100 DICT50 por pocillo) a cada pocillo que contenga el suero problema diluido y a los
pocillos de las filas que contengan controles de los sueros positivo y negativo. Además, se hacen
diluciones dobles de antígeno en al menos dos filas de las que solo contienen el medio del cultivo
celular.
v)
Se incuba 30 minutos a 37º C.
vi)
Se añaden en cada pocillo 50 µl de células Vero, CER o cualquier otra suspensión celular adecuada, a
una concentración de 3 × 105 células/ml o a una dilución de la que se sepa que origina una monocapa
confluente en 12 horas.
vii)
Se incuban las placas durante 3-5 días en una atmósfera de 3–5% de CO2.
viii) Las monocapas se examinan diariamente utilizando un microscopio invertido para apreciar el ECP. No
debería producirse ECP en las filas que contienen el suero control positivo y debería presentarse un
ECP manifiesto en las filas que contengan el suero control negativo indicando así la presencia de
virus. Se determinan los resultados por el método de Spearman–Kärber.
b)
Enzimoinmunoensayo
En relación con el serodiagnóstico del RVFV, existen publicaciones sobre varios métodos de ELISA en los
que se utilizan diferentes formatos que están disponibles en el mercado (1, 28). Recientemente se ha
sustituido el uso de los virus íntegros inactivados o de los antígenos procedentes del hígado de ratón por el
uso como antígeno de la proteína recombinante de la nucleocápsida.
Estas pruebas de ELISA tienen actualmente un formato indirecto, e independientemente de las cuestiones
relativas a la seguridad, cuentan con la ventaja de la estabilidad del antígeno y la posibilidad de procesar
40 sueros en lugar de 20, utilizando dos por cada placa.
Más adelante se describe un ELISA indirecto con las placas previamente recubiertas, utilizando el antígeno
recombinante de la proteína de la nucleocápsida (NC) y un conjugado con proteína G-peroxidasa (17).
•
Procedimiento de la prueba
A menos que se señale lo contrario, todas las diluciones se hacen con tampón con 10% (peso/volumen) de
leche deshidratada, y todos los lavados se repiten tres veces con volúmenes de 250–300 µl/pocillo.
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Capítulo 2.1.14. — Fiebre del valle del Rift
i)
Se utilizan placas recubiertas, a las que se añaden 50 µl de suero diluido (1/100) en pocillos
duplicados.
ii)
Se añaden sueros control a una dilución predeterminada en pocillos duplicados. Se incuba durante 60
minutos at 37°C. Se lavan las placas.
iii)
Se añade el conjugado de proteína G/peroxidasa de rábano en una dilución de trabajo a los pocillos
de la placa. Se incuba durante 60 minutos a 37°C. Se lava la placa.
iv)
Se añaden 50 µl de sustrato TMB a todos los pocillos de la placa. Se cubre la placa y se incuba a
temperatura ambiente y en la oscuridad durante 20–30 minutos.
v)
Se añaden 50 µl de disolución de frenado a todos los pocillos de la placa. Se mueve ligeramente la
placa para que se mezcle el contenido. Se espera 5 minutos y se lee la placa con un espectrómetro
equipado con un filtro de 450 nm.
vi)
Disposición de la placa recomendada.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
CC
CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
B
CC
CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
C
C++
C++
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
D
C++
C++
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
E
C+
C+
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
F
C+
C+
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
G
C–
C–
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
H
C–
C–
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
CC: control del conjugado; C++: suero de control muy positivo; C+: suero de control poco positivo;
C–: suero de control negativo; 1–40: muestras de prueba.
Se han introducido nuevos formatos ELISA, incluyendo formatos más específicos para IgG e IgM (27).
c)
Inhibición de la hemoaglutinación
La prueba IH adaptada en versión de microtécnica se basa en Clarke & Casals (7). Se emplea antígeno de
hígado de hámster extraído en sacarosa/acetona en una placa de ensayo de 96 pocillos con fondo en U y
se diluye de modo que se usan en la prueba 4 unidades hemoaglutinantes. Los inhibidores inespecíficos de
la hemoaglutinina se extraen de los sueros antes de la prueba mediante la extracción con caolín y luego por
adsorción en eritrocitos de ganso prensados (RBC). Las diluciones dobles seriadas de los sueros se hacen
en tampón borato salino, pH 9,0, y se ensayan frente a volúmenes iguales de antígeno. Las placas se dejan
a 4°C durante la noche antes de añadir 50 µl de RBC al 0,5% a cada uno de los pocillos. Las placas se leen
tras 30 minutos a temperatura ambiente y los puntos finales se indican como el inverso de la dilución más
alta de suero que produce una inhibición total de la hemoaglutinación.
En cada prueba se incorporan sueros control positivo y negativo. Una prueba se considera válida solamente
si los sueros control dan los resultados esperados. Los sueros con títulos inferiores a 1/40 se consideran
negativos.
La técnica de IH es una prueba adecuada de ensayo para inspecciones aunque no es muy específica.
Entre los flebovirus ocurren reacciones cruzadas notables, pero los títulos homólogos exceden a los
heterólogos. Experimentalmente, se ha demostrado que hay flebovirus africanos distintos del FVR que no
son patógenos para los rumiantes, y no es probable que los anticuerpos que ellos puedan inducir originen
confusión en el diagnóstico de FVR (33).
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
Se ha usado una vacuna viva preparada con la cepa atenuada Smithburn del virus de la FVR para controlar FVR
en ganado bovino y ovino no gestante en áreas endémicas y durante brotes epidémicos (6), mientras que se
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Capítulo 2.1.14. — Fiebre del valle del Rift
usan virus vacunales inactivados a partir de cepas naturales en animales gestantes y en países libres de FVR (2,
3). Las vacunas con virus inactivados deben prepararse a partir de cepas muy inmunogénicas del virus de la
FVR producidas en cultivo celular. El virus debe inactivarse con formaldehído y mezclarse con un adyuvante para
potenciar la inmunogenicidad. Las vacunas inactivadas deben ensayarse muy cuidadosamente en cuanto a la
seguridad para garantizar que no existe ningún virus vivo residual.
Las directrices para la producción de vacunas veterinarias se presentan en el capítulo 1.1.8. Principios de
producción de vacunas veterinarias. Las normas expuestas aquí y en el capítulo 1.1.8 son genéricas y pueden
ser suplementadas con requisitos nacionales o regionales.
En humanos se ha usado durante 25 años con considerable éxito, una vacuna experimental inactivada para
protección de personas con riesgo de FVR. En la actualidad esta vacuna se está produciendo en células
diploides. Sin embargo, su la limitada disponibilidad impide su uso en la población general.
Dos nuevas candidatas a vacunas producidas a partir de aislamientos humanos de FVR están siendo sometidas
a diversos ensayos para reemplazar a las vacunas existentes.
La primera, MV P12, es una cepa mutante de virus cultivado en presencia de 5-fluorouracilo con mutagénesis
seriada que produce en una atenuación para el ratón. Se ha probado en ovejas la inmunogenicidad y la
patogenicidad y el virus no provoca abortos en ovejas gestantes (23). MV P12 confirió protección en corderos
jóvenes (14, 20) y en ganado bovino (24, 25). En pruebas posteriores más extensas realizadas en ovejas la
vacuna produjo abortos y teratología fetal grave cuando se usó después de 28 días de gestación (16), es decir
en el primer trimestre.
La segunda candidata, Clon 13, una variante de virus que origina pequeñas placas de lisis y que no reacciona
con dos anticuerpos monoclonales específicos, resultó ser avirulenta para ratones y hámsteres y muy
inmunogénica. Su inmunogenicidad y patogenicidad se ha probado en corderos, ovejas, y cabras jóvenes y
adultas (26). En ensayos adicionales se comportó como no abortiva en ovejas gestantes y confirió más de un
80% de protección frente a un virus prueba de desafío (15). El virus Clon 13 presenta la pérdida de una porción
del segmento de ARN pequeño que codifica proteínas no estructurales, lo que podría conducir a una vacuna
estable.
En la siguiente descripción de producción de vacunas, se suministra información sobre la producción de vacuna
viva junto a la información sobre producción de vacuna inactivada. Debe resaltarse que las vacunas vivas y las
inactivadas nunca deben producirse simultáneamente en los mismos servicios, debido al riesgo de contaminar la
vacuna viva atenuada con una cepa virulenta de virus antes de ser inactivada. El personal que maneja virus de la
FVR vivo debe estar vacunado y trabajar con nivel de contención 3 para minimizar el riesgo de autoinfección.
1.
Control del inóculo
a)
Características del inóculo vírico
Vacuna viva: El stock de antígeno deriva de la cepa original neurotrópica de Smithburn. Esta cepa no es
letal para los ratones adultos inyectados intraperitonealmente y es segura cuando se usa en todas las razas
del ganado vacuno, en las ovejas y en las cabras. Sin embargo, puede causar anormalidades fetales o
aborto en los animales gestantes.
Vacuna inactivada: Se puede usar como virus de inóculo una cepa de virus de la FVR altamente
inmunogénica adaptada para crecer en cultivos celulares. Se diferencia de la cepa atenuada en que es letal
para los ratones adultos cuando se inyecta intraperitonealmente.
b)
Método de cultivo
Tanto las cepas de virus atenuado como la inactivada se producen en cultivos celulares de células BHK,
Vero o CER. Los virus se guardan en forma liofilizada en viales que contienen 1 ml de una suspensión de
cultivo celular. El título vírico (tras inoculación intracerebral en ratones jóvenes) debe ser de al menos
106.5 LD50 en el ratón (50% de la dosis letal) por ml.
c)
Validación como vacuna
Los virus inoculados deben carecer de agentes indeseables, ser seguros para el uso y capaces de
estimular una inmunidad eficaz en las especies y razas a las que va dirigida.
•
Pruebas
El inóculo del virus liofilizado se regenera en un medio de cultivo celular estéril sin antibióticos y se
comprueba la ausencia de bacterias y hongos. El contenido de un vial así reconstituído, se inocula en dos
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Capítulo 2.1.14. — Fiebre del valle del Rift
tubos de medio con tioglicolato y en dos tubos de medio con hidrolizado de soja y caseína. Los cultivos con
tioglicolato se incuban a 37°C durante 7 días y los cultivos con hidrolizado de soja y caseína a 20°C durante
14 días. Los cultivos deberían permanecer negativos.
Además, se mezclan 5 ml del inóculo de virus reconstituído con un mismo volumen de antisuero específico
contra FVR producido en conejos. Después de incubar las mezclas suero/virus a 37°C durante 30 minutos,
las suspensiones víricas se ensayan en cultivos celulares antes y después de una neutralización, así como
en ratones adultos y jóvenes, huevos embrionados y cobayas. El virus neutralizado es:
i)
Sembrado en seis cultivos en tubos rotativos con células primarias de riñón de cordero y seis cultivos
en tubos rotativos con células BHK. Los cultivos celulares se incuban a 37°C y se observan
diariamente durante 7 días para detectar el ECP, tras los cuales se someten a la prueba de
hemadsoción con RBCs de cobaya a 4°C y a 37°C. No debería presentarse ECP ni hemadsorción. Si
el cultivo degenera o presenta sospechas de ECP, el material de estos cultivos debería mezclarse de
nuevo con antisuero y reinocularse en cultivos celulares frescos, que se observan durante otro período
adicional de 14 días. La presencia de un ECP específico o de hemadsorción descalifica la muestra
como inóculo vírico.
ii)
Inoculado intraperitonealmente (0,2 ml) en grupos de al menos seis ratones adultos y seis ratones de
2-5 días de edad. Los ratones deberían permanecer sanos durante 14 días. Si muriera algún ratón, se
emulsiona un tejido adecuado, se mezcla con antisuero y se reinocula en otros grupos de ratones,
observándolos de nuevo durante otro período de 14 días. Si existe alguna evidencia de mortalidad
específica, se descalifica la muestra como inóculo vírico.
iii)
Inoculado en al menos diez huevos de gallina embrionados de 8 días mediante el método del punzón
(combinación de la ruta de la membrana coriolantoidea y del saco alantoideo). Los huevos se incuban
a 37°C durante 8 días y se observan diariamente con transiluminación. Los embriones que mueren a
las 24 horas se eliminan. Si después de 24 horas permanecen vivos menos del 70% de los embriones,
la prueba debería, no obstante, repetirse. La causa de muerte embrionaria durante el consiguiente
período de observación debería determinarse estableciendo pruebas adecuadas de esterilidad y de
HI, y por examen de frotis del saco vitelino. Si estas pruebas resultan negativas, debería hacerse,
como antes, una reinoculación de suspensiones obtenidas de los embriones mezcladas con antisuero.
Al día 4 de incubación, se abren al menos 4 huevos y se recoge el líquido del alantoides. Los huevos
restantes se abren al octavo día de incubación. Se examinan las membranas de ambos grupos a fin
de detectar las lesiones y las anomalías del embrión. El líquido del alantoides se somete a una prueba
HI con RCBs de cobaya y pollo a 4°C y a 37°C. La evidencia de mortalidad embrionaria específica, de
actividad hemoaglutinante en el líquido alantoideo, cualquier lesión en las membranas o
anormalidades embrionarias descalifican la muestra como inóculo vírico.
iv)
Inyectado intraperitonealmente con 1,0 ml de inóculo vírico en dos cobayas. Los cobayas deben
permanecer sanos en un período de observación de 14 días.
No superar cualquiera de estas pruebas descalifica al antígeno para uso como inóculo vírico.
2.
Método de producción
Se reconstituye un vial de inóculo vírico liofilizado y se diluye entre 1/100 y 1/1.000 con medio Eagle en el caso
de las vacunas atenuadas y 1/1.000 en el caso de vacunas inactivadas. Para preparar una suspensión de
trabajo, se siembra el virus diluído en un cultivo confluente de células BHK en frascos rotatorios y se incuba a
37°C. Cuando el 70% de las células aparecen afectadas (ECP), se recoge el medio y las células y este material
se diluye entre 1/100 y 1/1.000, tras lo cual se siembran de nuevo 10 ml en frascos rotatorios con células BHK
confluentes y se incuba otra vez. Tan pronto como se observa un 70% de ECP, se recoge el medio y las células
y se almacenan.
Tanto las suspensiones víricas de las vacunas atenuadas como de las inactivadas, se titulan intracerebralmente
en ratones neonatos y deberían presentar un título de al menos 106.5 LD50/ml en ratón. Alternativamente, se
puede realizar una titulación de lesiones en células CER.
La vacuna atenuada se liofiliza inmediatamente después de completar las pruebas de titulación para bacterias y
hongos .
Debería usarse un estabilizador, como por ejempo 5% de peptona en tampón fosfato 0,3 M. El volumen de la
vacuna inactivada se ajusta de modo que la vacuna final contenga al menos 106.5 LD50/ml. La suspensión vírica
ajustada se inactiva luego a 37°C durante 24 horas con formaldehído a una concentración final de 0,2%. Tras la
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Capítulo 2.1.14. — Fiebre del valle del Rift
inactivación, se añade a la suspensión el mismo volumen de gel de hidróxido de aluminio. La vacuna debe tener
un pH final de 7–7,5.
3.
Control del proceso
Previamente a la inoculación de los cultivos celulares, el inóculo vírico se somete a pruebas para la detección de
bacerias y hongos en medios con tioglicolato y con hidrolizado de soja y caseína (éase la sección C.1.c y
capítulo 1.1.9 Pruebas paracomprobar la esterilidad y la ausencia de contaminación en los materiales biológicos).
Se selecciona una muestra representativa de cada lote de vacuna y cada contenido se reconstituye con 5 ml de
agua destilada estéril analizándose para comprobar ausencia de bacterias y hongos.
En las vacunas inactivadas, debe comprobarse la inactivación mediante dos pases en el mismo tipo de cultivo
celular que se usó en la producción de la vacuna.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Antes de la liofilización o de la inactivación, cada envase de vacuna almacenada, y después muestras
representativas de cada lote, se prueban respecto a esterilidad en medio con tioglicolato e hidrolizado de
soja y caseína (ver también capítulo 1.1.9. de este Manual).
b)
Inocuidad
Vacuna viva: Se seleccionan al azar los recipientes finales de la vacuna atenuada liofilizada y cada uno se
reconstituye en agua destilada como si se tratara de una vacunación. Se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con una dosis de vacuna. Las ovejas se observan diariamente durante 14 días y se
anota su temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
La vacuna también se inyecta intraperitonealmente en seis ratones adultos (0,25 ml en cada uno), dos
hámsteres y dos cobayas (1 ml en cada uno). Los animales se observan diariamente durante un período de
14 días durante el cual deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
Vacuna inactivada: En el caso de la vacuna inactivada contra FVR, se inyectan subcutáneamente cuatro
ovejas susceptibles con 2,0 ml de vacuna, se observan diariamente durante 3 semanas y se anota la
temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
Además, la seguridad también se determina mediante la inyección intracerebral de seis ratones adultos y
dos camadas de al menos 6 ratones neonatos por camada, y mediante inyección intraperitoneal de dos
cobayas y dos hámsteres. Los ratones, hámsteres y cobayas se observan durante 14 días. Deben
permanecer sanos. Una mortalidad atribuíble a la vacuna descalifica el lote.
c)
Potencia
Vacuna viva: Se reconstituye la vacuna atenuada liofilizada de dos recipientes finales y se titula
intracerebralmente en ratones neonatos. La vacuna final debe contener al menos 104.4 LD50/dosis en
ratón. Como alternativa, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares.
Se mantienen dos recipientes finales durante una semana a 37°C, se recosntituyen y se titulan como se ha
expuesto anteriormente. Cada uno debe contener al menos 103.4 LD50/dosis en ratón. Como alternativa, se
pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares.
Las ovejas inoculadas (véase la sección C.4.b.) se sangran a las 2 y 3 semanas de la vacunación y su
respuesta en anticuerpos se determina por PRN. Se considera como satisfactorio un título de anticuerpo
neutralizante frente al virus de 100 o más.
Vacuna inactivada: Las ovejas, inoculadas subcutáneamente para determinar la seguridad (sección C.4.b.),
se sangran a las tres semanas y su respuesta en anticuerpos se determina por la prueba de NV. Un título
de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o más se considera satisfactorio.
d)
Duración de la inmunidad
Se han utilizado ampliamente tanto las vacunas vivas como las atenuadas en condiciones de campo. Se
considera que la vacuna viva induce una inmunidad contra la enfermedad clínica que dura toda la vida,
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aunque existe cierta controversia sobre la inmunogenicidad de la vacuna Smithburn. Sin embargo, el
ganado vacuno se puede inmunizar con la vacuna de virus vivo utilizando esta cepa. La experiencia sobre
la eficacia de campo de las vacunas inactivadas es limitada porque se han empleado en áreas donde la
FVR no es endémica, y donde, en consecuencia, no existe un desafío natural frente a la vacuna. Sin
embargo, durante el brote de 1976–1978 en Sudáfrica, las observaciones realizadas por veterinarios
estatales apoyan la eficacia de la vacuna. En epizootias más recientes en otras partes, la vacuna inactivada
no tuvo éxito en la protección de los animales contra el aborto, después de dos vacunaciones. Si se usa la
vacuna inactivada, se debe inocular una dosis de recuerdo a los 3–6 meses de la vacunación inicial, y
después se debería repetir la vacunación anualmente (2, 3).
e)
Estabilidad
Cuando se mantienen a 4°C, las vacunas atenuadas liofilizadas son estables durante al menos 4 años,
mientras que la inactivada puede mantenerse durante muchos años. No se recomienda su almacenamiento
a temperaturas superiores.
f)
Conservantes
No se usan conservantes
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque el hombre se puede infectar durante el manejo de material infectado, no se conoce ningún caso de
la enfermedad humana debida al virus de la vacuna atenuada, pero a menudo se produce la
seroconversión. Sin embargo, las cepas utilizadas para preparar la vacuna inactivada pueden causar la
enfermedad. Por tanto, todo el personal con probabilidad de exposición al virus de la vacuna debería ser
vacunado con la vacuna inactivada con formalina para el hombre.
5.
Pruebas en el producto final
a)
Esterilidad
Se recogen muestras representativas del producto final y se ensayan tal como se indica en la sección C.4.a.
b)
Contenido en humedad
La humedad presente en las muestras liofilizadas de la vacuna atenuada no debería superar el 3%.
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* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la fiebre del Valle del Rift (véase el cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la OIE: www.oie.int
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
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