“Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de vida sobre

Facultad de Farmacia
“Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de vida
sobre el riesgo de obesidad en población mayor de 55 años de
la cohorte SUN”
CECILIA GALBETE CIÁURRIZ
Pamplona, 2012
Facultad de Farmacia
“Influencia de diversas variantes genéticas y el estilo de
vida sobre el riesgo de obesidad en población mayor de 55
años de la cohorte SUN”
Memoria presentada por Dª Cecilia Galbete Ciáurriz para aspirar al grado de Doctor
por la Universidad de Navarra
Cecilia Galbete Ciáurriz
El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de
Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología, autorizamos su presentación
ante el Tribunal que lo ha de juzgar.
Pamplona, ....... de ............................. de 2012.
Dra. Amelia Marti del Moral
Dr. Francisco Guillén-Grima
AGRADECIMIENTOS
Cuando emprendas tu viaje hacia Ítaca
debes rogar que el viaje sea largo,
lleno de peripecias, lleno de experiencias.
No has de temer ni a los lestrigones ni a los cíclopes,
ni la cólera del airado Poseidón.
[...] Mas no hagas con prisas tu camino;
mejor será que dure muchos años,
y que llegues, ya viejo, a la pequeña isla,
rico de cuanto habrás ganado en el camino.
No has de esperar que Ítaca te enriquezca:
Ítaca te ha concedido ya un hermoso viaje.
Sin ella, jamás habrías partido.
Ítaca (C.P. Cavafis)
Agradecimientos
Y desde aquí ya puedo avistar Ítaca, casi no queda nada para llegar. Lo cierto es que
no considero que haya sido un viaje largo, creo que ha durado lo que tenía que durar, lo
que también es de agradecer. Y es que ha llegado el momento de los agradecimientos, de
acordarse de todos los que han estado conmigo en este hermoso viaje lleno de peripecias
y experiencias y que creo tanto me ha hecho crecer.
Y en primer lugar debo agradecer tanto al Gobierno de Navarra como a la
Universidad de Navarra la oportunidad que me han dado con su financiación a través de
la beca de Formación de Tecnólogos y la beca de la Asociación de Amigos de la
Universidad respectivamente. Gracias a ellas he podido conocer muy de cerca el mundo
de la investigación y saber que esto me gusta, que me quiero dedicar a ello.
Por supuesto agradecer al departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y
Toxicología la oportunidad de hacer este trabajo de tesis con ellos, ha sido un verdadero
placer. Y no me olvido de mi segundo departamento, Medicina Preventiva y Salud
Pública, de quienes he recibido siempre tanta ayuda y de manera tan gustosa. En este
apartado una mención especial para quienes me han guiado de la mano en este camino.
En primer lugar, por supuesto, la Dra. Amelia Marti, quien me ha visto nacer en el
mundo de la ciencia y siempre ha estado conmigo de manera cercana y constante, en lo
mejor y en lo peor. En segundo lugar el Dr. Francisco Guillén porque siempre que le he
necesitado me ha prestado su ayuda y tanto me ha enseñado en esto de la bioestadística.
Y no me olvido del Dr. Miguel Ángel Martínez por brindarme esta oportunidad, por toda
su paciencia y su disposición y sobre todo por confiar en mí. Ni del Dr. Alfredo Martínez
que siempre me ha mostrado todo su interés y apoyo en esta andadura.
Siguiendo con los agradecimientos no me puedo olvidar de Bea y Paula que siempre
me han ayudado con una sonrisa, todo un placer haber coincidido con vosotras. Y las
mismas palabras y agradecimientos para Vero y Ana por todas las manos que me han
echado y por todo lo que me han enseñado en el laboratorio. Y por supuesto también a
Asun que tan buenos momentos me ha hecho pasar.
Y agradecer también su ayuda a los jefes más cercanos, a Javier por ayudarme
tantísimo con esto de la genética y por contagiarme su entusiasmo. Y también a Fermín
que siempre ha estado tan dispuesto a resolver mis dudas. Agradecer a Santi su compañía
y su infinita ayuda y a Pedro toda su comprensión y apoyo. Y no me olvido de Jaione,
gracias por sacarme siempre una sonrisa. Y aquí quiero incluir también a Mª Luisa, todo
un placer haber coincidido contigo.
Por supuesto no me puedo dejar a mis amigos y a mis compañeros de ordenadores,
a los que estuvieron, a los que siguen estando y a los que acaban de llegar. Hemos
compartido tantísimos momentos que no se me ocurre nada mejor que deciros que
GRACIAS.
El primer lugar se lo cedo a Adri, Tara y Laura, ¿a quién sino? Cualquier palabra se
me queda corta. Adri, puedo decir que tú me lo has enseñado casi todo (el casi es porque
Agradecimientos
ya sabes que no me gusta exagerar…), gracias por tener tanta paciencia. Tara, muchas
gracias por tantos buenos momentos, estoy segura que vamos a tener muchos más y no
dejes nunca que nadie te quite esa fuerza que tienes. Laura, gracias por todo el apoyo que
siempre me has dado y por tener siempre unas palabras de ánimo en los malos
momentos. Chicas, habéis hecho que este viaje sea mejor incluso de cuanto prometía el
poema. Ahora este viaje termina pero os digo con total seguridad ¡que en el siguiente os
llevo conmigo!
Y siguiendo con mis compañeros de tesis por supuesto no me puedo olvidar de
Mentx y de cuánto nos hemos divertido, ni de Noe, mi compañera de despistes.
También me acuerdo de los chicos. Por supuesto de Pablo y de los buenísimo
momentos que hemos pasado, me llevo de ti toda la música que hemos compartido. De
Carlos, quién me iba a decir a mí que te iba a coger tanto cariño… y de Paúl, ¡mucho
ánimo en tu recta final! Y también de Jonai, no pierdas esa tranquilidad, creo que la vas a
necesitar... Y a Gorka, ¡muchas gracias por introducirme en el mundo del squash!
Siguiendo con ordenadores no me puedo olvidar a mis flancos derecho e izquierdo,
Ana Laura y Rocío, ha sido un placer teneros tan cerca. Ni por supuesto de la sonrisa de
Aurora. Tampoco me olvido de las chicas del otro lado de ordenadores. De Ana G. y sus
infinitas anécdotas, y de Pilar por ayudarme en esta recta final, ¡ya verás como
encontraremos una beca! Ni de las más rojillas del otro lado de ordenadores Mary y
Patri. Y tampoco me olvido de Pedro y Marta.
A los nuevos, Miguel, Usune e Idoia, decirles que disfruten el camino, que eso es lo
verdaderamente importante. Y a Sonia, allí donde vaya te conseguiré una estancia, qué
bien lo íbamos a pasar tu y yo, muchas gracias por tener siempre una sonrisa.
Unas palabras de agradecimiento también a quienes ya no están en el departamento
pero de quienes puedo decir que he aprendido muchísimo y de quienes estoy segura que
seguiré aprendiendo. A Itzi, a Blanca, a Esti, a Cris, a Idoia, a Almu y a Bea.
Y no podría olvidarme de Silvia, Zenaida, David y Carmen ni de todo el equipo
SUN, ni de los voluntarios, está claro que esta tesis no hubiera sido posible sin vosotros.
Ni de Rafa, este trabajo también es en parte tuyo.
No me puedo dejar a mis amigas, a mi cuadrilla. Ángela, Carmen, Cris, Ley, Lu,
Ruth y Claudia. Vosotras sí que me habéis acompañado, incluso sin entender nada de lo
que estaba haciendo. A Carmen doble mención, porque ha sido de gran ayuda compartir
etapa contigo.
Por supuesto no me olvido de Karmele y Álvaro, muchísimas gracias por todo, os
habéis hecho unos imprescindibles para mí. Ni de Pedro ni de Marina ni del resto de la
cuadrilla de la Universidad. Y acordarme también de Ester, de Esti, de Troy, de Irene y
de todos los demás.
Agradecimientos
Y las últimas palabas, las más importantes, se las dedico a mi gran familia. Sobre
todo A MIS PADRES, por su infinita paciencia. Por intentar entenderme, y por dármelo
todo. Y A MIS HERMANOS por ser como son, ¡que no me los cambien nunca! Y por
supuesto a mi abuela, eres la mejor.
A todos vosotros GRACIAS por haberme hecho desear que el viaje fuese largo y por
haber hecho de él un camino lleno de experiencias. Sin vosotros nada de esto hubiese
tenido sentido.
ABREVIATURAS
Abreviaturas
A: Adenina
ADIPOQ: Adiponectina
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADRB: Receptor beta adrenérgico
AGM: Ácidos grasos monoinsaturados
AGP: Ácidos grasos poliinsaturados
AGS: Ácidos grasos saturados
Ala: Alanina
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero
BMAL1: Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
(ARNT)-like 1
C: Citosina
CLOCK: Circadian Locomotor Output Cycles Kaput
CRY: Criptocromo 1
CSFC: Cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de consumo de alimentos
DM2: Diabetes Mellitus tipo 2
ENPP1/PC-1: ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1/ plasma cell
membrane glycoprotein 1
FTO: Fat Mass and Obesity associated gene
GRL: Receptor de glucocorticoides
GWAS: Genome wide association study/ Estudio de asociación del genoma completo
HC: Hidratos de carbono
HDL: High Density Lipoproteins/Lipoproteínas de alta densidad
HTA: Hipertensión arterial
Abreviaturas
IL6: Interleuquina 6
IMC: Índice de masa corporal
INSIG2: Insuline induced gene 2/ Gen inducido por la insulina 2
LEP: Leptina
LEPR: Receptor de la leptina
MC4R: Receptor 4 de melanocortina
MET: Equivalente metabólico
NF-B: Factor de transcripción potenciador de las cadenas ligeras kappa de las
células B activadas
NHANES: National Health and Nutrition Examination Survey
NHS: Nurses’ Health Study
OMS: Organización Mundial de la Salud
PCSK1: Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 1
PER: Period
POMC: Proopiomelanocortina
PPARG2: Receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2
Pro: Prolina
REVERB: Reverse erythroblastosis virus alfa
ROR: Retinoid-related orphan receptor-alfa
RT-PCR: Real Time- Reverse transcription polymerase chain reaction/ Reacción
en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa a tiempo real
rs: reference SNP cluster
SEEDO: Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad
SNP: Single Nucleotide Polymorphism/ Polimorfismo de nucleótido simple
Abreviaturas
SQN: Núcleo supraquisamático
SUN: Seguimiento Universidad de Navarra
T: Timina
UCP: Proteína desacoplante
ÍNDICE
Índice
INTRODUCCIÓN ........................................................................ 1
1. OBESIDAD ................................................................................................ 3
1.1 Definición de obesidad ......................................................................... 3
1.2 Epidemiología de la obesidad ............................................................... 6
1.3 Etiología de la obesidad ....................................................................... 9
1.4 Complicaciones de la obesidad .......................................................... 10
2. GENÉTICA DE LA OBESIDAD ............................................................. 12
2.1 Variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad ......... 12
2.1.1. Estudios de genes candidatos .................................................... 14
2.1.1.1. Receptor activado por el proliferador de peroxisomas
gamma 2 (PPARG2) ....................................................... 16
2.1.1.2. Circadian Locomotor Output Cycles Kaput gene
(CLOCK) ........................................................................ 17
2.1.2. Estudios de asociación del genoma completo ........................... 20
2.1.2.1. Fat Mass and Obesity Associated gene (FTO) .............. 22
2.2 Interacción gen-estilo de vida ............................................................. 23
2.1.3. Nutrigenética ............................................................................. 24
2.1.4. Interacciones gen-actividad física ............................................. 27
3. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 29
OBJETIVOS .................................................................................45
SUJETOS Y MÉTODOS ............................................................49
1. EL ESTUDIO SUN ................................................................................... 51
1.1 Características generales ..................................................................... 51
1.2 Cuestionario basal ............................................................................... 52
1.2.1. Variables socio-demográficas ................................................... 53
1.2.2. Actividad física y otras variables del estilo de vida ................. 53
1.2.3. Variables clínicas y antropométricas ........................................ 54
1.2.4. Evaluación dietética .................................................................. 54
2. ANÁLISIS DE VARIANTES GENÉTICAS ............................................ 55
2.1 Extracción de ADN.............................................................................. 55
2.2 Protocolo para la detección de variantes genéticas .............................. 56
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................................... 59
4. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 61
Índice
RESULTADOS .............................................................................65
1. CAPÍTULO 1: Pro12Ala variant of PPARG2 increases body mass
index: an updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects ............. 67
2. CAPÍTULO 2: Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2
and FTO variants in an elderly population: a cross-sectional analysis
in the SUN Project ..................................................................................... 91
3. CAPÍTULO 3: Physical activity and gender modulate obesity risk
linked to 3111T/C gene variant of the CLOCK gene in an elderly
population: The SUN Project ................................................................. 113
DISCUSIÓN GENERAL ........................................................... 141
1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO ........................................................ 143
2. LA COHORTE SUN: FORTALEZAS Y DEBILIDADES .................... 144
3. ESTUDIO DE VARIANTES GENÉTICAS ASOCIADAS CON
OBESIDAD ............................................................................................. 147
3.1 Efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 .. 147
3.2 Efecto combinado de las variantes genéticas Pro12Ala del gen
PPARG2 y rs9939609 del gen FTO ................................................. 149
3.3 Efecto del SNP 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK ................... 151
4. COROLARIO .......................................................................................... 153
5. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 154
CONCLUSIONES ........................................................................ 163
ANEXOS/OTRAS PUBLICACIONES ...................................... 167
1. ANEXO 1: Consentimiento informado ................................................... 169
2. ANEXO 2: Cuestionario basal C_0 ......................................................... 173
3. ANEXO 3: The effect of the Mediterranean diet on plasma brainderived neurotrophic factor (BDNF) levels: the PREDIMEDNAVARRA randomized trial .................................................................... 183
INTRODUCCIÓN
Introducción
1. OBESIDAD
Hoy en día la prevención de la obesidad es un aspecto prioritario para la salud
pública. La obesidad supone el problema nutricional más frecuente en la sociedad
occidental (OMS, 2000) y ha sido incluso catalogada como la epidemia del siglo XXI.
Conlleva no sólo complicaciones desde el punto de vista estético y psicológico, sino
también y principalmente, enfermedades a las que este trastorno puede derivar o
acompañar como la diabetes, la hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento de
riesgo de padecer cáncer, insuficiencia respiratoria u osteoartritis entre otras (Martinez,
2000; Bray, 2004; Sorensen et al., 2010).
Ya Hipócrates en el siglo V a.C. asoció la obesidad con la muerte súbita (SalasSalvadó et al., 2005) pero no fue hasta finales del siglo XVI cuando se desarrollaron las
primeras tesis doctorales con la obesidad como tema principal. A mitad del siglo XX,
después de la II Guerra Mundial, las compañías de seguros descubrieron que las
personas con mayor peso tenían una mayor mortalidad y elaboraron unas tablas usadas
para el cálculo de las primas de seguros (MLIC, 1942;1943). En estas investigaciones
resulta interesante destacar que no estaban implicados investigadores de ciencias de la
salud sino agentes de seguros.
1.1. Definición de obesidad
El sobrepeso y la obesidad han sido definidos por la OMS como una acumulación
excesiva de grasa que puede ser perjudicial para la salud (OMS, 2011). Esto se debe al
desequilibrio en el balance energético entre la ingesta y el gasto energético (Martinez,
2000). Se trata de una enfermedad con una etiología compleja pues factores genéticos y
ambientales interaccionan entre sí haciendo que se incrementen en el organismo las
reservas energéticas en forma de grasa (Marti et al., 2004).
La obesidad se asocia con un exceso en el número de adipocitos (hiperplasia), en el
tamaño de éstos (hipertrofia) o a ambos (Wang & Beydoun, 2007). Se ha comprobado
que la hipertrofia del tejido adiposo ocurre antes que la hiperplasia del mismo, y se ha
observado también que el número de adipocitos se mantiene constante en los adultos
3|Página
Introducción
incluso después de una importante pérdida de peso. Este hecho sugiere que el número
de adipocitos se establece durante la infancia y la adolescencia y se mantiene en la vida
adulta (Spalding et al., 2008).
Los criterios para la clasificación del sobrepeso y la obesidad han ido
evolucionando con el tiempo. En el año 1832 el estadístico belga Lambert Adolphe
Jacques Quetelet (1796-1874) demostró que desde el nacimiento hasta la pubertad el
peso aumentaba de forma proporcional con el cuadrado de la estatura y formuló un
índice que sería conocido como el índice Quetelet.
Otro de los índices para la medición del peso fue el índice de peso ideal o índice de
Broca, desarrollado por el neurólogo y antropólogo francés Paul Pierre Broca (18241880) que calculaba el peso ideal mediante la siguiente fórmula (Rossner, 2007):
Peso ideal (kg) = Estatura (cm) – 100 (± 15% en mujeres y ± 10% en varones)
Este índice estaría en vigor hasta el año 1983, utilizándose en una versión
modificada, conocida como fórmula de Devine, para el cálculo de dosis de
medicamentos ajustado por peso corporal (Pai & Paloucek, 2000).
En la actualidad el parámetro más utilizado es el Índice de Masa Corporal
(IMC=kg/m2) que se trata de una versión modificada por el fisiólogo americano Ancel
Keys (1904-2004) del anteriormente mencionado índice de Quetelet. Es el índice
utilizado por la mayoría de los estudios epidemiológicos y el recomendado por
diferentes sociedades médicas y organizaciones de salud internacionales para el uso
clínico dada su reproducibilidad, facilidad de utilización y capacidad de reflejar la
adiposidad en la mayoría de la población (McCrory et al., 2000). Así, con la ayuda de
este índice se puede definir a los pacientes que presentan sobrepeso y obesidad según
ciertos límites que han sido previamente establecidos. La OMS considera que los puntos
de corte del IMC para clasificar a la población adulta son 25, 30, 35 y 40 kg/m2,
correspondientes con los grados de sobrepeso, obesidad grado I, II y III (Tabla 1).
4|Página
Introducción
Tabla 1. Clasificación del estado nutricional en función del IMC según la
OMS. Fuente: OMS (2011)
Categoría
IMC (kg/m2)
Bajo peso
< 18,5
Peso ideal
18,5-24,9
Sobrepeso
25,0-29,9
Obesidad grado I
30,0-34,9
Obesidad grado II
35,0-39,9
Obesidad mórbida o grado III
≥ 40,0
De la misma manera, la Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad
(SEEDO) considera valores normales de IMC los comprendidos entre 18,5 kg/m2 y 24,9
kg/m2. También propone valores de IMC por encima de los 25,0 kg/m2 como sobrepeso
y prevé un intervalo de riesgo para los valores comprendidos entre 27,0 kg/m2 y 29,9
kg/m2 cuando se acompañan de otros factores de riesgo (consumo de tabaco,
hipertensión y diabetes) (Tabla 2).
Tabla 2. Clasificación del estado nutricional en función del IMC según la
SEEDO. Fuente: Salas-Salvado et al. (2007)
Categoría
IMC (kg/m2)
Normopeso
18,5-24.9
Sobrepeso I
25,0-26,9
Sobrepeso II (preobesidad)
27,0-29,9
Obesidad I
30,0-34,9
Obesidad II
35,0-39,9
Obesidad III (mórbida)
40,0-49,9
Obesidad IV (extrema)
≥50,0
5|Página
Introducción
1.2. Epidemiología de la obesidad
En 2008 la Organización Mundial de la Salud estimó que aproximadamente 1.500
millones de adultos mayores de 20 años tenían sobrepeso, de los cuales más de 300
millones de mujeres y 200 millones de varones eran obesos. Se estimó que para el año
2015 aproximadamente 2.300 millones de adultos sufrirán sobrepeso y más de 700
millones obesidad (OMS, 2007).
Inicialmente se ha considerado la obesidad como un importante problema de salud
en los países industrializados (Gesta et al., 2006), sin embargo, hoy en día, la obesidad
ha alcanzado proporciones epidémicas en todo el mundo. Muchos estudios
epidemiológicos han demostrado un importante aumento en la frecuencia del sobrepeso
y la obesidad en la población de la mayoría de los países desarrollados y en desarrollo.
Las Figuras 1 y 2 muestran como se ha visto incrementado significativamente el IMC
medio entre los años 1980 y 2008 (Finucane et al., 2011)
IMC medio (varones)
kg/m2
kg/m2
kg/m2
kg/m2
Figura 1: IMC medio en varones a escala mundial en 1980 y 2008. Fuente:
Finucane et al. (2011)
6|Página
Introducción
IMC medio (mujeres)
kg/m2
kg/m2
kg/m2
kg/m2
Figura 2: IMC medio en mujeres a escala mundial en 1980 y 2008. Fuente:
Finucane et al. (2011)
La obesidad está presente en aproximadamente el 20%-30% de la población adulta
de los países occidentales (Flegal et al., 2002). En 2008, Estados Unidos era el país con
la media de IMC en varones más alta del mundo [28,4 kg/m2 (IC95% = 27,9-28,7)].
Además, más de las dos terceras partes de los adultos presentaban sobrepeso u obesidad.
De continuar esta tendencia se estima que para el año 2015 tres cuartas partes de la
población de este país presentarán sobrepeso u obesidad (Wang et al., 2007). Un factor
que probablemente esté relacionado con esta patología pudiera ser el aumento del
consumo de alimentos con alto contenido calórico así como también los estilos de vida
más sedentarios.
A nivel mundial, la prevalencia de obesidad en 2008 se estimó en 9,8% en los
varones y 13.8% en las mujeres, lo que significa que desde 1980 a 2008 esta prevalencia
casi se duplicó, pues en 1980 dicha prevalencia era de 4,8% en los varones y 7,9% en
las mujeres (Finucane et al., 2011). En concreto, en las mujeres, este mismo año las
medias de IMC más altas se observaron en Norte América, Norte de África, y Medio
Oriente, todos ellos con una media de IMC ≥ 28 kg/m2.
7|Página
Introducción
En Europa la prevalencia de sobrepeso y obesidad es bastante variable, siendo
España uno de los países con las tasas más elevadas, más del 25% de la población
adulta padece sobrepeso (Berghofer et al., 2008). En este sentido, el estudio ENRICA,
llevado a cabo entre los años 2008 y 2010 ha puesto de manifiesto que más de un 36%
de adultos españoles presentan obesidad abdominal (Gutierrez-Fisac et al., 2012), lo
que resulta especialmente alarmante por las comorbilidades asociadas a este tipo de
obesidad (Hermsdorff et al., 2011; Phillips et al., 2012). La Figura 3 muestra la
prevalencia de obesidad general en España descrita por el estudio ENRICA.
VARONES
MUJERES
Figura 3: Prevalencia de la obesidad general en varones y mujeres españoles entre
los años 2008 y 2010. Fuente: Gutierrez-Fisac et al. (2012)
Por otro lado, la última Encuesta Nacional de Salud (2006) muestra que en el año
1987 el porcentaje de obesidad en la población adulta en España era de 6,9% en los
varones y del 7,9% en las mujeres. Mientras que en el año 2006 estos valores subieron
hasta el 15,6% en el caso de los varones y el 15,2% en el de las mujeres (Encuesta
Nacional de Salud, 2006). El rango de población adulta de entre 65 y 74 años es el
grupo para el que se encuentran los mayores índices de de obesidad, el 25,5% de los
varones y el 28,3% de las mujeres declaran tener un IMC por encima de 30,0 kg/m2.
En este sentido aún más alarmantes son los datos recogidos por Basterra-Gortari et
al. (2011) donde se muestra que la prevalencia autodeclarada de obesidad mórbida en
España aumentó de un 1,8% en 1993, a un 6,1% en 2006 según datos de la Encuesta
Nacional de Salud (2006).
8|Página
Introducción
1.3. Etiología de la obesidad
La obesidad es una condición heterogénea y multifactorial en cuya aparición están
implicados numerosos elementos causales entre los que se encuentran factores
genéticos, metabólicos, endocrinológicos, ambientales (hábitos dietéticos y actividad
física) y psicosociales. De hecho, en la mayor parte de los sujetos que desarrollan
obesidad es difícil establecer una única causa, atribuyéndose en gran medida a la
interacción entre la carga genética y los factores ambientales relacionados con el estilo
de vida (Weinsier et al., 1998; Marti et al., 2008; Moleres et al., 2012a). Algunos
desequilibrios nutricionales pueden provocar alteraciones en el organismo que resulten
en un fenotipo de tipo ahorrador y que a medio o largo plazo sea responsable de
trastornos metabólicos como la obesidad y el síndrome metabólico.
Las relaciones entre la ingesta energética, el gasto energético, el reparto de
macronutrientes de la dieta y la adipogénesis determinan el crecimiento de la reserva
energética corporal (Martinez et al., 2002). Como se muestra en la Figura 4, cuando la
ingesta energética excede crónicamente al gasto energético o el reparto de
macronutrientes de la dieta favorece la reserva de lípidos, se produce un desequilibrio
que conlleva al desarrollo de sobrepeso y, a largo plazo, de obesidad (Loos & Bouchard,
2003).
Ingesta
energética
Predisposición genética
Gasto
Composición
de la
DIETA
SOBREPESO
OBESIDAD
Adipogénesis
energético
Figura 4: Diagrama que relaciona el balance energético positivo con la
acumulación de grasa, indicando los puntos de actuación de la predisposición
genética. Fuente: Loos & Bouchard (2003)
9|Página
Introducción
1.4. Complicaciones de la obesidad
Son diversos los estudios epidemiológicos realizados en grandes poblaciones que
confirman el dato de que muchas muertes pueden ser atribuidas al exceso de peso y de
hecho, en personas con IMC superior a 30,0 kg/m2, la mitad de las muertes pueden ser
atribuibles a esta patología (Bray, 1996). En Europa una de cada trece muertes se
atribuye a la obesidad (Banegas et al., 2003). Se estimó que la obesidad es el séptimo
factor de riesgo que más mortalidad causa a nivel mundial (Lopez et al., 2006). En
Estado Unidos la obesidad es la segunda causa de muerte prevenible, sólo por detrás del
tabaco (Stewart et al., 2009).
A pesar de todos estos datos, en el rango de población más adulta, el riesgo de
mortalidad y morbilidad asociado a la obesidad es menor que en el rango de población
de adultos de mediana edad. Sin embargo, los gastos en sanidad asociados al sobrepeso
y la obesidad son mayores en este rango de población (Wee et al., 2005)
Estas son algunas de las complicaciones atribuidas a la obesidad:
-
Alteraciones cardiovasculares: La obesidad es responsable de que se produzca
una mayor incidencia de cardiopatía isquémica (Alexander, 2001), así como de un
aumento en la incidencia de la hipertensión arterial (HTA) (Thakur et al., 2001).
Además, en este caso, resulta relevante la distribución de la grasa corporal pues es la
adiposidad abdominal la que se asocia con un mayor riesgo de padecer enfermedades
cardiovasculares y con un perfil lipídico desfavorable (Canoy et al., 2007) y de esta
manera, el índice cintura-cadera se utiliza para valorar la adiposidad central (visceral)
frente a la periférica.
-
Diabetes: El sobrepeso es uno de los principales factores de riesgo para el
desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (Wild & Byrne, 2006; Sanada et al., 2012).
También en este caso son la circunferencia de cintura y el IMC elevados los que se
asocian con el riesgo de desarrollar DM2 (Guh et al., 2009), considerándose el primer
factor causal.
10 | P á g i n a
Introducción
-
Cáncer de colon: Un reciente meta-análisis ha demostrado una mayor
prevalencia de este tipo de cáncer entre sujetos con sobrepeso (Okabayashi et al., 2012).
Además, los resultados de diversos estudios sugieren que la mejor protección frente a
este tipo de cáncer parece ser un peso corporal estable y la actividad física regular
(Giovannucci et al., 1996) y sobre todo que no haya aumento del perímetro de cintura
(Pischon et al., 2006).
-
Cáncer de mama: Estudios epidemiológicos han demostrado una fuerte
asociación entre el IMC y el cáncer de mama después de la menopausia (Renehan et al.,
2008). Aproximadamente el 50% de casos en este tipo de cáncer ocurren en aquellas
mujeres con IMC superior a 29,0 kg/m2 (Ballard-Barbash & Swanson, 1996).
-
Otros tipos de cáncer: el adenocarcinoma de esófago, el cáncer de páncreas,
hígado y vesícula biliar son otros cánceres que presentan la obesidad como un factor de
riesgo para su desarrollo (Danaei et al., 2005).
-
Hipertensión: El sobrepeso es un determinante de la hipertensión arterial
(HTA) (Nguyen & Lau, 2012). Según la National Health and Nutrition Examination
Survey (NHANES), la prevalencia de HTA aumenta conforme aumenta el IMC, de un
24% en aquellos con IMC <25,0 kg/m2 a 54% para los que tienen IMC ≥35,0 kg/m2
(Nguyen et al., 2010).
-
Aparato respiratorio: En los obesos se encuentran disminuidas tanto la
capacidad residual funcional como el volumen de reserva respiratoria. También los
obesos tienden a ventilar exclusivamente los campos aéreos pulmonares superiores, lo
que da lugar a una disminución en la concentración de oxígeno en la sangre. Otro
problema que puede presentarse es la apnea del sueño (Vgontzas et al., 1994; Ong et al.,
2012).
-
Aparato locomotor: La obesidad se ha asociado con la osteoartritis y la artrosis
preferentemente de rodilla, cadera y tobillos (Gelber et al., 1999; Coggon et al., 2001,
Issa & Griffin, 2012). Estas patologías se producen con mayor frecuencia en los obesos,
principalmente por la sobrecarga que supone.
11 | P á g i n a
Introducción
-
Aparato digestivo: Existe una relación evidente entre la obesidad y el reflujo
gástroesofágico (Festi et al., 2009). Un meta-análisis encontró que el sobrepeso y la
obesidad estaban asociados con los síntomas de reflujo gastroesofágico, esofagitis
erosiva, y adenocarcinoma de esófago (Hampel et al., 2005) así como también con
litiasis biliar (Petroni, 2000).
El sobrepeso y la obesidad también deterioran la calidad de vida de quienes las
padecen no solo por todas estas enfermedades específicas derivadas de ellas sino
también por las limitaciones en las actividades cotidianas que pueden conllevar.
También acontece en este sentido el estigma social de la persona obesa, que puede
comprometer al individuo en sus relaciones sociales (Kim et al., 2008)
Además de todo lo mencionado anteriormente, en las personas de mayor edad la
obesidad puede acentuar el deterioro. Sin embargo, encontrar el tratamiento más
adecuado contra la obesidad en este rango de población resulta complicado por los
problemas que puede conllevar la pérdida de peso, como son la pérdida de masa
muscular y de masa ósea.
2. GENÉTICA DE LA OBESIDAD
2.1. Variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad
En las primeras décadas del siglo XX se comenzó a valorar el componente
hereditario de la obesidad, pero sólo recientemente se han obtenido datos objetivos
sobre los genes involucrados en su desarrollo. En el año 1994 Friedman y col.
describieron por primera vez el gen que codifica para la leptina (ob) (Halaas et al.,
1995). A partir de entonces se han producido enormes avances en nuestro conocimiento
sobre la implicación de la genética en el desarrollo de la obesidad. Estudios en familias
y en gemelos han ayudado en gran medida en estos descubrimientos pues han revelado
que entre un 50% y un 80% de la variación en el IMC puede deberse a factores
genéticos (Bell et al., 2005; Hinney et al., 2010).
En las últimas dos décadas hemos pasado de conocer unos pocos genes vinculados
con la acumulación de grasa a conocer más de cincuenta loci que pueden estar
12 | P á g i n a
Introducción
implicados en la predisposición a desarrollar obesidad (Speliotes et al., 2010). Hasta el
momento se considera que la obesidad debida a causas monogénicas no supera el 5%
del total de casos. En éstos está bien establecido que diversas mutaciones en genes que
codifican proteínas implicadas en la regulación del apetito son responsables de
alteraciones patológicas cuyo fenotipo más evidente es la obesidad (Bell et al., 2005;
Farooqi & O'Rahilly, 2005). A día de hoy, como se muestra en la Tabla 3, se han
asociado 11 genes con la obesidad monogénica.
Tabla 3: Genes causantes de obesidad de origen monogénico. Fuente: Ochoa (2007)
Gen
Nombre del gen
CRHR1
CRHR2
GPR24
LEP
LEPR
MC3R
MC4R
NTRK2
PCSK1
POMC
SIM1
Receptor 1 de la hormona liberadora de corticotropina
Receptor 2 de la hormona liberadora de corticotropina
Receptor 24 acoplado a proteína C4
Leptina
Receptor de leptina
Receptor 3 de melanocortina
Receptor 4 de melanocortina
Receptor neurotrófico de tirosinquinasa tipo 2
Proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 1
Proopiomelanocortina
Homólogo 1 de la mente simple de Drosophila
Región
cromosómica
17q12-q22
7p14.3
22q13.2
7q31.3
11p31
20q13.2-q13.3
18q22
19q22.1
5q15-q21
2p23.3
6q16.3-q21
De todas ellas las mutaciones en los genes LEP, LEPR, POMC, MC4R y PCSK1
son particularmente importantes. Se estima que entre las cinco se puede explicar el 5%
de los casos de obesidad severa de desarrollo temprano en niños (Farooqi et al., 2005).
Sin embargo, la mayor parte de los casos de obesidad son de origen poligénico, es
decir, deben su fenotipo a la presencia de diversas variantes genéticas de alta
prevalencia pero con un efecto poco relevante. Cada una de estas variantes genéticas
contribuye de manera sutil al desarrollo de la obesidad, y solo la combinación de varias
hace que el efecto sea más relevante (Hinney & Hebebrand, 2008). Para el estudio de la
obesidad poligénica se han utilizado dos tipos de aproximaciones; estudios de genes
candidatos y estudios de barrido del genoma completo (GWAS).
13 | P á g i n a
Introducción
2.1.1. Estudios de genes candidatos
Estos estudios analizan genes involucrados en vías metabólicas importantes o que
han resultado de interés en estudios realizados en animales (Hinney et al., 2010).
Una limitación importante de estos estudios es que normalmente tienen un reducido
tamaño muestral que no les otorga la potencia necesaria para identificar los efectos
modestos provocados por la obesidad (Vimaleswaran & Loos, 2010). Para corregir esta
limitación en los últimos años se han llevado a cabo estudios con un gran número de
participantes o meta-análisis y a partir de ellos se han encontrado asociaciones sólidas
entre obesidad y diversas variantes genéticas.
El meta-análisis es una herramienta que nos permite reunir toda la información
publicada de manera objetiva y así dar una estimación cuantitativa sintética de todos los
estudios encontrados. El término meta-análisis fue acuñado por Glass en el año 1976
(Glass, 1976) que lo definió como “un análisis estadístico de una amplia serie de
análisis de resultados de estudios individuales con el objetivo de integrar sus hallazgos”.
Se trata de una herramienta estadística que aporta un poder estadístico mayor al de los
trabajos que se incluyen en él y entre sus objetivos están el de resolver incertidumbres
cuando hay estudios contradictorios, mejorar la estimación del tamaño del efecto,
aumentar la potencia estadística y aportar mejoras a la calidad de la investigación
primaria.
Existen dos principales problemas metodológicos a la hora de realizar un metaanálisis:
-
La heterogeneidad entre los estudios incluidos (Higgins & Thompson, 2002).
-
El sesgo de publicación debido a que no todos los estudios realmente
relacionados hayan sido publicados, ya sea por resultados negativos o por no esperados
(Golder et al., 2011).
En los últimos años numerosos estudios han analizado la asociación de diferentes
variantes genéticas y distintos fenotipos asociados con obesidad mediante meta-análisis
(Marti et al., 2006; Jalba et al., 2008; Wang et al., 2010; Yu et al., 2012) y éstos han
permitido confirmar o rechazar dicha asociación (Tabla 4).
14 | P á g i n a
Tabla 4: Resumen de estudios de meta-análisis sobre variantes genéticas asociadas con adiposidad
Gen
ADIPOQ
ADRB2
Variante
G276T
Arg16Gly
Glu27Gln
ADBR3
Trp64Arg
ENPP1/PC-1
GRL
IL6
LEPR
K121Q
Asn363Ser
-174G/C
K109R
Q223R
K656N
MC4R
P1019P
Val103Ile
PPAR2
Ile251Leu
Pro12Ala
TNFalfa
UCP2
G308A
-866G>A
Tamaño muestral Fenotipos asociado con obesidad
Asociación con susceptibilidad a la obesidad
4.328
No hay asociación con obesidad
Glu27 > riesgo de obesidad en Asia, islas del Pacífico, o
10.404
indios americanos
7.399
No asociación con IMC
9.236
Arg64 >IMC
6.528
Arg64 >IMC Japoneses
44.833
Arg64 >IMC Asia del este, no asociación en caucásicos
24.324
Q > Riesgo obesidad
4.792
No asociación con obesidad o IMC
26.944
No asociación con IMC
3.012
No asociación con IMC
Asociado con sobrepeso en estudios de IMC>25 kg/m2
3.263
No asociación con IMC
No asociación con riesgo de sobrepeso/obesidad
2.045
< Riesgo de obesidad en población china
3.263
No asociación con IMC
No asociación con riesgo de sobrepeso/obesidad
1.779
> Riesgo de obesidad en población china
7.713
Ile < Riesgo obesidad
29.563
Ile < Riesgo obesidad
39.879
Ile < Riesgo obesidad
55.195
Ile < Riesgo obesidad
11.435
Ile < Riesgo obesidad
29.914
Ala > IMC
19.136
Ala > IMC en sujetos con IMC≥27 kg/m2
Asociación con susceptibilidad a la obesidad
12.984
G > Riesgo obesidad
Referencia
Yu et al. (2012)
Jalba et al. (2008)
Jalba et al. (2008)
Allison et al. (1998)
Fujisawa et al. (1998)
Kurokawa et al. (2001)
Kurokawa et al. (2008)
Wang et al. (2011)
Marti et al. (2006)
Qi et al. (2006)
Heo et al. (2002)
Bender et al. (2011)
Heo et al. (2002)
Bender et al. (2011)
Yang et al. (2011)
Heo et al. (2002)
Bender et al. (2011)
Yang et al. (2011)
Geller et al. (2004)
Young et al. (2007)
Stutzmann et al. (2007)
Wang et al. (2010)
Stutzmann et al. (2007)
Tonjes et al. (2006)
Masud & Ye (2003)
Yu et al. (2012)
Andersen et al. (2012)
Introducción
2.1.1.1.
Receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2
(PPARG2)
El receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR) es un factor de
transcripción dependiente de ligando que forma parte de de la súper-familia de receptores
hormonales nucleares (Spiegelman, 1998). Su principal función es la de regular la
transcripción de genes implicados en el metabolismo glucídico y lipídico en el adipocito
(Uauy et al., 2000; Tyagi et al., 2011).
Se conocen tres subtipos de PPAR: PPAR, PPAR y PPAR. Éste último se expresa
en tejido adiposo donde activa la diferenciación de adipocitos por medio de la regulación
de la expresión de genes implicados en dicho proceso (Pirat et al., 2012). Además, PPAR
se ha asociado a procesos antiinflamatorios ya que puede inhibir la actividad de factores de
transcripción pro-inflamatorios como AP-1 (proteína activadora 1), STAR (transductores
de señales y activadores de la transcripción) y NF-B (factor nuclear B) (Pascual et al.,
2007).
El gen PPAR se localiza en el cromosoma 3p25 y contiene nueve exones. Se expresa
sobre todo en tejido adiposo donde tiene un papel clave en la adipogénesis y la sensibilidad
a insulina (Pirat et al., 2012). A partir de este gen y por medio de diferentes promotores y
de procesamiento alternativo se forman tres ARNm (1,2 y 3) diferentes que dan lugar a
dos isoformas de la proteína: PPAR1 (generada por ARNm 1 y 3) y PPAR2 (Elbrecht et
al., 1996), como se puede observar en la Figura 6.
PPAR2
A1
A2
B
1
2
3
4
5
6
PPAR1
Figura 6: Esquema de los exones que codifican para las isoformas 1 y 2 de PPAR
16 | P á g i n a
Introducción
El polimorfismo más frecuente de los estudiados en el gen PPAR es el que afecta al
exón B, y por tanto a la proteína PPAR2, y que se debe al cambio de una citosina por una
guanina (C/G) que conlleva la sustitución en el codón 12 de una prolina por una alanina
(Pro12Ala; rs1801282). Los análisis han revelado los efectos del alelo 12Ala in vitro:
cuando el receptor porta este alelo presenta una menor afinidad de unión al ADN y menor
capacidad para inducir la transcripción de los genes diana del PPAR (Deeb et al., 1998).
Esto haría pensar que el alelo 12Ala in vivo debería proteger frente a altos índices de
adiposidad debida la menor actividad del receptor. Sin embargo, diversos estudios
poblacionales apuntan que este alelo se asocia con un aumento en la adiposidad corporal
(Franks et al., 2007; Passaro et al., 2011). La disparidad de los resultados in vitro e in vivo
podrían explicarse, en parte, porque parece ser que en humanos el efecto del polimorfismo
sobre la adiposidad se ve modulado por el grado de IMC y por los niveles de insulina
(Deeb et al., 1998).
2.1.1.2.
Circadian Locomotor Output Cycles Kaput gene (CLOCK)
Los ritmos circadianos o ritmos biológicos son oscilaciones de las variables biológicas
en intervalos regulares de tiempo que condicionan los procesos fisiológicos del cuerpo
humano para llevarse a cabo en el momento óptimo del día. Esto es gracias al desarrollo de
un ciclo circadiano endógeno que se adapta a los estímulos externos de manera que el
cuerpo se anticipa al sueño y a periodos de actividad (Panda et al., 2002).
Muchos aspectos de la fisiología y del comportamiento se ven influenciados por los
ritmos circadianos, incluidos los ciclos sueño-vigilia, actividad cardiovascular, sistema
endocrino, la temperatura corporal, la actividad renal, la fisiología del tracto
gastrointestinal y el metabolismo hepático (Panda et al., 2002; Reppert & Weaver, 2002).
El organismo se rige por un reloj circadiano endógeno que está ubicado en el núcleo
supraquiasmático (SQN) del hipotálamo anterior y que responde al ciclo luz-oscuridad
natural. También se han encontrado reguladores circadianos similares en tejidos periféricos
como el hígado, el intestino y el tejido adiposo, que regulan funciones celulares.
En lo que a adiposidad se refiere, se ha visto que muchas hormonas implicadas en el
metabolismo como la insulina (La Fleur et al., 1999), el glucagón (Ruiter et al., 2003), la
17 | P á g i n a
Introducción
adiponectina (Ando et al., 2005), la corticosterona (De Boer & Van der Gugten, 1987), la
leptina y la grelina (Ahima et al., 1998; Bodosi et al., 2004) se modifican de acuerdo con
la oscilación circadiana. Además, los centros hipotalámicos que controlan las sensaciones
de hambre y saciedad dependen del sistema circadiano y reciben señales del estado
nutricional del organismo por la leptina y otros indicadores humorales que son producidos
por los tejidos periféricos (Welsh et al., 1995). Además, en el adipocito también existen
genes regulados por los ritmos circadianos, y su expresión en el tejido adiposo puede verse
alterada por situaciones patológicas como ocurre en ratones obesos o diabéticos
(Kondratov et al., 2006)
El gen CLOCK se localiza en el cromosoma 4q12 y codifica para un factor de
transcripción implicado en la regulación de los ritmos circadianos. Fue identificado en el
año 1997 por King et al. (1997) mediante la utilización de ratones creados y tratados para
la identificación de genes clave en la actividad circadiana. Se trata de un elemento positivo
imprescindible para el correcto funcionamiento del sistema circadiano central y periférico.
Entre sus funciones está la de heterodimerizar en el citoplasma con la proteína BMAL1
formando un complejo que se desplaza al interior del núcleo. Una vez aquí se une a los
promotores de sus genes diana entre los que se encuentran Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2,
Reverb, Ror, controlando su expresión. Además, el heterodímero formado por CLOCK
y BMAL1 también estimula la trascripción de Bmal1 en sí misma, dando lugar a un lazo de
retroalimentación positiva. CRY y PER son quienes regulan este lazo de retroalimentación
de manera negativa. Heterodimerizan en el citoplasma, se desplazan al núcleo, y desde
aquí inhiben la función del heterodímero CLOCK/BMAL1 (Zanquetta et al., 2010)
(Figura 7).
El heterodímero CLOCK/BALM1 activa la transcripción de genes directamente
implicados en el metabolismo como Ror y Reverb y la familia de factores de
transcripción Ppar. La familia PPAR está involucrada en el metabolismo de la glucosa y
los lípidos así como en la adipogénesis. REVERB y ROR lo están en el metabolismo de
la glucosa, lípidos, lipoproteínas así como en la adipogénesis y la lipogénesis (Zanquetta et
al., 2010) (Figura 8).
18 | P á g i n a
Introducción
Figura 7: Mecanismo molecular del reloj circadiano. Fuente: Zanquetta et al. (2010)
Metabolismo lipídico
Metabolismo de lipoproteínas
Metabolismo glucídico
Adipogénesis
Lipogénesis
Metabolismo lipídico
Metabolismo de lipoproteínas
Diferenciación de adipocitos
Lipogénesis
Metabolismo lipídico
Metabolísmo glucídico
Metabolismo lipídico
Metabolismo glucídico
Adipogénesis
Figura 8: Mecanismo molecular subyacente a la asociación entre los ritmos
circadianos y las vías metabólicas. Fuente: Zanquetta et al. (2010)
19 | P á g i n a
Introducción
Estudios previos han demostrado asociación entre diferentes polimorfismos del gen
CLOCK y el desarrollo de obesidad en distintas poblaciones (Sookoian et al., 2008) pero
probablemente la variante genética más estudiada en este contexto sea el SNP 3111T/C
(rs1801260). Este polimorfismo se localiza en la posición 56301369 del cromosoma 4 y
consiste en el cambio de una timina por una citosina.
Garaulet et al. (2011) describieron diferencias en las horas de sueño, cambios en los
niveles de grelina, alteraciones en el comportamiento alimentario y preferencias nocturnas
en aquellos sujetos que portaban el alelo minoritario C de este polimorfismo y sugirieron
que todas estas diferencias hacían a éstos más resistentes a la pérdida de peso tras una
intervención. En este estudio se propone que la resistencia a la pérdida de peso podría
deberse a problemas de sueño, lo que conlleva cansancio y fatiga que hacen que el sujeto
disminuya su actividad física. De esta manera, el gen CLOCK no estaría directamente
ligado al desarrollo de obesidad sino a cambios en el comportamiento.
Por otro lado, Tortorella et al. (2007) observaron asociación entre el alelo C del
polimorfismo 3111T/C del gen CLOCK y un menor peso corporal en un grupo de mujeres
con trastornos de la conducta alimentaria. Este grupo sugiere que este SNP no predispone a
sufrir anorexia nerviosa o bulimia nerviosa, pero conlleva una mayor pérdida de peso
durante el transcurso de la enfermedad. Además, Scott et al. (2008) propusieron que un
haplotipo que incluía el alelo C de esta variante genética podría proteger frente al
desarrollo de obesidad en un grupo de varones caucásicos. Monteleone et al. (2008) no
encontraron ninguna asociación de este locus con el desarrollo de la obesidad. Por todo lo
anterior parece que no existen resultados concluyentes acerca de la asociación entre la
variante 3111T/C del gen CLOCK y la obesidad.
2.1.2. Estudios asociados del genoma completo (GWAS)
En la actualidad es la herramienta más utilizada para detectar nuevas variantes
genéticas relacionadas con la obesidad y con sus comorbilidades asociadas. El diseño más
común de este tipo de estudios consiste en comparar los genomas de un grupo de personas
con la enfermedad a estudiar (casos) frente a otro grupo de personas sanas (controles) para
detectar variaciones genéticas asociadas a dicha enfermedad. Este método tiene tres
ventajas importantes en comparación con los estudios de genes candidatos (Frayling, 2007)
20 | P á g i n a
Introducción
- Resulta más rentable
- Tiene una resolución mucho mayor
- No requiere individuos relacionados (cuyo reclutamiento es normalmente mucho
más laborioso) y por tanto facilita el obtener mayores tamaños muestrales.
El primer gen que se relacionó incuestionablemente con la obesidad a partir de estos
análisis, tras replicarse su asociación en varias poblaciones diferentes, fue el gen FTO (Fat
Mass and Obesity associated gene) (Dina et al., 2007; Frayling, 2007; Scuteri et al., 2007).
A partir de entonces se han realizado nuevos GWAS en los que se han identificado nuevas
variantes genéticas asociadas a obesidad, hasta más de cincuenta (Chambers et al., 2008;
Loos et al., 2008; Thorleifsson et al., 2009; Willer et al., 2009; Speliotes et al., 2010)
(Figura 5).
Figura 5: Representación del efecto en el incremento del peso corporal por alelo de
riesgo en un individuo de 170 cm de alto. Los loci están ordenados por fecha de
descubrimiento y magnitud de su efecto sobre el IMC. Fuente: Day & Loos (2011)
21 | P á g i n a
Introducción
Recientemente se creó la plataforma GIANT (Genetic Investigation of Anthropometric
Traits) para combinar la información de los GWAS sobre algunos parámetros
antropométricos. Es un consorcio internacional en el que colaboran más de 400 científicos
de distintas instituciones. En relación con los niveles de IMC el trabajo de Speliotes et al.
(2010) reúne información genética de 249.796 sujetos y confirma la asociación de 32
variantes genéticas con el IMC.
A partir de estos resultados, durante los últimos años se han desarrollado diferentes
“scores” de susceptibilidad genética basados en la puntuación obtenida como resultado de
la suma de los alelos de riesgo presentes en cada individuo. Se han desarrollado “scores”
de susceptibilidad genética con 8 (Willer et al., 2009), 9 (Moleres et al., 2012b), 12 (Li et
al., 2010) e incluso 32 de estas variantes genéticas (Speliotes et al., 2010), confirmándose
en todos ellos un efecto aditivo sobre la obesidad (incremento de IMC)
2.1.2.1.
Fat Mass and Obesity Associated gene (FTO)
El gen FTO se descubrió en el año 2002 en un modelo de animal murino (Ft) que tenía
una deleción en la región en la que se localiza este gen (Peters et al., 2002). Codifica para
una demetilasa de ácidos nucleicos dependientes de 2-oxoglutarato que se localiza en el
núcleo celular (Gerken et al., 2007). Se trata de un gen de gran tamaño, ocupa sus 9
exones, más de 400 kb, del cromosoma 16 y se encuentra altamente conservado en
vertebrados (Razquin et al., 2011). Se expresa principalmente en el cerebro, en concreto en
una región del hipotálamo, además de en músculo, tejido adiposo, páncreas y corazón entre
otros (Dina et al., 2007).
Cinco años más tarde de ser identificado el gen FTO dos estudios independientes
descubrieron la relevancia biológica de este gen en el ser humano. Frayling y col. (2007)
identificaron el gen FTO a través de un estudio de asociación a escala genómica (GWAS)
llevado a cabo en 1.924 sujetos con diabetes tipo 2 y 2.938 sujetos sanos. Se asociaron
varios polimorfismos de este gen con la presencia de la diabetes pero también se vio que
esta asociación estaba mediada por el IMC. Otro estudio de este tipo en relación con el
IMC llevado a cabo en 6.148 sujetos de una población aislada de Cerdeña, encontró una
importante asociación entre varios polimorfismos de este gen y el IMC (Scuteri et al.,
2007). En los años siguientes estos resultados se han replicado en diversas poblaciones
22 | P á g i n a
Introducción
caucásicas, especialmente en niños (Rendo et al., 2009). Otros rasgos asociados con la
obesidad como el peso corporal, los niveles de leptina, la masa grasa o la circunferencia de
la cintura han sido asociados con los polimorfismos del gen FTO (Andreasen et al., 2008a;
Zimmermann et al., 2011; Moleres et al., 2012a).
El polimorfismo rs9939609 es la variante genética más estudiada del gen FTO a día de
hoy. Se trata del cambio de una adenina por una timina (A/T) y es el alelo A el que se
asocia con un mayor peso corporal y riesgo de obesidad (Frayling et al., 2007; Lappalainen
et al., 2009; Rendo et al., 2009; Razquin et al., 2011; Moleres et al., 2012a). Varios
estudios han relacionado este polimorfismo con una mayor ingesta así como con la pérdida
del control sobre la alimentación (Cecil et al., 2008; Tanofsky-Kraff et al., 2009).
Los estudios mencionados anteriormente asocian el alelo A del SNP rs9939609 del
gen FTO con mayores índices de adiposidad, sin embargo, no todos los estudios confirman
estos resultados. Hardy et al. (2010) proponen que el efecto de esta variante genética en la
adiposidad varía con la edad. Este grupo observó en un estudio longitudinal con un
seguimiento de 53 años que el efecto de este polimorfismo era fuerte en la niñez y la
adolescencia, alcanzando su mayor efecto en adultos jóvenes, alrededor de los 20 años. Sin
embargo, ese efecto parecía atenuarse con la edad. Por otro lado Jacobsson et al. (2011)
obtuvieron resultados similares en una población de 70 años de edad, observaron que
ninguno de los SNPs o haplotipos estudiados en el gen FTO estaba relacionado con el
consumo total de energía o con la adiposidad.
2.2. Interacción gen-estilo de vida
Como se muestre en la Figura 9 el peso corporal está determinado por una
combinación de factores genéticos y ambientales relacionados con el estilo de vida, así
como por las interacciones entre ellos (Marti et al., 2008; Ordovas et al., 2011; Moleres et
al., 2012a). De esta manera, mientras que algunos individuos parecen ser susceptibles a
cambios en su estilo de vida, otros parecen ser resistentes a éstos.
23 | P á g i n a
Introducción
INTERACCIONES
GENÉTICA
SNPs
Haplotipos
“Scores” genéticos
Copy number variation
OBESIDAD
ESTILOS DE VIDA
Composición de
la dieta
Actividad física
INTERACCIONES
Figura 9: Factores influyentes en el desarrollo de la obesidad. Fuente: Ochoa (2007)
Actualmente se sabe que diversos factores ambientales pueden modular el efecto de
estas variantes genéticas implicadas en el desarrollo de la obesidad.
2.2.1. Nutrigenética
En los últimos años la ciencia de la nutrición ha acuñado el término “genética
nutricional” todavía en desarrollo. Esta ciencia trata de aplicar la biología de sistemas a la
investigación nutricional (van Ommen & Stierum, 2002; van Ommen, 2004) con el fin de
comprender cómo la nutrición influye en las vías metabólicas y en el control homeostático
y entender también cómo esta regulación se ve alterada en el inicio de la aparición de una
enfermedad relacionada con la dieta. Además, también trata de determinar hasta qué punto
la carga genética del individuo contribuye a la aparición de la enfermedad (Ross, 2007).
Dentro de este concepto se engloban los términos “nutrigenómica” y “nutrigenética”.
La nutrigenómica hace referencia al análisis de las diferencias entre los nutrientes con
respecto a la regulación de la expresión de genes (Mutch et al., 2005) y la nutrigenética
estudia el impacto o la influencia de las variantes genéticas de los individuos en la
respuesta metabólica a los nutrientes (Gillies, 2003) (Figura 10). Así, el progreso de ambas
disciplinas viene ligado a la futura utilización de dietas personalizadas para retrasar el
inicio de la enfermedad y optimizar el mantenimiento de la salud humana (Marti et al.,
2005; de Luis et al., 2008).
24 | P á g i n a
Introducción
NUTRIGENÓMICA
NUTRIGENÉTICA
Figura 10: Nutrigenómica y nutrigenética, dos caras de la misma moneda. Fuente:
Mutch et al. (2005)
Un objetivo importante de la nutrigenética es formular recomendaciones nutricionales
en relación a los riesgos y a los beneficios de ciertos componentes dietéticos o incluso de
dietas concretas. Es por esto que también se le ha llamado “nutrición individualizada” o
“nutrición personalizada” (Ordovás et al., 2005). Este trabajo se centra en la obesidad
como desenlace pero el estudio de las interacciones gen-dieta resulta muy interesante en el
ámbito de la investigación de muchos desórdenes metabólicos (Ordovas et al., 2011),
como por ejemplo el estudio del metabolismo lipídico (Garcia-Rios et al., 2012).
En el caso de la obesidad es evidente su relación con un exceso en la ingesta calórica
pero no todos los sujetos responden de igual forma. Estudios en familias de adopción
(Stunkard et al., 1986) y en gemelos (Price & Gottesman, 1991) han demostrado que el
peso corporal viene determinado por la influencia de factores genéticos y ambientales.
De entre las variantes genéticas más estudiadas en el campo de la nutrigenética en
relación con la obesidad se encuentran el polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 y el
rs9939609 del gen FTO. En las Tablas 5 y 6 se muestra un resumen de aquellos estudios
que han encontrado interacción entre distintos componentes de la dieta y estas variantes
genéticas sobre el peso corporal en poblaciones adultas.
25 | P á g i n a
Introducción
Tabla 5: Resumen de los estudios que analizan interacciones entre el polimorfismo
Pro12Ala del gen PPARG2 y distintos componentes de la dieta en relación a la
obesidad. Fuente: Razquin et al. (2011)
Población adulta
Sujetos españoles con un
elevado riesgo cardiovascular
(n=774)
Interacción con el SNP
Pro12Ala
Dieta Mediterránea con
un alto consumo de
aceite de oliva virgen y
nueces en sujetos 12Ala
Efecto en el fenotipo
Menor
crecimiento del
perímetro de la
cintura
Referencia
Razquin et al.
(2009)
Mujeres del NHS de EEUU
(n=2141)
Bajo consumo de AGM
en sujetos 12Ala
Mayor IMC
Memisoglu et al.
(2003)
Sujetos canadienses del
“Quebec Family Study”
(n=720)
Alto consumo de grasas
en los sujetos Pro12Pro
Mayor IMC y
perímetro de
cintura
Robitaille et al.
(2003)
Sujetos obesos y controles del
estudio WPIC-Heidelberg
(n=308)
Alto consumo de ácido
araquidónico en sujetos
12Ala
Mayor riesgo
de obesidad
Nieters et al. (2002)
Sujetos españoles obesos y
controles (n=313)
Alto consumo de HC en
los sujetos 12Ala
Mayor riesgo
de obesidad
Marti et al. (2002a)
Alto ratio AGP:AGS en
sujetos 12Ala
Mayor IMC
Luan et al. (2001)
Sujetos caucásicos no
diabéticos (n=592)
Alelo de riesgo: 12Ala
Tabla 6: Resumen de los estudios que analizan interacciones entre el SNP rs9939609
del gen FTO y distintos componentes de la dieta en relación a la obesidad
Población adulta
Interacción con el SNP
Pro12Ala
Alto consumo de AGS en
sujetos AA
Efecto en el
fenotipo
Mayor IMC
Sujetos suecos (n=4839) del
“Malmö Diet and Cancer Study “
Alto consumo de grasas
en los sujetos AA
Mayor IMC
Sonestedt et al.
(2009)
Sujetos suecos (n=4839) del
“Malmö Diet and Cancer Study “
Alelo de riesgo: A
Bajo consumo de HC en
los sujetos AA
Mayor IMC
Sonestedt et al.
(2009)
Sujetos del estudio GOLDN
(n=1069)
26 | P á g i n a
Referencia
Corella et al. (2011)
Introducción
En el caso del gen FTO son más numerosos los estudios que han encontrado
interacciones en poblaciones de niños y adolescentes pues parece ser que su efecto
“obesogénico” tiene una mayor relevancia en esta etapa de la vida y desaparece en etapas
más avanzadas (Hardy et al., 2010; Jacobsson et al., 2011).
2.2.2. Interacción gen-actividad física
En el mantenimiento del balance energético la actividad física juega un papel
importante. Es evidente que en los últimos años el estilo de vida sedentario ha favorecido
un balance energético positivo, desencadenante de la obesidad (Chakravarthy & Booth,
2004).
Son numerosos los estudios que describen interacciones entre variantes genéticas y la
actividad física sobre el IMC y el riesgo de obesidad. Por ejemplo, Corbalan et al. (2002)
observaron que en mujeres obesas la presencia del alelo 27Glu del polimorfismo Gln27Glu
del gen ADRB2 parecía impedir el beneficio asociado a altos niveles de actividad física
sobre el IMC en comparación con aquellas mujeres que no portaban este alelo. Por otro
lado, el trabajo de Marti et al. (2002b) sugería que el efecto del loci Trp64Arg en el gen
ADRB3 sobre el riesgo de obesidad podía ser modificado por los niveles de actividad
física. Así, el alelo de riesgo 64Arg se asociada con obesidad en las mujeres con hábitos de
vida sedentarios pero no en aquellas físicamente activas. En el caso de la variante genética
rs7566605 (G/C) del gen INSIG2 un estudio observó interacción con la actividad física y
determinó un mayor IMC en los sujetos físicamente inactivos con el genotipo CC frente a
los sujetos físicamente inactivos portadores del alelo G (Andreasen et al., 2008b). También
se ha observado interacción sobre la adiposidad con la actividad física en variantes de los
genes LIPE (Garenc et al., 2009), PPARGC1A (Ridderstrale et al., 2006) y UCP3 (Otabe
et al., 2000), entre otros.
En los últimos años el SNP para el que más se ha estudiado su interacción con la
actividad física sobre la adiposidad es el rs9939609 del gen FTO. Muchos estudios
observan que el efecto de esta variante genética sobre la obesidad podría quedar atenuado
por altos niveles de actividad física (Andreasen et al., 2008a; Rampersaud et al., 2008;
Cauchi et al., 2009; Jacobsson et al., 2009; Sonestedt et al., 2009; Vimaleswaran et al.,
2009; Lee et al., 2010; Ruiz et al., 2010; Scott et al., 2010; Xi et al., 2010; Ahmad et al.,
27 | P á g i n a
Introducción
2011; Sonestedt et al., 2011). Sin embargo, algunos estudios no consiguieron replicar esta
asociación (Tan et al., 2008; Jonsson et al., 2009; Lappalainen et al., 2009; Kaakinen et
al., 2010; Liem et al., 2010; Liu et al., 2010). Para conocer el alcance de la interacción
entre esta variante genética y la actividad física sobre la adiposidad Kilpelainen et al.
(2011) recogieron la información disponible, 45 estudios con un total de 218,166 adultos, y
realizaron un meta-análisis. Concluyen que el riesgo de obesidad asociado a este
polimorfismo descendía en un 27% en aquellos sujetos físicamente más activos.
28 | P á g i n a
Introducción
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43 | P á g i n a
OBJETIVOS
Objetivos
El objetivo principal del presente trabajo es determinar el posible efecto que ejercen
diversas variantes genéticas en el desarrollo de sobrepeso y obesidad, así como su
interacción con el estilo de vida (dieta y actividad física) en una población mayor de 55
años de la cohorte SUN.
Los objetivos específicos son los siguientes:
1. Conocer el efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 sobre el
IMC en la población del estudio SUN y mediante meta-análisis en una población
ampliada de 49.092 sujetos.
2. Estudiar el efecto conjunto de los polimorfismos rs9939609 del gen FTO y Pro12Ala
(rs1801282) del gen PPARG2 y del estilo de vida (dieta y actividad física) sobre el
riesgo de obesidad en población mayor de 55 años de la cohorte SUN.
3. Analizar el efecto del polimorfismo 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK, implicado
en la regulación de los ciclos circadianos, y su interacción con la actividad física sobre
el riesgo de sobrepeso y obesidad en población mayor de 55 años de la cohorte SUN.
47 | P á g i n a
SUJETOS Y MÉTODOS
Sujetos y Métodos
1. EL ESTUDIO SUN
1.1. Características generales
Este estudio forma parte del Proyecto SUN. El Proyecto SUN es una cohorte de
graduados universitarios que fue diseñada para establecer la asociación entre la dieta y
la ocurrencia de enfermedades y patologías crónicas. Entre los efectos a valorar están
incluidos el sobrepeso, la obesidad y el cambio de peso a lo largo del tiempo (MartinezGonzalez et al., 2002b). Se trata de un estudio de cohortes prospectivo y dinámico, es
decir, con reclutamiento permanentemente abierto. La cohorte fue diseñada en
colaboración con la Escuela de Salud Pública de Harvard usando una metodología
similar a la de las grandes cohortes Americanas como la Nurses’ Health Study (NHS) o
la Health Professionals Follow-up Study (HPFS) (Martinez-Gonzalez et al., 2002b).
Antes de comenzar el reclutamiento de los participantes, se realizó un estudio piloto
para valorar la viabilidad de la cohorte. En este estudio piloto se comprobó que existía
suficiente variabilidad en el consumo de los alimentos más representativos de la Dieta
Mediterránea, confirmando que esta población ofrecería un rango de exposiciones
suficiente como para detectar posibles asociaciones dieta-enfermedad (Sanchez-Villegas
et al., 2002).
El reclutamiento de los participantes se inició en diciembre de 1999 y se ha
realizado en diversos colectivos:

Agrupación de graduados de la Universidad de Navarra (Alumni
Navarrensis).

Colegio de Enfermería de Navarra.

Miembros con título universitario de la aseguradora sanitaria de la Clínica
Universitaria [Asistencia Clínica Universitaria de Navarra (ACUNSA)].

Alumnos recién graduados de la Universidad de Navarra.
51 | P á g i n a
Sujetos y Métodos

Padres (con título universitario) de alumnos actuales de la Universidad de
Navarra.

Miembros de otros colegios profesionales de diversas provincias españolas.
A los miembros de estos colectivos se les envió una carta de invitación,
exponiéndoles brevemente los objetivos del estudio, explicándoles lo que supondría su
participación y la colaboración que se les exigiría a lo largo del tiempo. Junto con la
carta de invitación, se proporcionaba el cuestionario basal de la cohorte y un sobre de
respuesta a franquear en destino.
El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Clínica de la
Universidad de Navarra. Se consideró que la respuesta al cuestionario equivalía al
consentimiento informado de los individuos a participar en el estudio (MartinezGonzalez et al., 2002b).
Para este subestudio se seleccionó a todos aquellos participantes del Proyecto SUN
que en el momento en el que fueron reclutados eran mayores de 55 años. Todos los
voluntarios que participaron en el estudio firmaron un consentimiento informado
(Anexo 1). En mayo de 2008 se comenzaron a enviar las cartas de participación así
como los kits para la recogida de saliva de los cuales se extraería el ADN. Se enviaron
1.619 propuestas de participación de las que se obtuvieron 1.247 respuestas. 108
personas decidieron no participar y 1.085 contestaron afirmativamente. Finalmente se
recibieron de vuelta 986 kits de saliva.
1.2. Cuestionario basal
Una vez que el participante contesta el cuestionario basal y lo envía al
departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la Universidad de Navarra,
éste se procesa de manera estandarizada. En primer lugar, los datos ‘administrativos’
(nombre, direcciones) del participante se introducen en una base de datos (base de datos
administrativa) cuyo acceso es restringido y no tiene conexión a la red. A continuación,
se lleva a cabo la supervisión manual para verificar si se contestó correctamente y la
codificación del cuestionario para algunas variables. Posteriormente, se realiza la lectura
52 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
óptica del mismo, pasando esa información a una base de datos en formato SPSS donde
a cada participante sólo se le identifica con un código numérico. Así se mantiene en
todo momento la confidencialidad respecto a la identidad de los participantes.
En el cuestionario basal se pueden distinguir diversos apartados. Un ejemplar del
mismo se puede consultar en el Anexo 2.
1.2.1. Variables socio-demográficas
El cuestionario recoge información sobre fecha de nacimiento, sexo, nivel máximo
de estudios alcanzado, carrera universitaria cursada, estado civil, situación laboral,
número de hijos y número de personas con las que vive el participante.
1.2.2. Actividad física y otras variables de estilo de vida
Para la valoración de la actividad física se utiliza un cuestionario de frecuencia de
práctica de actividades basado en el empleado en el NHS y el HPFS (Tanasescu et al.,
2003; Hu et al., 2004). El cuestionario utilizado en el estudio SUN indaga sobre la
participación en 17 actividades deportivas diferentes y el tiempo semanal dedicado a
cada una de ellas (10 categorías: “desde nunca” a “más de 11 horas a la semana”).
También se pregunta sobre los meses al año que se practica cada actividad para tener en
cuenta la variabilidad estacional. Se añade otra pregunta para cada actividad sobre el
número de meses al año en que se practica. Para cuantificar el volumen de actividad
física durante el tiempo libre se asignan equivalentes metabólicos (METs) a cada
actividad. Los METs representan la cantidad de energía empleada por el organismo
durante la realización de una actividad física respecto a la empleada estando sentado y
en reposo (Ainsworth et al., 2000). Para estimar la cantidad total de actividad física en
una semana (METs-horas) se multiplicó el número de horas semanales dedicadas a una
determinada actividad por la asignación de equivalentes metabólicos específica de esa
actividad. Por último, sumando los METs-horas correspondientes a todas las actividades
durante una semana se obtuvo la cantidad total de METs-horas/semana de cada
participante en el estudio, que comprobamos que estaba adecuadamente correlacionada
(Rho de Spearman=+0,51; p=0,002) con el gasto energético medido de forma objetiva
53 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
con un acelerómetro triaxial en un estudio de validación realizado en una submuestra de
la cohorte (Martinez-Gonzalez et al., 2005).
Otras variables de estilo de vida que se recogían en el cuestionario eran: hábito
tabáquico, exposición pasiva al tabaco, consumo de alcohol y hábito de picotear entre
comidas. Se recogieron otras variables no relacionadas con los objetivos de este estudio
como son las referentes a conducción bajo los efectos del alcohol, uso de cinturón de
seguridad y/o casco, número de kilómetros conducidos anualmente en moto y/o coche,
y uso de cremas fotoprotectoras.
1.2.3. Variables clínicas y antropométricas
El cuestionario incluía preguntas sobre la presencia de un diagnóstico médico de
diversas
manifestaciones
de
enfermedad
cardiovascular,
cáncer,
diabetes,
hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, entre otras patologías. Asimismo, se recogía
información sobre los antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular,
hipertensión arterial (HTA), cáncer, diabetes y obesidad.
La información sobre el peso y la talla era auto-declarada. En un estudio realizado
en todos los participantes del estudio SUN que habían sido pesados y tallados en la
Clínica Universidad de Navarra en un plazo no superior a 3 meses tras responder al
cuestionario, se observo un error relativo medio para el peso de –1,45% (IC 95%: –
2,03% a –0,86%) y de –2,64% (IC 95%:–3,70% a –1,60%) para el IMC (Bes-Rastrollo
et al., 2005).
1.2.4. Evaluación dietética
La dieta se valoró utilizando un cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de
consumo de alimentos (CSFC) previamente validado en España por (Martin-Moreno et
al., 1993) y recientemente vuelto a validar (de la Fuente et al., 2010; Fernandez-Ballart
et al., 2010). En el estudio de validación de este cuestionario, comparando la ingesta de
nutrientes según el cuestionario y según tres registros de 4 días cada uno, separados 3
meses entre sí, se observaron unos coeficientes de correlación atenuados entre un
mínimo de 0,45 para la vitamina A y un máximo de 0,90 para el consumo de alcohol.
En relación con el grado más grosero de mala clasificación, únicamente el 3% de los
54 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
individuos clasificados en el quintil más alto o más bajo según el registro de alimentos
tenían asignado el quintil más bajo o más alto según el CSFC. Este CSFC ya fue
utilizado previamente por el departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la
Universidad de Navarra en un estudio de casos y controles para evaluar factores
dietéticos asociados con la incidencia de un primer infarto de miocardio (FernandezJarne et al., 2002; Hernandez-Diaz et al., 2002; Martinez-Gonzalez et al., 2002c;
Martinez-Gonzalez et al., 2002a; Fernandez-Jarne et al., 2003).
Al cuestionario original de Martín-Moreno se le han añadido algunas pequeñas
modificaciones para mejorar su adaptación a los objetivos específicos del proyecto
SUN. La versión empleada en el proyecto SUN cubre 136 ítems e incluye una sección
de preguntas abiertas para suplementos de vitaminas y/o minerales y otros alimentos no
especificados en el cuestionario junto con otra nueva sección más específica sobre los
patrones de consumo que son típicos de la Dieta Mediterránea (por ejemplo: vino y
grasas) y algunas cuestiones sobre actitudes y prácticas frente a los alimentos y la salud.
Además, se incluye una pregunta específica indagando sobre el seguimiento de dietas
especiales.
Para cada uno de los alimentos incluidos en el cuestionario se especifica un tamaño
de la ración y se ofrece la posibilidad de elegir entre 9 posibles frecuencias de consumo
de ese alimento (desde ‘nunca o casi nunca’ hasta ‘más de seis veces al día’). Este tipo
de cuestionarios ofrecen una buena aproximación a la dieta habitual del individuo.
2. ANÁLISIS DE VARIANTES GENÉTICAS
2.1. Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó a partir de una muestra de saliva, recibida por
correo postal, de los participantes. Con este fin se envió a cada uno de los voluntarios
un kit diseñado para la recogida de saliva (Oragene®ADN Self-Collector kit- OG250).
Cada voluntario recibió un sobre franqueado con el kit, debía rellenarlo según las
instrucciones y volver a enviarlo. El kit está diseñado para ser almacenado a
temperatura ambiente durante años o de forma indefinida si se almacena entre 15ºC y
55 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
20ºC, gracias a la solución Oragene•ADN. Esta solución es un estabilizador de ADN
que es liberada al girar la tapa para cerrar el kit. La capacidad del kit es de unos 4 ml de
saliva y el promedio del volumen de muestra recibido es de 5,1 ml. Existen estudios que
certifican la buena calidad del ADN genómico obtenido a partir de saliva humana
(Hansen et al., 2007).
En total se recibieron 986 kits y se extrajo el ADN según el protocolo facilitado por
el laboratorio. Primero se trata de lisar las células con un reactivo que facilita el
laboratorio Oragene al realizar el pedido de los kits. Una vez lisadas se llega a precipitar
el ADN gracias a una serie de centrifugaciones. Cuando el ADN ha precipitado se
diluye en un buffer en el que se encuentra totalmente estable. Cada muestra fue
cuantificada con el espectrofotómetro NanoDrop para determinar la concentración de la
solución madre de ADN, a partir de la cual se realizaron diluciones con las
concentraciones adecuadas de ADN para las diferentes técnicas de detección de
polimorfismos.
2.2. Protocolo para la detección de variantes genéticas
El análisis de las muestras de ADN genómico obtenido de la saliva se realizó
mediante el procedimiento de PCR a tiempo real multicolor o PCR fluorigénica a punto
final. Este procedimiento consiste en la detección de polimorfismos mediante el Sistema
de Detección de Secuencias Perkin Elmer (SDS PE) ABI PRISM 7900. Este proceso se
da en dos etapas diferentes:
1.
PCR cuantitativa
2.
Discriminación alélica a punto final.
La técnica de PCR tiene el mismo fundamento que la PCR tradicional en cuanto a
que utiliza unos cebadores específicos para amplificar la región del gen que interesa
para su estudio. La ventaja que incorpora es que incluye unas sondas específicas de
dicha región, marcadas con fluorescencia que permiten detectar el número de copias
generadas en cada ciclo de PCR.
56 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
En el caso de la detección de polimorfismos, las sondas son específicas de alelo, es
decir, que en cada reacción de PCR se introducen dos tipos de sondas que son idénticas
entre sí, excepto en una base que es el polimorfismo puntual que queremos detectar y
que además están marcadas con diferentes fluorocromos. Las sondas únicamente emiten
fluorescencia cuando se han unido a su región complementaria. De esta forma se pueden
diferenciar los homocigotos de cada alelo y el heterocigoto según se detecte un tipo de
fluorescencia u otro o ambos (Figura 13).
La emisión de fluorescencia en cada muestra es recogida por un programa asociado
al soporte de PCR a tiempo real ABI PRISM 7900HT, que indica los valores de emisión
de los dos fluorocromos para cada muestra.
Figura 12. Fundamento de la discriminación alélica
La PCR se realizó en placas de 384 pocillos (PCR microplate, Axygen scientific)
conteniendo cada uno de ellos un volumen final de 10 µL. De este volumen 5 µL son de
ADN a una concentración de 10 ng/µL y 5 µL de una mezcla que contiene 4.750 µL de
Master mix (Taqman Universal Master Mix, Applied biosystems) y 0.250 µL de de la
mezcla de los dos cebadores y las dos sondas específicas de la región que comprende el
polimorfismo.
57 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
Una vez añadidos todos los reactivos a la placa, ésta es sellada con una lámina
transparente para evitar la evaporación y la contaminación de las muestras, y es
introducida en el detector de secuencias (PCR a tiempo real). En este soporte la mezcla
es incubada en las siguientes condiciones: a 95ºC durante 10 minutos y posteriormente
se repite durante cuarenta ciclos el proceso a 92ºC durante 15 segundos y 60ºC durante
1 minuto.
Figura 13. Amplificación del gen por RT-PCR
Tras este proceso en el que obtenemos las curvas de amplificación de cada muestra
que representan la sonda que se ha unido específicamente, se realiza la discriminación
alélica a punto final propiamente dicha. En este punto la misma placa es incubada
durante 1 minuto a 60ºC y el programa procesa los datos de emisión de fluoresecencia
mostrando los valores para ambos fluorocromos (FAM y VIC) que son interpretados
según los valores de los controles:

Dos pocillos contienen agua ultrapura milli-Q más la mezcla de Master
mix y sondas/cebadores.

Se han hecho duplicados de un 25% de las muestras para comprobar los
resultados obtenidos.
58 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
Figura 14. Análisis de la discriminación alélica
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El análisis descriptivo de la población según los diferentes grupos (Ej.
Polimorfismo) se realizó mediante pruebas paramétricas como los test de t-student para
muestras independientes y el del análisis de la varianza (ANOVA) (Martinez-Gonzalez
et al., 2006).
El test de chi-cuadrado (χ2) se aplicó para evaluar el equilibrio de Hardy-Weinberg,
así como para estudiar la distribución de las frecuencias de los genotipos y las variables
cualitativas de interés, en este caso la presencia de sobrepeso u obesidad (MartinezGonzalez et al., 2006).
Con el fin de analizar la fuerza de asociación entre los posibles genotipos y el IMC
se realizaron modelos de regresión lineal, incluyendo como covariables aquellas
estimadas necesarias para ajustar el modelo (sexo, edad, energía total y actividad física)
59 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
(Martinez-Gonzalez et al., 2006). También se estudió esta asociación mediante el
análisis de covarianza (ANCOVA) ajustando por las mismas variables de confusión.
El riesgo o la protección que ejercían los posibles genotipos sobre el riesgo de
padecer sobrepeso u obesidad se analizó mediante un modelo de regresión logística, a
través de la estimación de la odds ratio (OR). Este modelo fue ajustado por los mismos
factores de confusión que los modelos de regresión lineal y ANCOVA (MartinezGonzalez et al., 2006).
Las pruebas de razón de verosimilitud se realizaron para estudiar la posible
interacción entre los genotipos y los distintos factores de estilo de vida sobre el riesgo
de desarrollar sobrepeso u obesidad. También se estudió esta misma interacción sobre
los niveles de IMC.
Con el fin de controlar la aparición de falsos positivos debido al análisis múltiple se
realizó el test de Benjami-Hochberg para comparaciones múltiples (Benjamini &
Hochberg, 1995).
El valor del punto medio de algunas de las variables estudiadas (consumo de
carbohidratos o niveles de actividad física) se presentó como mediana. El nivel de
significación estadística se fijó en p<0,05 y el de tendencia o significación estadística
marginal en p<0,10. Los datos fueron analizados con el programa estadístico SPSS
versión 15.0 para Windows XP (SPSS, Inc., Chicago, EE.UU).
60 | P á g i n a
Sujetos y Métodos
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63 | P á g i n a
RESULTADOS
CAPÍTULO 1
Pro12Ala variant of the PPARG2 gene increases body mass index: an
updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects
Resultados: Capítulo 1
Pro12Ala variant of the PPARG2 gene increases body mass index:
an updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects
Cecilia Galbete, Estefanía Toledo, Miguel Ángel Martínez-González,
J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
Enviado a Obesity 15-Sept.-2011,
Primera revisión 21-Dic.-2012,
Segunda revisión 6-Feb.-2012
Resumen
El gen del receptor activado por el proliferador de peroxisomas gamma 2 (PPARG2) ha
sido ampliamente estudiado en su relación con la obesidad y los desordenes
metabólicos. En este sentido, se han publicado un gran número de trabajos sobre la
asociación entre el polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 con el índice
de masa corporal (IMC=kg/m2), sin embargo, los resultados son controvertidos. El
objetivo de este meta-análisis fue estudiar el efecto del polimorfismo Pro12Ala del gen
PPARG2 sobre el IMC.
Con este propósito se recogieron todos aquellos datos publicados sobre este tema antes
de enero del 2011 así como nuestros propios datos. Éstos últimos se referían a una subpoblación adulta mayor de 55 años de la cohorte SUN (Seguimiento Universidad de
Navarra). En total se reunieron 75 estudios independientes con los que se que se llegó a
agrupar 49.092 sujetos (39.806 portadores del genotipo Pro12Pro y 9.286 portadores del
alelo Ala).
El análisis de los datos reveló un mayor IMC en los sujetos portadores del alelo Ala. Se
estimó un incremento global de +0,065 kg/m2 (IC95%=0,026-0,103, p=0,001) en los
sujetos portadores de este alelo frente a los no portadores. El análisis de los datos
recogidos también mostró que existía heterogeneidad entre los estudios (p de
heterogeneidad < 0,001) aunque parece que no existía sesgo de publicación entre los
trabajos reunidos. Además, también se observó que la asociación entre el alelo Ala y el
IMC era más fuerte en la subpoblación de varones caucásicos (estimación global =
+0,090, IC95%=0,023-0,148, p=0,002, p de heterogeneidad = 0,121).
69 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Pro12Ala variant of the PPARG2 gene increases body mass index:
an updated meta-analysis encompassing 49,092 subjects
Cecilia Galbete, Estefanía Toledo, Miguel Ángel Martínez-González,
J. Alfredo Martínez, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
1
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology, University of
Navarra, Pamplona, Spain
2
Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra,
Pamplona, Spain
3
Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain
CORRESPONDING AUTHOR
Dr. Amelia Marti.
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology
University of Navarra
C/Irunlarrea s/n
31008, Pamplona, Navarra, SPAIN
Phone: +34 948425600
Fax: +34 948425740
E-mail: amarti@unav.es
71 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
ABSTRACT
The peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) gene has been
intensively studied with relation to obesity and metabolic-disorders. Indeed, a large
number of studies assessing the association between the PPARG2 polymorphism
Pro12Ala (rs1801282) and body mass index (BMI) have been published with some
controversial results. In this meta-analysis we investigated the effects of Pro12Ala
polymorphism of PPARG2 gene on BMI.
We collected externally published data and included our own novel data from a study in
the elderly participants (>55 years) of a Mediterranean cohort, the SUN (“Seguimiento
Universidad de Navarra”) Project (n=972). A total of 75 independent studies with
49,092 subjects (39,806 with the genotype Pro12Pro and 9,286 carrier subjects of the
Ala allele) were included.
The meta-analysis revealed a higher BMI with an overall estimation of +0.065 kg/m2
(95%CI=0.026-0.103, p=0.001) for homo-/heterozygous carriers of the Ala allele of the
PPARG2 gene in comparison to non-carriers. The analysis also showed that there was
heterogeneity (p for heterogeneity <0.001), but funnel plots did not suggest apparent
publication bias. Furthermore, the association between the Pro12Ala polymorphism of
PPARG2 gene and increased BMI was stronger in Caucasian. Thus, carriers of the Ala
allele had significantly higher BMI than non carriers in a subsample of 6,528 Caucasian
men subjects (standardized mean difference =0.090, 95%CI=0.032-0.148, p=0.002, p
for heterogeneity =0.121).
This updated meta-analysis showed that carriers of the Ala12 allele of PPARG2 gene
had a higher average BMI.
Running head: Pro12Ala SNP of PPARG2 gene increases BMI
72 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
INTRODUCTION
The peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2) is a nuclear
receptor expressed mainly in adipose tissue that exerts an essential role in the regulation
of adipocyte differentiation, lipid storage and insulin sensitization (1). PPARG2 also
plays a key role in the entraining of adipose tissue lipid metabolism to nutritional state.
The PPARG2 gene activation leads to upregulation of genes that mediate fatty acid
uptake and trapping (2).
The PPARG2 gene is located in the chromosome 3p25; the Pro12Ala gene variant
(rs1801282) of this gene, a missense mutation on exon B highly prevalent in the
Caucasian population, has been controversially associated with obesity risk (3). This
mutation is a C→G substitution that results in the conversion of proline to alanine at
residue 12 of the PPARG2 protein (3). Functional analysis revealed that the receptor
expressing this allele displays reduced deoxyribonucleic acid (DNA)-binding affinity
and impaired transcriptional activity in target genes (4).
Two previous meta-analyses assessing the role of Pro12Ala of the PPARG2 gene on
BMI and diabetes-related traits have been published (5-6). In 2003 Masud et al. (5)
conducted a meta-analysis to explore the effect of this Pro12Ala gene variant
(rs1801282) on BMI in 19,136 subjects from 30 studies. They found a stronger
association between the Ala12 allele and BMI in subjects with BMI≥27 kg/m2, whereas
this association was not detected in individuals with BMI<27 kg/m2. In 2006, Tönjes et
al. (6) performed another meta-analysis on the effect of the same SNP (rs1801282) of
PPARG2 on diabetes-related traits in pre-diabetic subjects. They showed a direct
association between carrying the Ala allele and greater BMI in 28,734 subjects from 45
studies.
A number of studies evaluating the association between the Pro12Ala polymorphism of
the PPARG2 gene and BMI have been reported since 1998. In the present study we
pooled data obtained after a comprehensive and systematic literature review to
overcome the limitations of single study research work. Meta-analysis provides more
reliable results by reducing the probability that random errors will produce falsepositive or false-negative associations (7). In our meta-analysis we included novel data
73 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
(n=972) from a Mediterranean study (older participants of the SUN “Seguimiento
Universidad de Navarra” cohort).
SUBJECTS AND METHODS
Subjects
This study was conducted within the framework of the SUN Project (8). This is a
dynamic cohort study including only university graduates initiated in December 1999 in
Spain. The survey and procedures have been previously described elsewhere (8-9). For
this study, elderly participants of the SUN project, those aged more than 55 years old
when the basal questionnaire was completed, were invited to participate. Each volunteer
received a kit designed to collect saliva (Oragene®ADN Self-Collector kit-OG250).
Anthropometric data were collected from the baseline questionnaire. Self-reported
information on BMI had been previously validated in a subsample of the SUN Project
(10).
Voluntary completion of the first questionnaire was considered to imply informed
consent to participate in the SUN Project and written informed consent was requested to
collaborate in this study. The study protocol was performed in accordance with the
ethical standards of the Declaration of Helsinki (as revised in Hong Kong in 1989, in
Edinburgh in 2000 and in South Korea in 2008), and was approved by the Institutional
Ethical Review Board of the University of Navarra.
Genotyping
DNA was extracted from saliva samples according to the instructions of the kits
manufacture (Oragene®ADN Self-Collector kit-OG250). The genotyping for the
Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene (rs1801282) was performed using a
TaqMan assay with allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence
Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the
standardized laboratory protocols. Replicate quality control samples were included in
each genotyping plate with more than 99% of concordance.
74 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Statistical analysis
A Chi-square test was use to evaluate the Hardy-Weinberg equilibrium. The association
of Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene on BMI was analysed with Student’s t
test. The threshold for statistical significance was set a priori at p<0.05.
Logistic regression model was performed to calculate Odds Ratio for obesity risk in the
SUN cohort after adjustment for confounding factors such as sex, age (years), physical
activity practice (METs/h-week) and total energy intake (kcal/day).
Raw and adjusted geometric means for BMI have also been calculated to take into
account skewed data. Linear general model was used to estimate adjusted BMI
differences after controlling for the indicated confounding variables.
Meta-analysis
In our meta-analysis, the presence/absence of the Ala allele (dominant effect) was
considered as the exposure, whereas differences in BMI between carriers and noncarriers of the Ala allele were considered as the outcome (7). To systematically review
differences in BMI across the presence/absence of the Pro12Ala polymorphism of the
PPARG2 gene we used a formal meta-analysis and updated the existing literature
review (5). A Pubmed search was done to find articles concerning the influence of
Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene on BMI using different combinations of
the following search criteria: “BMI”, ”obesity”, “Pro12Ala” and “rs1801282”. A total of
75 studies comprising 109 samples and published before January 2011were identified.
Thirty of them were previously included in Masud’s meta-analysis, with a total sample
of 19,136 subjects. Tönjes’ meta-analysis provided 19,041 new subjects from 27 new
studies and finally our work contribute with 11,243 novel individuals from 19 studies
(Table 4). They are mainly Caucasian, but also some Asian, Mexican Hispanic and
African-American subjects. Studies conducted in children or adolescents were not
included as well as populations in which the allele prevalence of the Pro12Ala
polymorphism of PPARG2 was not similar to those described in the HapMap database
(11-14).
75 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Our meta-analysis was carried out using the STATA 10.0 software (Stata-Corp, College
Station TX). We estimated a standardized mean difference (SMD) as the weighted
effect size. This variable is the pooled estimate across studies for the BMI difference
(kg/m2) in homo-/heterozygous carriers vs. non-carriers of the Ala allele (dominant
effect). We also calculated a 95% confidence interval (CI) for the pooled difference in
BMI. A test of heterogeneity was also calculated, estimating the Cochran’s Q statistic
(Cochran 1954). A p value <0.05 for this parameter indicates the presence of
heterogeneity. A random-effect model was used when heterogeneity among studies was
observed and a fixed-effect model when studies were homogenous. The I2 test was also
used to evaluate heterogeneity among studies (15). I2 describes the percentage of total
variation across all the studies due to heterogeneity rather than chance and does not rely
on the number of studies. Thus, it can be used for comparisons across meta-analyses
with different number of studies. Percentages around 25% (I2=25), 50% (I2=50) and
75% (I2=75) would indicate low, medium, and high heterogeneity, respectively (15).
The meta-analysis was carried out firstly in the total sample, 9,286 carrier subjects of
the Ala allele compared with 39,806 non-carrier subjects (dominant model) and because
significant heterogeneity was evident the DerSimonian and Laird’s random effect model
was used. In order to evaluate potential sources of heterogeneity we separated samples
into sub-groups using the following criteria: sex, ethnic group (Asian or Caucasian) and
presence or absence of type 2 diabetes. Within the Caucasian samples, we studied
separately men and women, lean and obese and diabetic and non diabetic subjects.
When homogeneity between samples was observed the DerSimonian and Laird’s fixed
effect model was used. The false discovery rate method from Benjamini and Hochberg
was used to control for multiple testing in the sub-groups analyses (16-17).
The visual Funnel plots and the Egger’s test were used to detect evidence of possible
bias resulting from selective publication of positive studies (18).
76 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
RESULTS
Effect of the Pro12Ala polymorphism on body mass index in an elderly SUN
population
The frequency of the Ala allele of the PPARG2 gene was 0.19 in our elderly SUN
population. Specifically, 83% of the subjects carried the Pro12Pro genotype (wildtype),
16% of the subjects were heterozygous for the mutation (Pro12Ala) and only 1% was
homozygous (Table 1). The allele distribution fulfilled the Hardy-Weinberg
equilibrium. The presence of the Ala allele of PPARG2 gene significantly increased
obesity risk (OR=1.664, 95%CI=1.011-2.738, p=0.045). No BMI differences were
observed between carrier and non carrier subjects of the Ala allele of the PPARG2 gene
(Table 2).
Meta-analysis
We pooled 109 comparisons from 75 independent studies comprising 49,092 subjects,
39,806 subjects had the genotype Pro12Pro and 9,286 carrier subjects of the Ala allele
(Figure 1).
The meta-analysis revealed a higher BMI with an overall estimation of +0.065 kg/m2
(95% CI=0.026-0.103, p=0.001) for carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene in
comparison to non-carriers (dominant effect). The analysis also showed that there was
significant heterogeneity (p for heterogeneity < 0.001) among the different studies. The
Funnel plot for all samples and the Egger’s test (p=0.249) showed symmetrical
distribution indicating that there was no apparent publication bias (Figure 2).
We investigated possible sources of heterogeneity such as sex, ethnic group (Asian or
Caucasian population) and type 2 diabetes (presence or absence). Within the Caucasian
samples we studied separately men and women, lean and obese and also diabetic and
non diabetic subjects.
As it is reported that the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene is linked to lower
type 2 diabetes risk we performed a meta-analysis including 4,698 diabetic patients, but
no effect for the Ala allele on BMI was apparent.
77 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
A significant association between Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene and
increased BMI was detected in studies performed separately in Caucasian men,
Caucasian women and in obese Caucasian subjects. Following the hypothesis that the
Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene may have a stronger effect on BMI in
markedly obese individuals, we restricted the meta-analysis to Caucasian individuals
and conducted two separate assessments: in obese (6,602 subjects with BMI≥30 kg/m2)
and non-obese subjects (21,438 subjects with BMI<30 kg/m2). A significant association
between the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene and BMI in obese subjects was
observed (SMD=0.156, 95%CI=0.041-0.271, p=0.008, p for heterogeneity < 0.001).
Moreover, in a fixed model meta-analysis with 6,528 Caucasian men, carriers of the Ala
allele had significantly higher BMI than non carriers (SMD=0.090, 95%CI=0.0320.148, p=0.002, p for heterogeneity = 0.121). Similar results were observed in
Caucasian women (SMD=0.082, 95%CI=0.010-0.155, p=0.026, p for heterogeneity =
0.246) although after the Benjamini-Hochberg multiple comparison the results did not
remain the statistical significance.
DISCUSSION
PPARG2 is one of the most studied genes as potentially linked to obesity phenotypes.
Indeed, a large number of human studies have shown that the Ala12 allele was
associated with increased adiposity (4).
In our meta-analysis we compiled previously reported studies and have also included
novel data from a study in 972 older participants of the SUN Project. To reduce
heterogeneity different analyses were conducted for Caucasian or Asian population,
men and women, diabetic and non diabetic patients, and also obese and non-obese
subjects.
Our meta-analysis with a total of 49,092 subjects (39,806 Pro12Pro subjects and 9,286
subjects) revealed a significantly higher BMI with an overall estimation of +0.065
kg/m2 for homo-/heterozygous carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene when
compared to non-carriers (Pro12Pro subjects).
78 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
A similar effect of the Pro12Ala gene variant of PPARG2 gene on BMI changes
(+0.066 kg/m2) was reported in a former meta-analysis, Masud et al. (2003). They found
heterogeneity but no apparent publication bias.
The magnitude of BMI change observed in our study is more consistent in Caucasian
men. However, it is quite modest when compared with the average BMI increment per
risk allele (+0.170 kg/m2 for 32 genetic variants with P-values <5×10−8) in the largest
meta-analysis (249,796 individuals) of GWAS for BMI thus far published (19-20).
Moreover, the following information for the Pro12Ala SNP (rs1801282) was obtained
from the GIANT consortium data files: a minor allele frequency equal to 0.075 and a p
value equal to 0.0193 (after using regression coefficients and correction for inflation) in
123,856 subjects. Unfortunately, specific information for BMI according to the presence
of the Ala12 allele is not available in the GIANT study.
Sex-differences in studies on obesity and genetic variants are extensively described in
the literature. It is known that PPARG2 expression levels are higher in subcutaneous
than visceral adipose tissue (21). And also it is worthy to mention that PPARG2 inhibits
a key enzyme in oestrogen biosynthesis the aromatase gene suggesting that the action of
PPARG2 could be modulated by sex steroids (22). This fact may be a possible
explanation for the differences observed between men and women (23). Regardless of
the biological pathways, it is important to consider that sex-specific lifestyle
components (dietary intake, alcohol consumption, physical activity levels or smoking
habits) could act as modifiers for the effect of a given genetic variant on BMI.
Other studies have suggested that Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene may
exert its effect on BMI only in markedly obese individuals, for instance, those subjects
with a BMI higher than 27 kg/m2 of the Masud´s meta-analysis (5). Our study partially
confirmed this point since statistical differences were only found for obese Caucasian
(BMI≥30 kg/m2) subjects in a random model meta-analysis. Although the potential
effect of publication bias should also to be taken into consideration.
Our meta-analysis has strengths and limitations. The lack of information on
environmental factors and also gene-gene interactions is a limitation of our work. It has
79 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
been described that dietary modification may influence the association between genetic
variants and obesity and they should be accounted for (4).
One advantage is that information for more 49,000 subjects is pooled together. It
derives from 75 independent studies including 109 samples of different size from 30 to
3,080 participants, which may account as a source of heterogeneity. We included
populations with Ala12 frequency similar to those described in the HapMap database
(24). The frequency of the Ala12 allele of the PPARG2 gene varies from 2% to 33% in
our meta-analysis.
In some sub-groups analysis (i.e. after distributing subjects for ethnic group or obesity
status), heterogeneity remained which suggests that there may be more than one source
of heterogeneity at play. Heterogeneity usually accompanies genetic association studies.
The level of heterogeneity in our meta-analyses by using the I2 test ranges from 13% to
69%, which corresponds to medium heterogeneity (15).
Results from both random- and fixed-effects models have been provided throughout the
article and did not differ substantially. The drawback of combining studies in the
presence of heterogeneity is less related with the pooled estimate achieved and more
with the explicit demonstration of this heterogeneity and the need for caution in
interpretation.
Finally, to address the clinical relevance of the Ala allele of the PPARG2 gene
information from weight loss intervention studies is compiled here. Lindi et al. (25) and
Franks et al. (26) showed that subjects with the Ala12 allele lost more weight after 3
years and 1 year follow-up period, respectively. But, Adamo et al. (27) showed the
opposite result: the Ala12 allele was more frequent in diet-resistant individuals. No
effect was reported for Nicklas et al. (28) and Matsuo et al. (29). They attributed the
lack of effect to specific characteristic of the population: only women, and a low
prevalence of the Ala12 allele, respectively. Other relevant point refers to the effect of
genomic information as a behavioural health intervention. A recent review observed that
simple communication of genetic information and disease susceptibility, in some
motivated groups might be sufficient to trigger lifestyle changes, for others groups,
80 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
additional strategies may be required (30). Unfortunately, the effect of this genotype of
PPARG2 on body weight regulation remains unclear.
In conclusion, the current meta-analysis showed that the Pro12Ala polymorphism of
PPARG2 gene has a modest role in increasing BMI, which cannot be considered very
relevant from the clinical point of view; however, this positive association was
homogeneous, statistically significant, and stronger among Caucasian men.
COMPETING INTEREST
The authors declare no conflict of interest
ACKNOWLEDGMENTS
Research relating to this paper was funded by grant from Spanish Ministry of Health
and Consumption (Grants PI01/0619, PI030678, PI040233, PI042241, PI050976,
PI070240, PI070312, PI081943, PI080819, PI1002658, PI1002293, RD06/0045,
G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional Government (36/2001, 43/2002, 41/2005,
36/2008) and the University of Navarra, Línea Especial, Nutrición y Obesidad
(University of Navarra), Carlos III Health Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and
RETICS network. The scholarship to C. Galbete from the Asociación de Amigos de la
Universidad de Navarra is fully acknowledged.
81 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
TABLES
Table 1: Prevalence of the Pro12Ala polymorphism of the PPARG2 gene in elderly
participants of the SUN cohort according to obesity status
BMI ≥ 30
(kg/m2)
BMI < 30
(kg/m2)
Pro12Pro
75 (0.76)
739 (0.84) 1 (ref)
Pro12Ala
22 (0.22)
134 (0.15)
Ala12Ala
2 (0.02)
Ala carriers
24 (0.24)
OR*
CI 95%
p
1.60
0.955-2.671
0.074
7 (0.01)
3.01
0.602-15.053
0.179
141 (0.16)
1.66
1.011-2.738
0.045
* OR for obesity risk adjusted by sex, age (years), physical activity practice (METsh/week) and total energy intake (kcal/day)
82 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Table 2: Characteristics of elderly participants in the SUN cohort according to the
Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene
Pro12Pro
Ala carriers
(n=814)
(n=164)
70
73
0.329
Age (years)
68.8 (68.4-69.2)
70.0 (68.8-70.8)
0.071
BMI (kg/m2)
25.73 (25.51-25.95)
26.19 (25.69-26.69)
0.091
Adjusted BMI (kg/m2)*
25.74 (25.53-25.92)
26.13 (25.66-26.60)
0.139
BMI (kg/m2)†
25.54 (25.33-25.51)
25.99 (25.52-26.48)
0.089
Adjusted BMI (kg/m2)*†
25.56 (25.51-25.76)
25.93 (25.48-26.39)
0.141
Sex (% male)
p
Data are shown as mean (95%CI). Continuous variables were compared using a
Student-t test. Categorical variables were compared using Chi squared test.
* General Linear Model after adjustment for sex, age (years), physical activity practice
(METs-h/week) and total energy intake (kcal/day).
† Geometric means for BMI.
83 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Table 3: Meta-analyses of the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene on BMI
conducted in different population groups
ALL
STUDIES
Sex
- Women
- Men
Diabetes
- Diabetic
- Non diabetic
ASIAN
CAUCASIAN
Sex
- Women
- Men
Diabetes
- Diabetic
- Non diabetic
BMI
- Obese
- Non obese
n
cases
n
controls
SMD
95% CI
9286
39806
0.065
0.026-0.103
0.0010
54.1
< 0.001
1034
1544
4137
5302
0.073
0.098
0.003-0.142
0.041-0.155
0.0394
0.0008*
14.1
34.5
0.275
0.054
766
3822
308
7979
3932
15906
4167
27147
0.057
0.053
0.141
0.046
-0.023-0.136
-0.003-0.108
-0.036-0.317
0.008-0.084
0.1615
0.0629
0.1188
0.0168
12.8
44.3
47.8
45.4
0.310
0.001
0.024
< 0.001
939
1516
3497
5012
0.082
0.090
0.010-0.155
0.032-0.148
0.0264
0.0023*
18.2
27.4
0.246
0.121
646
3417
2559
11956
0.058
0.043
-0.029-0.145
-0.012-0.098
0.1936
0.1236
31.0
38.8
0.161
0.010
1444
5093
5158
16345
0.156
0.031
0.041-0.271
-0.016-0.077
0.0081
0.1971
68.8
43.3
< 0.001
0.002
p
I2 (%)
Pheterogeneity
SMD: Pooled Standardized Mean Differences for BMI (kg/m2) between 12Ala carriers
and Pro12Pro subjects (dominant model).
I2: percentage of the total variability in a set of effect sizes due to true heterogeneity
*: p value < 0.05 after correcting for Benjamini-Hochberg multiple comparisons
84 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Table 4: Brief description of each population included in the meta-analysis
Study
Beamer et al., 1998
Masud's meta- Tonjes' metaanalysis
analysis
•
•
Galbete's metaanalysis
•
N Controls
N Cases
141
28
% Ala12
16.57
Obese, non diabetic Caucasian men (n=57) and women (n=112) analyzed separately
Description
Beamer et al., 1998
•
•
•
408
109
21.08
Deeb et al., 1998
•
•
•
257
76
22.82
Non obese, non diabetic Caucasian men (n=316) and women (n=201) analyzed separately
Non diabetic Caucasian subjects
Deeb et al., 1998
•
•
•
695
278
28.57
Caucasian subjects
Mori et al., 1998
•
•
•
203
12
5.58
Ek et al., 1999
•
•
•
540
212
28.19
Ek et al., 1999
•
•
•
641
228
26.24
Non obese Caucasian subjects
•
75
33
30.56
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
•
114
17
12.98
Non obese, diabetic Caucasian men
Koch et al., 1999
Mancini et al., 1999
•
Mancini et al., 1999
•
Asian (Japanese) subjects
Obese Caucasian men
•
255
57
18.27
Non obese, non diabetic, Caucasian men
Ringel et al., 1999
•
•
388
134
25.67
Ringel et al., 1999
•
•
372
131
26.04
Non obese Caucasian subjects
Non obese, diabetic Caucasian Subjects
Valve et al., 1999
•
•
107
34
24.11
Obese, non diabetic, Caucasian women
Clement et al., 2000
•
•
246
49
16.61
Diabetic Caucasian subjects
Clement et al., 2000
•
•
294
78
20.97
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
Clement et al., 2000
•
•
339
63
15.67
Obese, non diabetic Caucasian subjects
Cole et al., 2000
•
•
711
210
22.80
Diabetic Caucasian subjects
Hara et al., 2000
•
•
496
45
8.32
Hara et al., 2000
•
•
400
15
3.61
•
90
29
24.37
Diabetic Oji-Cree (Canadian) women
•
23
43
13.45
Non diabetic Oji-Cree (Canadian) women
•
•
•
Hegele et al., 2000
•
Hegele et al., 2000
Asian (Japanese) subjects
Asian (Japanese) subjects
Lei et al., 2000
Meirhaeghe et al., 2000
•
•
148
553
•
•
661
177
21.12
Meirhaeghe et al., 2000
•
•
136
34
20.00
Oh et al., 2000
•
•
•
211
18
7.86
Poirier et al., 2000
•
•
•
507
168
24.89
Non obese, non diabetic Caucasian men
Ek et al., 2001
•
•
•
456
160
25.97
Non obese, non diabetic Caucasian men
Ek et al., 2001
•
•
•
270
94
25.82
Non obese, non diabetic Caucasian men
Hseuh et al., 2001
•
•
234
66
22.00
Mexican-American subjects
Lindi et al., 2001
•
•
93
26
21.85
Non obese Caucasian
Luan et al., 2001
•
•
•
203
56
21.62
Non obese, non diabetic Caucasian men
Luan et al., 2001
•
•
•
265
68
20.42
Non obese, non diabetic Caucasian women
•
•
56
14
20.00
Obese, non diabetic Caucasian women
Non obese Caucasian
Nicklas et al., 2001
7.21
Asian (Taiwanese) subjects
Non obese Caucasian subjects
Obese Caucasian subjects
Asian (Korean) subjects
Schaffler et al., 2001
•
•
276
83
23.12
Swarbrick et al., 2001
•
•
215
77
26.37
Swarbrick et al., 2001
•
•
277
94
25.34
Non obese Caucasian subjects
Ahluwalia et al., 2002
•
139
44
24.04
Non obese, diabetic Caucasian subjects
Doney et al., 2002
•
869
238
21.50
Obese, diabetic Caucasian subjects
Eriksson et al., 2002
•
Frederiksen et al., 2002
•
•
324
152
•
•
1671
574
25.57
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
Gonzalez-Sanchez et al., 2002
•
•
37
14
27.45
Caucasian men
Gonzalez-Sanchez et al., 2002
•
•
82
12
12.77
Caucasian woman
•
•
137
22
13.84
Non obese Caucasian men
•
•
•
127
337
31
153
19.62
•
Non obese Caucasian women
Obese Caucasian subjects
•
813
271
25.00
Non obese Caucasian subjects
•
156
38
19.59
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
•
87
13
13.00
No obese, diabetic Caucasian subjects
Gonzalez-Sanchez et al., 2002
Gonzalez-Sanchez et al., 2002
Lindi et al., 2002
•
Masud et al., 2002
•
•
Schneider et al., 2002
Schneider et al., 2002
•
Stumvoll et al., 2002
•
Stumvoll et al., 2002
•
Thamer et al., 2002
•
Yamamoto et al., 2002
•
31.93
Obese Caucasian subjects
31.22
Non obese Caucasian subjects
•
135
42
23.73
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
•
391
128
24.66
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
•
73
25
25.51
Non obese Caucasian men
•
•
454
24
5.02
Asian (Japanese) subjects
Yamamoto et al., 2002
•
•
109
8
6.84
Yamamoto et al., 2002
•
•
77
4
4.94
Baratta et al., 2003
•
•
296
42
12.43
Non diabetic Caucasian subjects
Eurlings et al., 2003
•
•
57
22
27.85
Familiar combined hyperlipidemia Caucasian subjects
Eurlings et al., 2003
•
•
93
31
25.00
Non diabetic Caucasian subjects
Kahara et al., 2003
•
•
117
6
4.88
Kolehmainen et al., 2003
•
•
22
8
26.67
Obese Caucasian subjects
Lindi et al., 2003
•
•
114
36
24.00
Caucasian subjects
Muller et al., 2003
•
•
678
117
14.72
Pima Indian subjects
•
Asian (Japanese) subjects
Asian (Japanese) subjects
Asian (Japanese) subjects
Poulsen et al., 2003
•
•
161
47
22.60
Caucasian subjects
Poulsen et al., 2003
•
•
268
77
22.32
Caucasian subjects
Robitaille et al., 2003
Rosmond et al., 2003
•
•
134
82
18.61
Caucasian subjects
•
586
186
Thamer et al., 2003
•
•
500
148
22.84
Caucasian subjects
Andrulionyte et al., 2004
Buzzetti et al., 2004
•
•
Obese Caucasian subjects
•
178
207
23.12
•
592
1008
Franks et al., 2004
•
•
86
27
23.89
Non diabetic Caucasian women
Franks et al., 2004
•
•
114
26
18.57
Non diabetic Caucasian women
Franks et al., 2004
•
Franks et al., 2004
Kim et al., 2004
•
•
17.04
•
91
22
19.47
•
108
977
32
74
22.86
208
•
Pihlajamaki et al., 2004
30.60
•
7.04
Non obese Caucasian men
Obese, non diabetic Caucasian subjects
No diabetic Caucasian men
No diabetic Caucasian men
Asian (Korean) subjects
103
33.12
Non obese Caucasian subjects
•
39
6
13.33
No diabetic Caucasian subjects
Tai et al., 2004
•
•
2796
284
9.22
Non diabetic Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjects
Tai et al., 2004
•
•
499
39
7.25
Impair glucose Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjects
Tai et al., 2004
•
•
374
46
10.95
Takata et al., 2004
•
•
139
7
Takata et al., 2004
•
90
11
10.89
Non diabetic Asian subjects
Barbieri et al., 2005
•
362
67
15.62
Non obese Caucasian subjects
Pisabarro et al., 2004
Danawati et al., 2005
•
Diabetic Asian (Chinese, Malaya, Indian) subjects
Non diabetic Asian men
7
3.45
Non diabetic Indian subjects
•
330
7
2.08
Diabetic Indian subjects
Fornage et al., 2005
•
•
1765
79
4.28
African-americans subjects
Fornage et al., 2005
•
•
1581
473
23.03
Ghoussaini et al., 2005
•
•
673
192
22.20
Ghoussaini et al., 2005
•
•
397
110
21.70
Obese Caucasian subjects
Meirhaeghe et al., 2005
•
•
893
240
21.18
Caucasian subjects
Mousavinasab et al., 2005
•
•
173
79
31.35
Non diabetic Caucasian subjects
Danawati et al., 2005
196
4.79
Non obese, non diabetic Caucasian subjects
Ostergard et al., 2005
•
18
22.78
Non diabetic, non obese Caucasian subjects
Rhee et al., 2005
•
226
27
10.67
Asian (Korea) subjects
Tanko et al., 2005
•
1088
386
26.19
Non obese, non diabetic Caucasian women
Weiss et al., 2005
•
Weiss et al., 2005
Stefanski et al., 2006
•
61
Non obese Caucasian subjects
•
24
8
25.00
•
•
37
154
4
60
28.04
Obese, diabetic Caucasian subjects
Canizales-Quinteros et al., 2007
•
105
26
19.85
Non diabetic Amerindian-Mexican subjects (IMC<25)
Canizales-Quinteros et al., 2007
•
76
32
29.63
Non diabetic Amerindian-Mexican subjects (IMC>25)
Helwig et al., 2007
•
515
193
27.26
Non obese, non diabetic Caucasian men
Kim et al., 2007
•
115
14
10.85
Asian( Korea) women
Mattevi et al., 2007
•
130
23
15.03
Non obese, non diabetic Caucasian men
Mattevi et al., 2007
•
153
29
15.93
Non obese, no diabetic Caucasian women
Vaccaro et al., 2007
•
301
42
12.24
Diabetic, obese Caucasian subjects
Morini et al., 2008
•
501
65
11.48
Non obese, non diabetic Caucasian men (n=211) and women (n=355) analyzed separately
Ben Ali et al., 2009
•
197
18
8.37
Ben Ali et al., 2009
•
151
21
12.21
Tunisian men
Ereqat et al., 2009
•
179
23
11.39
Palestinian subjects
Milewicz et al., 2009
•
222
96
30.19
Non obese, non diabetic Caucasian women
Razquin et al., 2009
•
837
138
14.15
Caucasian (high cardiovascular risk) subjects
Present Study
•
814
165
16.85
Caucasian subjects
9.76
Non diabetic Caucasian men
Non diabetic Caucasian women
Tunisian women
85 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
FIGURES
Figure 1
Study
Beamer et al., 1998 a, b
Beamer et al., 1998 a, b
Deeb et al., 1998 a, b
Deeb et al., 1998 a, b
Mori et al., 1998 a, b
Ek et al., 1999 a, b
Ek et al., 1999 a, b
Koch et al., 1999
Mancini et al., 1999 a
Mancini et al., 1999 b
Ringel et al., 1999 a
Ringel et al., 1999 a
Valve et al., 1999 a, b
Clement et al., 2000 a
Clement et al., 2000 a
Clement et al., 2000 a, b
Cole et al., 2000 a
Hara et al., 2000 a
Hara et al., 2000 a, b
n
141
408
257
695
203
540
641
75
114
255
388
372
107
294
339
246
711
400
496
Pro12Pro
mean (SD)
35.30 (8.31)
26.10 (4.04)
26.20 (3.20)
27.30 (5.30)
24.40 (3.30)
35.50 (5.50)
26.20 (3.70)
25.70 (2.22)
27.50 (3.60)
25.60 (3.30)
24.20 (3.60)
28.00 (5.00)
34.50 (3.80)
47.00 (7.50)
29.50 (5.40)
22.00 (1.90)
28.90 (4.40)
23.50 (4.00)
23.70 (3.18)
n
28
109
76
278
12
212
228
33
17
57
134
131
34
78
63
49
210
15
45
12Ala
mean (SD)
41.50 (8.46)
27.30 (4.18)
25.00 (3.50)
27.74 (4.79)
24.00 (3.00)
36.29 (5.9)
25.90 (3.19)
25.80 (2.44)
27.50 (2.90)
25.60 (3.10)
24.66 (3.49)
27.21 (4.71)
35.58 (3.70)
48.00 (7.50)
29.70 (5.37)
22.30 (1.90)
30.29 (4.22)
22.90 (3.56)
24.40 (3.29)
Hegele et al., 2000
Hegele et al., 2000 b
Lei et al., 2000 a
Meirhaeghe et al., 2000 a
Meirhaeghe et al., 2000 a
Oh et al., 2000 a, b
Poirier et al., 2000 a, b
Ek et al., 2001 a, b
Ek et al., 2001 a, b
Hseuh et al., 2001 a
Lindi et al., 2001 a
Luan et al., 2001 a, b
Luan et al., 2001 a, b
Nicklas et al., 2001 b
Schaffler et al., 2001 a
Swarbrick et al., 2001 a
Swarbrick et al., 2001 a
Ahluwalia et al., 2002
Doney et al., 2002
Eriksson et al., 2002 a, b
Frederiksen et al., 2002 a, b
Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b
Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b
Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b
Gonzalez-Sanchez et al., 2002 b
Lindi et al., 2002 a, b
Masud et al., 2002 a
Schneider et al., 2002
Schneider et al., 2002 a
Stumvoll et al., 2002 a
Stumvoll et al., 2002 a, b
Thamer et al., 2002 a
Yamamoto et al., 2002 a, b
Yamamoto et al., 2002 b
Yamamoto et al., 2002 b
Baratta et al., 2003 b
Eurlings et al., 2003 b
Eurlings et al., 2003 b
Kahara et al., 2003 b
Kolehmainen et al., 2003 b
Lindi et al., 2003 b
Muller et al., 2003 b
Poulsen et al., 2003 b
Poulsen et al., 2003 b
Robitaille et al., 2003 b
Rosmond et al., 2003 b
Thamer et al., 2003 b
Andrulionyte et al., 2004 b
Buzzetti et al., 2004 b
Franks et al., 2004 b
Franks et al., 2004 b
Franks et al., 2004 b
Franks et al., 2004 b
Kim et al., 2004
Pihlajamaki et al., 2004
Pisabarro et al., 2004 b
Tai et al., 2004 b
Tai et al., 2004 b
Tai et al., 2004 b
Takata et al., 2004 b
Takata et al., 2004 b
Barbieri et al., 2005
Danawati et al., 2005
Danawati et al., 2005
Fornage et al., 2005 b
Fornage et al., 2005 b
Ghoussaini et al., 2005 b
Ghoussaini et al., 2005 b
Meirhaeghe et al., 2005 b
Mousavinasab et al., 2005 b
Ostergard et al., 2005
Rhee et al., 2005
Tanko et al., 2005
Weiss et al., 2005 b
Weiss et al., 2005 b
Stefanski et al., 2006
90
148
553
661
136
211
507
456
270
234
93
203
265
56
276
215
277
139
869
324
1671
30.80 (4.60)
28.20 (5.60)
24.20 (2.35)
25.50 (4.40)
29.90 (3.6)
26.10 (4.90)
23.30 (2.25)
25.60 (3.00)
23.50 (3.60)
29.60 (4.4)
27.50 (4.90)
26.54 (2.47)
25.93 (3.32)
31.80 (4.49)
27.20 (6.40)
32.90 (2.60)
22.00(1.80)
29.60 (3.10)
30.70 (6.00)
27.50 (4.40)
25.80 (4.20)
29
23
43
177
34
18
168
160
94
66
26
56
68
14
83
77
94
44
238
152
574
30.90 (5.70)
27.30 (6.00)
25.90 (3.28)
26.20 (4.50)
30.70 (3.70)
25.10 (2.10)
23.45 (2.52)
25.66 (3.25)
23.10 (3.18)
30.50 (4.22)
28.53 (3.34)
26.77 (2.52)
25.72 (3.58)
33.30 (4.86)
27.47 (6.31)
32.90 (2.60)
22.10 (2.00)
29.50 (2.90)
31.28 (6.87)
28.00 (4.30)
25.65 (3.94)
37
82
137
127
337
813
87
156
135
391
73
77
454
109
32.80 (2.50)
33.50 (3.50)
25.90 (2.60)
25.50 (2.70)
31.10 (4.40)
27.50 (4.30)
28.70 (4.10)
27.50 (3.50)
24.70 (4.60)
25.80 (7.90)
23.40 (1.70)
24.70 (2.60)
23.20 (2.60)
20.80 (2.90)
14
12
22
31
153
271
13
38
42
128
25
4
24
8
31.80 (1.60)
33.60 (4.10)
25.70 (1.90)
25.80 (2.40)
31.54 (4.94)
27.56 (4.14)
27.60 (3.40)
27.70 (3.30)
24.40 (3.24)
24.40 (5.70)
23.05 (2.00)
24.80 (3.80)
23.70 (3.70)
19.80 (2.60)
296
57
93
117
22
114
678
161
268
586
186
500
27.00 (6.00)
27.20 (2.90)
25.30 (3.60)
23.40 (2.90)
49.30 (1.80)
26.40 (3.00)
36.80 (7.80)
25.90 (5.08)
25.70 (4.91)
26.90 (7.20)
25.90 (3.40)
26.70 (6.71)
42
22
31
6
8
36
117
47
77
134
82
148
27.00 (5.00)
27.20 (3.50)
25.70 (4.70)
22.70 (2.10)
54.40 (2.70)
26.90 (2.50)
34.20 (7.57)
25.00 (4.11)
25.51 (3.51)
28.20 (7.00)
26.84 (4.86)
26.50 (6.08)
592
1008
30.65 (4.00)
32.80 (9.00)
178
207
31.11 (4.45)
32.40 (10.00)
86
114
91
108
977
208
39
2796
499
374
139
90
362
196
330
1765
1581
673
397
893
27.00 (4.08)
26.90 (5.55)
26.90 (3.43)
25.60 (4.36)
25.46 (4.06)
25.70 (4.40)
32.60 (7.10)
23.50 (6.87)
25.66 (7.60)
26.99 (7.74)
22.90 (3.20)
19.80 (1.90)
25 .00(2.90)
22.60 (3.60)
23.70 (3.40)
25.30 (4.20)
23.50 (3.85)
23.61 (3.63)
40.82 (8.37)
26.50 (5.00)
27
26
22
32
74
103
6
284
39
46
7
11
67
7
7
79
473
192
110
240
27.80 (3.33)
25.50 (4.59)
26.50 (3.80)
25.90 (3.85)
26.64 (4.90)
26.03 (4.26)
25.80 (3.50)
24.12 (4.72)
25.78 (4.81)
27.48 (5.70)
22.70 (3.10)
19.10 (1.40)
23.50 (2.60)
26.70 (4.60)
25.90 (5.50)
24.30 (5.33)
24.20 (4.35)
24.02 (3.60)
40.08 (7.34)
27.00 (5.20)
173
61
226
1088
26.30 (3.80)
25.70 (2.70)
23.99 (2.39)
26.10 (2.80)
79
18
27
386
26.50 (5.00)
25.90 (2.20)
24.98 (2.86)
26.09 (3.90)
24
37
154
105
76
515
115
130
153
301
501
197
151
179
222
837
814
27.00 (4.09)
29.00 (6.08)
34.00 (3.70)
8
4
60
26
32
193
14
23
29
42
65
18
21
23
96
138
165
29.00 (2.83)
28.00 (4.00)
34.60 (3.80)
Canizales-Quinteros et al., 2007
Canizales-Quinteros et al., 2007
Helwig et al., 2007
Kim et al., 2007
Mattevi et al., 2007
Mattevi et al., 2007
Vaccaro et al., 2007
Morini et al., 2008
Ben Ali et al., 2009
Ben Ali et al., 2009
Ereqat et al., 2009
Milewicz et al., 2009
Razquin et al., 2009
Present Study
TOTAL
39806
25.40 (3.10)
27.00 (5.00)
27.36 (4.08)
24.44 (2.89)
26.20 (4.56)
25.70 (4.95)
31.30 (5.80)
25.30 (4.40)
43.24 (5.70)
34.55 (4.50)
31.50 (6.20)
27.20 (4.70)
29.30 (3.30)
25.70 (3.20)
Effect size meta-analysis plot
(random effect)
27.00 (5.00)
29.50 (5.50)
27.54 (4.33)
25.81 (4.66)
28.30 (5.28)
25.50 (4.31)
33.60 (7.1)
26.00 (5.20)
43.14 (7.40)
37.67 (5.90)
31.50 (6.70)
28.06 (4.90)
29.20 (3.20)
26.20 (3.30)
9286
Test for heterogenity Qh = 235.36, I2 = 54.1%, p < 0.001
3.51
DL pooled effect size, SMD = 0.065
p = 0.001 (95% CI = 0.026-0.103)
3.51
Figure 1: Meta-analysis of the Pro12Ala polymorphism of PPARG2 gene effect on
BMI comprising 49,092 subjects. aStudies included in Masud’s meta-analysis.
b
Studies included in Tonjes’ meta-analysis
86 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
Figure 2: Funnel plot of 109 samples included in the meta-analysis Egger’s test:
p=0.249. SMD: Standardized Mean Difference
87 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 1
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90 | P á g i n a
CAPÍTULO 2
Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2 and FTO
variants in an elderly population: a cross-sectional analysis in the
SUN Project
Resultados: Capítulo 2
Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2 and FTO
variants in an elderly population: a cross-sectional analysis in the
SUN Project
Cecilia Galbete, Jon Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez,
Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
Enviado a Genes & Nutrition 30-Nov.-2011,
Primera revisión 4-Ene.-2012,
Aceptado 4-Abr.-2012 (DOI 10.1007/s12263-012-0296-4)
Resumen
Los factores genéticos pueden interaccionar con los estilos de vida modificando el
riesgo de obesidad asociado a ellos. El objetivo de este estudio fue explorar el efecto de
los polimorfismos Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 y rs9939609 del gen FTO en
el riesgo de desarrollar obesidad y estudiar su interacción con diferentes estilos de vida
en una población adulta mayor.
Con este objetivo se reclutaron 978 sujetos (edad 69±6 años) de la cohorte SUN
(“Seguimiento Universidad de Navarra”) mayores de 55 años en el momento en el que
empezaron a formar parte de él. Se obtuvo su ADN a partir de muestras de saliva y los
datos de estilo de vida y dieta a partir de cuestionarios auto-referidos validados. Las
muestras se genotiparon mediante PCR a tiempo real seguida de discriminación alélica.
El estudio de nuestros datos demostró que aquellos sujetos que portaban el alelo de
riesgo Ala del gen PPARG2 mostraban un aumento significativamente mayor del riesgo
de sufrir obesidad que los sujetos Pro12Pro (OR=1,66, IC95%=1,01-2,74, p=0,045).
Además, se observó que este riesgo asociado al alelo de riesgo Ala se veía incrementado
en aquellos sujetos con un bajo nivel de actividad física así como en aquellos con un
alto consumo de carbohidratos. Asimismo, se advirtió que aquellos sujetos que
presentaban el alelo minoritario del gen PPARG2 y también el alelo de riesgo A del gen
FTO el elevado consumo de carbohidratos hacía que se incrementase en más de tres
veces su riesgo de sufrir obesidad (OR=3,26, IC95%=1,19-8,89, p=0.021)
comparándolos con los sujetos Pro12Pro/TT.
93 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
Lifestyle factors modify obesity risk linked to PPARG2 and FTO
variants in an elderly population: a cross-sectional analysis in the
SUN Project
Cecilia Galbete, Jon Toledo, Miguel Ángel Martínez-González, J. Alfredo Martínez,
Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
1
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology, University of
Navarra, Pamplona, Spain
2
Department of Pathology and Laboratory Medicine, Center for Neurodegenerative
Disease Research, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, PA,
USA
3
Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra,
Pamplona, Spain
4
Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain
CORRESPONDING AUTHOR
Dr. Amelia Marti.
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology
University of Navarra
C/Irunlarrea s/n
31008, Pamplona, Navarra, SPAIN
Phone: +34 948425600
Fax: +34 948425740
E-mail: amarti@unav.es
95 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
ABSTRACT
Genetic factors may interact with lifestyle factors to modify obesity risk. FTO and
PPARG2 are relevant obesogenes. Our aim was to explore the effect of Pro12Ala
(rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO, on obesity risk and to examine their
interaction with lifestyle factors in an elderly population.
Subjects (n=978, aged 69±6) were recruited from the SUN (“Seguimiento Universidad
de Navarra”) Project. DNA was obtained from saliva and lifestyle and dietary data were
collected by validated self-reported questionnaires. Genotyping was assessed by RTPCR plus allele discrimination.
Subjects carrying the Ala allele of PPARG2 gene had a significantly increased obesity
risk compared to non carrier -Pro12Pro- subjects (OR 1.66, 95% CI: 1.01-2.74,
p=0.045). Greater obesity risk was also found in inactive or high carbohydrate intake
subjects with the Ala12 allele of PPARG2 gene. Interestingly, subjects carrying the Ala
allele of the PPARG2 gene and with a high CHO (>246 g/d) intake had an increased
obesity risk compared to Pro12Pro subjects (OR 2.67, 95%CI: 1.3-5.46, p=0.007, p for
[CHO xPPARG2] interaction=0.046). Moreover, in subjects with a high CHO intake the
co-presence of the Ala allele of PPARG2 gene and one A minor allele (rs9939609) of
FTO gene did increase obesity risk (OR 3.26, 95%CI: 1.19-8.89, p=0.021) when
compared to non carrier (Pro12Pro/TT) subjects.
In conclusion, it appears that lifestyle factors may act as effect modifiers for obesity risk
linked to Ala12 allele of the PPARG2 gene and the A minor allele of FTO gene in an
elderly population.
96 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
BACKGROUND
Obesity is a complex disease with genetic and environmental basis (Marti 2008). FTO
and PPARG2 gene variants for obesity risk have been widely studied (Razquin 2011).
Several meta-analyses showed an increased BMI in subjects with the Ala allele of the
PPARG2 gene (Masud 2003; Tonjes 2006). This observation was recently confirmed,
carriers of the Ala allele of the PPARG2 gene had a significant higher BMI (+0.060
kg/m2) compared to non-carriers (Galbete et al, in press), with a total of 49,337 subjects.
As it is known the FTO gene harbours the stronger association with adiposity in GWAS
studies. Although the physiological function of FTO remains unclear (Tung 2011). In
the large meta-analysis of GWAS thus far performed with 123,865 individuals of
European ancestry the FTO locus was confirmed as one of the 32 variants associated
with BMI with P-values <5×10−8 (Speliotes 2010; Speakman 2011). A significant
association between rs9939609 SNP of FTO gene and obesity, with an overall odds
ratio (OR) for obesity of 1.31 under per-allele comparison was reported in another
meta-analysis including 111,571 subjects (Peng 2011).
Epidemiological studies have suggested that in addition to genetic factors, a variety of
lifestyle factors (e.g., dietary composition, low level of physical activity (PA)) may
contribute to the epidemic of obesity and interact with genetic factors to modify obesity
risk (Chung 2008; Walley 2009).
The interaction between lifestyle factors and these gene variants (Pro12Ala of PPARG2
(rs1801282) and rs9939609 of FTO) have been explored in different populations and
cohorts. On one hand, some studies have reported an interaction between Ala allele of
PPARG2 gene variant and carbohydrate (CHO) or fat intake, (Marti 2002; Lamri 2011)
on obesity risk whereas in others no association was found (Memisoglu 2003; Nelson
2007). A significant interaction between food intake and rs9939609 SNP of FTO gene
on BMI was detected in some populations (Corella 2011; Lappalainen 2012; Moleres
2012).
With regard to PA, recently, Kilpelainen (2011) meta-analyzed data from 45 studies
with a total of 218,166 adults. They reported a significant interaction between the minor
97 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
A allele of rs9939609 and PA, being the odds for obesity risk 27% smaller in active vs.
inactive subjects.
A cohort study is the best way to identify incidence and natural history of a disease, and
can be used to examine multiple outcomes after a single exposure (Grimes 2002). The
SUN Project (Seguimiento Universidad de Navarra–University of Navarra Follow-up-)
is a multi-purpose prospective Mediterranean dynamic cohort designed to study the
prospective association of diet and other lifestyle factors with various health outcomes
including cardiovascular disease, hypertension, diabetes or obesity (Martinez-Gonzalez
2002; Segui-Gomez 2006).
The aim of this study was to explore the effect of two gene variants, Pro12Ala of
PPARG2 and rs9939609 of FTO, on obesity risk and to examine their interaction with
lifestyle factors in an elderly population of the SUN study
SUBJECTS AND METHODS
Sample population
This work has been conducted within the framework of the SUN Project (MartinezGonzalez 2002). The SUN Project was initiated in December 1999 in Spain and
recruitment is permanently open. All participants are university graduates and about
50% of them are health professionals themselves.
Lifestyle and dietary data is collected by self-reported biennially mailed questionnaires
(Alonso 2005; Bes-Rastrollo 2005; Martinez-Gonzalez 2005). Dietary intake was
assessed using a semi-quantitative food frequency questionnaire (136 food items)
included at baseline. Validity and reproducibility of this questionnaire has recently been
re-evaluated (de la Fuente-Arrillaga 2010). Nutrient intakes of 136 food items were
calculated as frequency multiplied by nutrient composition of specified portion size for
each food item, using an ad hoc computer program developed for this purpose. A
trained dietician updated the nutrient data bank using the latest available information
from the food composition table for Spain. Baseline intake of macronutrients was
analyzed as quantitative variables (grams per day) (de la Fuente-Arrillaga 2010;
Fernandez-Ballart 2010).
98 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
PA was ascertained through a baseline 17-item questionnaire. The index of metabolic
equivalent task hours per week (METs-h/week) was computed by using the time spent
engaging in 17 activities and multiplying the time spent by the resting metabolic rate
(MET-score) specific for each activity. The METs-h/week for all activities were
combined to obtain a value of total METs-h/week, which adequately correlated with the
objectively measured energy expenditure in a validation study in a subsample of the
cohort (Martinez-Gonzalez 2005).
For this research, elderly participants of the SUN project (more than 55 years old when
the baseline questionnaire was completed) were invited to participate in a genetic study
in May 2008. Each participant received a kit designed to collect saliva and 1085
participants agreed to participate but 986 kits were received back. Finally, 978
volunteers were correctly genotyped for the rs1801282 SNP (PPARG2) and 967 for the
rs9939609 SNP (FTO). The mean age was 69 years (70% male). Anthropometric data
was collected from the baseline questionnaire. Self-reported information on BMI had
been previously validated in a subsample of the SUN Project (Bes-Rastrollo 2005).
Specific written informed consent was requested to participate in this study. The study
protocol was performed in accordance with the ethical standards of the Declaration of
Helsinki (as revised in Hong Kong in 1989, in Edinburgh in 2000 and in South Korea in
2008), and was approved by the Institutional Ethical Review Board of the University of
Navarra.
Genotyping
Saliva samples were collected with specially designed kits (Oragene®ADN SelfCollector kit-OG250) and DNA was extracted according to the manufacturer’s
instructions. The genotyping for the Pro12Ala SNP of PPARG2 gene (rs1801282) and
for the rs9939609 SNP of the FTO gene were performed using Taqman assays with
allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA) according to standardized laboratory protocols.
99 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
Statistical analysis
Hardy-Weinberg equilibrium was tested using a chi-square test. This test was also used
to analyze if there were differences on the genotype distribution according to obesity
status.
The Odds Ratio (OR) for obesity associated with genotypes (dominant models) were
fitted with an unconditional logistic regression model after adjustment for sex, age, PA
and total energy intake as covariables. To address the combined effect of these two
polymorphisms, Pro12Ala (rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO gene
(dominant model) a dummy variable was created. Non carrier subjects (Pro12Pro and
TT) were considered as the reference category. Three different categories according to
the genotypes were considered: having the Ala allele (rs1801282) of PPARG2 gene, the
A allele (rs9939609) of FTO gene, and the third, for the co-presence of the two risk
alleles (Ala and A allele). The association between the different possible genotypes and
BMI was analyzed using linear regression models and analysis of covariance
(ANCOVA), after adjusting for potential confounders (sex, age, PA and total energy
intake). We also evaluated the relationship between the genetic variants Pro12Ala
(rs1801282) of PPARG2 and rs9939609 of FTO and a high CHO intake or low PA
practice (dichotomized at the median) on obesity risk. Indicated interactions were
estimated for obesity risk with the likelihood ratio test. Product terms between the SNPs
and lifestyle factors were calculated firstly, with the corresponding variables
dichotomized at the median (model 1 and 3), and secondly, as continuous variables
(model 2 and 4). Interactions between the SNPs and lifestyle factors on BMI (as a
continuous variable) were also tested.
RESULTS
Anthropometrical and lifestyle characteristics of elderly subjects of the SUN cohort
according to the two genotypes (Pro12Ala SNP (rs1801282) of PPARG2 and the
rs9939609 SNP of FTO gene, dominant model) are shown in Table 1. The frequencies
of these two SNPs did fulfil the Hardy-Weinberg equilibrium.
The ORs for obesity risk were calculated for each gene variant after adjustment for sex,
age, PA and total energy intake. The presence of the Ala allele of PPARG2 gene
100 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
significantly increased obesity risk in the adjusted models (including total population,
subjects with high CHO intake, and those with low PA practice). The obesity risk linked
to the Ala12 allele of PPARG2 was 1.66 (95%CI: 1.01-2.74, p=0.045) in the total
population (Table 2).
Interestingly, as shown in Table 2, obesity risk was higher in subjects with a high CHO
consumption (>246 g/day) carrying the Ala allele of the PPARG2 gene (OR 2.67,
95%CI: 1.30-5.46, p=0.007). This p-value did remain statistically significant after
applying the Benjamini-Hochberg multiple comparison correction. The interaction for
obesity risk between CHO intake and PPARG2 gene was also statistically significant (p
for [CHOxPPARG2] interaction =0.046). Similar results for this interaction were also
obtained when considering CHO as a continuous trait (p for [CHOxPPARG2]
interaction =0.030).
Furthermore, subjects with a high CHO intake and carriers of the Ala allele, had an
increased obesity risk, by the co-presence of one A minor allele (rs9939609) of FTO
gene (OR 3.26, 95%CI: 1.19-8.89, p=0.021) compared to non carriers of the two alleles
(Pro12Pro and TT) subjects with a high CHO intake.
The presence of the Ala12 allele (rs1801282) of PPARG2 gene increased obesity risk to
2.14 (95%CI: 1.13-4.05, p=0.020) in subjects with a sedentary lifestyle (<18.6 METsh/week) compared to Pro12Pro subjects. However, there was no evidence of statistical
interaction (p for interaction = 0.243). Furthermore, in inactive carrier subjects of the
Ala12 allele of PPARG2, the co-presence of the A minor allele (rs9939609) of FTO
gene had a further rise in obesity risk to 2.51 (95%CI: 1.01-6.23, p=0.047) compared to
inactive non carrier (Pro12Pro and TT) subjects. The interactions between the genetic
variants and low PA practice for obesity risk were not statistically significant (Table 2).
Linear regression models were also fitted to confirm the association between the copresence of the two risk alleles (Ala of the PPARG2 and A allele of FTO gene) and
BMI (as a continuous variable) in the three models undertaken: total population, high
CHO intake and low PA practice (Table 2). Moreover, the same tendency was observed
in the ANCOVA analysis (Figure 1).
101 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
DISCUSSION
The main finding of this work is that a high CHO consumption seems to modify the
obesity risk linked to the Pro12Ala SNPs of the PPARG2 gene in an elderly population.
Some strengths of the SUN cohort deserve to be mentioned. The homogeneity of
participants with regard to socioeconomic status which helps to better control
confounding and the higher educational level of participants in the cohort that ensures a
higher validity in self-reported information (Beunza 2010; Sayon-Orea 2011). A
potential limitation in our study is the self-reported outcome, nevertheless, self-reported
weight and BMI had been previously validated (Bes-Rastrollo 2005). Another limitation
is that identifying interactions between genetic variants and lifestyle factors may need
much larger sample size (Smith 1984).
The present work shows that the co-presence of these two risk alleles in PPARG2 and
FTO gene increases obesity predisposition, but, novel studies are needed to elucidate the
potential mechanisms. Pro12Ala variant of PPARG2 gene is one of the most studied
genes as potentially linked to obesity phenotypes (Razquin 2011). Previous metaanalysis had associated the Ala12 minor allele with a higher BMI (Masud 2003; Tonjes
2006; Galbete et al. in press) and this study confirmed in a larger sample of aged subject
the association of the Ala12 allele with obesity risk.
Depending on the genotype the response of individuals to a dietary component or
components could be different. The Pro12Ala genetic variant is probably the most
studied mutation in relation to the interaction with dietary components on adiposity
features. Fatty acids are natural agonist of PPARG transcription factor; consequently
most of the studies have been directed to analyze the interaction between Pro12Ala and
fat intake. However, this study replicated an earlier association of this PPARG2 genetic
variant with obesity risk linked to a high CHO intake (Marti 2002). Notably, in our
study the interaction between CHO consumption and this Ala12 allele of PPARG2 for
obesity risk was statistically significant although confirmation if needed in larger
sample studies.
The PPARG Pro12Ala genotype seems to be associated with obesity, type 2 diabetes
and CHD risk (Dallongeville 2009). This variant is a diet-dependent sensor, and in the
102 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
presence of a positive energy balance, the adipogenic capacity of the Ala allele exceeds
that of the Pro12 genotype, being partially attributed to diet-dependent effects of the
PPARG2 Pro12Ala genotype on adiponectin signaling and on the interaction of
PPARG2 with several transcriptional coregulators (Anderson 2010). From a
mechanistic point of view it is shown that the Ala12 allele alters ligand interaction
between PPARG2 and its cofactors (Pgc1alfa, SRC1, Ncor) leading to an effect beyond
decreased DNA binding efficiency (Heikkinen 2009) .The enhancement in obesity risk
linked to a high CHO intake may be partly explained by the fact that CHO are not able
to activate the PPARG protein and could worsen the action of the Ala12 substitution on
the receptor activity.
The impact of this rs9939609 SNP of FTO gene on human body weight is mainly
through energy intake, however some results are contradictory (Berentzen 2008; Do
2008; Speakman 2008, Goossens 2009; Haupt 2009). In our elderly population no effect
of FTO on obesity was found. This observation agrees with former findings in mature
subjects. Hardy (2010) described a weak association between FTO and BMI at age of
50 years. Jacobsson (2011) suggested that the effect of FTO on corporal adiposity may
decrease by age. Our limited sample size could also impair our ability to find significant
results.
In regard to PA it is well known that there is an inverse relationship with obesity
(Levine 1999; Levine 2005; Kuliczkowska 2008). Previous studies had reported that a
high PA practice was linked to a lower fasting insulin level in Pro12 homozygous
subjects of PPARG2 gene (Franks 2004) but no studies were found on association
between Pro12Ala polymorphism and inactivity on obesity risk. Nevertheless, our
results suggested an association of this genetic variant with obesity risk linked a low PA
practice.
To our knowledge we assessed for the first time the joint association of PPARG2 and
FTO gene variants on obesity risk when modulated by lifestyle factors. Previous studies
have found a higher obesity risk associated with the combined effect of several
polymorphisms. Some research work reported the combined effect of PPARG and
ADRB3 or ACE I/D gene variants for increasing BMI (Huang 2011; Passaro 2011)
stated that the combined effect of FTO and MC4R genetic variants was strongly
associated with obesity risk and BMI. Similarly, Cauchi (2009) observed that these two
103 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
genetic variants increased obesity risk by 24% and low PA levels did accentuate this
effect. Our study showed that the effect of PPARG2 (Ala12 allele) and FTO
(rs9939609) gene variants on obesity effect might depend on high CHO intake.
In summary, it seems that lifestyle factors may act as effect modifiers for obesity risk
linked to Ala12 allele of the PPARG2 gene and the A minor allele of FTO gene in an
elderly population.
ACKNOWLEGMENTS
The SUN Study has received funding from the Spanish Government (Grants PI01/0619,
PI030678, PI040233, PI042241, PI050976, PI070240, PI070312, PI081943, PI080819,
PI1002658, PI1002293, RD06/0045, G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional
Government (36/2001, 43/2002, 41/2005, 36/2008) and the University of Navarra,
Línea Especial, Nutrición y Obesidad (University of Navarra), Carlos III Health
Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and RETICS network. The scholarship to C.
Galbete from the Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra is fully
acknowledged. The authors have no competing interests.
104 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
TABLES
Table 1: Baseline characteristics according to genotype for elderly subjects from the
SUN project
PPRG2 rs1801282
Pro12Pro
Ala12
(n=814)
(n=164)
% Male
Age (years)
BMI (kg/m2)
Total Energy Intake (kcal/day)
CHO intake (g/day)
Protein intake (g/day)
Fat intake (g/day)
Physical activity (METs-h/week)
pvaluea
FTO rs9939609
TT
TA/AA
(n=336)
(n=631)
pvaluea
70%
74%
0.275
72%
70%
0.657
69 (6)
70 (7)
0.071
69 (6)
69 (6)
0.484
25.7 (3.2)
26.2 (3.2)
0.091
25.6 (3.1)
25.9 (3.2)
0.173
2378 (903)
2484 (1021)
0.182
2412 (1038) 2384 (862)
0.654
267 (129)
281 (147)
0.200
272 (147)
267 (123)
0.647
107 (40)
109 (37)
0.686
109 (46)
107 (36)
0.449
91 (39)
93 (42)
0.392
91 (41)
91 (39)
0.883
23.9 (20.7)
24.3 (21.5)
0.828
23.3 (20.1)
24.5 (21.3)
0.387
Values are expressed as mean (SD), unless otherwise state
a
Continuous variables were compared using a Student-t test. Categorical variables were
compared using chi squared test.
105 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
Table 2: Odds Ratios (OR) for obesity risk and linear regression coefficients for the
association between the rs9939609 of FTO gene and Pro12Ala SNPs of the PPARG2
gene and BMI in elderly participants of the SUN project
OR (95% CI)
for obesity
PPARG2 (rs1801282)
Pro12Pro
Ala12
FTO (rs9939609)
TT
TA/AA
Genotype
FTO e
PPARG2 e
+
+
+
+
p value
FTO (rs9939609)
TT
TA/AA
Genotype
FTO e
PPARG2 e
+
+
+
+
FTO (rs9939609)
TT
TA/AA
Genotype
FTO e
PPARG2 e
+
+
+
+
p value
0.045
0 (ref)
0.40 (-0.13-0.90)
0.139
1 (ref)
1.03 (0.66-1.60)
0.892
0 (ref)
0.33 (-0.08-0.74)
0.112
1 (ref)
1.92 (0.86-4.27)
1.10 (0.66-1.84)
1.71 (0.84-3.48)
0.111
0.704
0.138
0 (ref)
0.46 (-0.36-1.30)
0.34 (-0.11-0.79)
0.79 (0.08-1.50)
0.287
0.135
0.030
0.046/0.030
1 (ref)
2.67 (1.30-5.46)
0.260
0 (ref)
0.49 (-0.21-1.20)
0.007d
0.169
0.609/0.449
1 (ref)
1.15 (0.57-2.31)
0.739
0 (ref)
0.46 (-0.11-1.03)
0.697
0.111
0.814/0.844
1 (ref)
1.92 (0.79-6.76)
1.04 (0.60-2.41)
3.26 (1.19-8.89)
0.973
0 (ref)
0.28 (-0.03-1.43)
0.41 (-0.22-1.03)
1.07 (0.10-2-03)
0.312
0.924
0.021
0.639
0.204
0.031
model 3/model 4
0.266/0.243
1 (ref)
2.14 (1.13-4.05)
0.741
0 (ref)
0.93 (0.16-1.69)
0.020
0.017d
0.366/0.152
1 (ref)
1.14 (0.64-2.06)
0.417
0 (ref)
0.56 (-0.05-1.16)
0.652
0.070
0.346/0.230
1 (ref)
2.31 (0.79-6.76)
1.21 (0.60-2.41)
2.51 (1.01-6.23)
p for
interactionc
model 1/model 2
Low physical activity practice (< 18.6 METs-h/week)
PPARG2 (rs1801282)
Pro12Pro
Ala12
B (95% CI)b
1 (ref)
1.66 (1.01-2.74)
High CHO intake (> 246 g/day)
PPARG2 (rs1801282)
Pro12Pro
Ala12
p for
interactiona
0.125
0.594
0.047
0.360
0 (ref)
0.63 (-0.65-1.90)
0.48 (-0.18-1.14)
1.67 (0.63-2.71)
0.334
0.156
0.002d
Adjusted for gender, age, physical activity and total energy intake
(a) p value for Likelihood Ratio Test for obesity risk. (b) Adjusted differences in
average BMI (kg/m2) between genotypes. (c) p value for interaction for BMI (as
continuous variable). (d) p value < 0.05 after correcting for Benjamini-Hochberg
multiple comparisons. (e) (-) Non carriers of the minor risk alleles (+) Subjects carrying
the minor risk alleles, either Pro12Ala of PPARG2 gene or rs9939609 of FTO gene.
Model 1: interaction term = genotype*CHO (dichotomized at the median); model 2:
interaction term = genotype*CHO (continuous); model 3: interaction term =
genotype*PA (dichotomized at the median); model 4: interaction term = genotype*PA
(continuous)
106 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
FIGURE
Figure 1: BMI differences according to genotype (dominant models for Pro12Ala
and rs9939609 SNPs) for the three population groups (total population, only
subjects with a high CHO intake or a low physical activity practice)
Adjusted for sex, age, physical activity and total energy intake
*
p<0.05 between Ala12+TA/AA and Pro12Pro+TT genotypes
107 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 2
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Resultados: Capítulo 2
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112 | P á g i n a
CAPÍTULO 3
Physical activity and gender modulate obesity risk linked to 3111T/C
gene variant of the CLOCK gene in an elderly population:
The SUN Project
Resultados: Capítulo 3
Physical activity and gender modulate obesity risk linked to 3111T/C
gene variant of the CLOCK gene in an elderly population:
The SUN Project
Cecilia Galbete, Rafael Contreras, J. Alfredo Martínez, Miguel Ángel MartínezGonzález, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
Enviado a Chronobiology International 7-May.-2012
Primera revision 4-Jun.-2012
Resumen
El efecto de los factores genéticos implicados en el desarrollo de la obesidad puede
interaccionar con la actividad física modificando su repercusión. El objetivo de este
estudio fue explorar el efecto del polimorfismo 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK
en el desarrollo de la obesidad así como examinar su posible interacción con los estilos
de vida, en este caso la actividad física, en una población adulta mayor del Proyecto
SUN.
Con este objetivo se reclutaron aquellos sujetos de la cohorte SUN (“Seguimiento
Universidad de Navarra”) mayores de 55 años en el momento en el que empezaron a
formar parte de ésta (n=903, edad=69±6 años). Su ADN se obtuvo a partir de muestras
de saliva y los datos sobre el estilo de vida se recogieron mediante cuestionarios autoreferidos. Las muestras se genotiparon mediante PCR a tiempo real seguida de
discriminación alélica.
El análisis de los datos mostró interacción entre el polimorfismo 3111T/C del gen
CLOCK y el sexo para el riesgo de desarrollar sobrepeso/obesidad. (p de interacción
CLOCK*sexo <0,001). Se observó también que las mujeres portadoras del alelo C
presentaban un menor riesgo de padecer sobrepeso/obesidad comparándolas con las
mujeres con el genotipo TT (OR=0,61, IC95%=0,36-1.04, p=0.069). Este efecto se vió
acentuado si las mujeres portadoras del alelo de riesgo C tenían altos niveles de
actividad física (OR=0,36, IC95%=0,17-0.79, p=0.011). En este sentido también se
observó interacción entre el polimorfismo rs1801260 del gen CLOCK y la actividad
física en las mujeres (p de interacción CLOCK*actividad física = 0,015) para el riesgo
de sobrepeso/obesidad.
115 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
Physical activity and gender modulate obesity risk linked to 3111T/C
gene variant of the CLOCK gene in an elderly population:
The SUN Project
Cecilia Galbete, Rafael Contreras, J. Alfredo Martínez, Miguel Ángel MartínezGonzález, Francisco Guillén-Grima y Amelia Marti
1
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology, University of
Navarra, Pamplona, Spain
2
Department of Preventive Medicine and Public Health, University of Navarra,
Pamplona, Spain
3
Division of Preventive Medicine, University of Navarra Clinic, Pamplona, Spain
CORRESPONDING AUTHOR
Dr. Amelia Marti.
Department of Nutrition, Food Science, Physiology and Toxicology
University of Navarra
C/Irunlarrea s/n
31008, Pamplona, Navarra, SPAIN
Phone: +34 948425600
Fax: +34 948425740
E-mail: amarti@unav.es
117 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
ABSTRACT
Genetic factors may interact with physical activity levels to modify obesity risk. Our
aim was to explore the influence of rs1801260 SNP (3111T/C) of CLOCK gene on
obesity risk, and to examine their potential interaction with lifestyle factors in an elderly
population within the SUN Project. Subjects (n=903, aged 69±6 years old) were
recruited from the SUN (“Seguimiento Universidad de Navarra”) Project. DNA was
obtained from saliva while lifestyle and dietary data were collected by validated selfreport questionnaires. Genotype was assessed by RT-PCR plus allele discrimination. A
significant interaction between the 3111T/C SNP of CLOCK gene and sex for
overweight/obesity risk was observed (p for [Sex*CLOCK] interaction <0.001). Our
results showed that women carrying the C allele of CLOCK gene had a marginally
significant lower risk of overweight/obesity compared to non carrier -TT- subjects (OR:
0.61, 95% CI: 0.36-1.04, p=0.069). Moreover, this association of the C allele with a
decreased overweight/obesity risk might be enhanced in those women with a high
physical activity level. Women practicing more than 16.8 METs-h/week had a
significantly lower overweight/obesity risk (OR 0.36, 95%CI: 0.17-0.79, p=0.011).
Furthermore, a significant interaction between the 3111T/C gene variant and physical
activity for overweight/obesity risk was observed but only in women (p for
[PA*CLOCK] interaction <0.050). In conclusion, it appears that physical activity levels
may act by modifying the association of the 3111T/C SNP (rs1801260) of the CLOCK
gene with overweight/obesity risk in elderly women in the SUN Project.
Keywords: CLOCK, rs1801260, cross-sectional study, obesity risk, body mass index
118 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
BACKGROUND
Circadian rhythms are biological events generated by endogenous mechanisms
composed of circadian clocks. The clocks are synchronized or adjusted to coincide with
periodical environmental events such as the day/night cycle. If clocks are not wellsynchronized the coordination between physiological and behavioural rhythms over the
24-h period is not guaranteed (Reppert & Weaver 2001). Clock genes are expressed in
all tissues and circadian clocks participate in the daily regulation of metabolic functions
such as glucose and lipid metabolism (Yamamoto et al., 1987; Rudic et al., 2004). One
of the first clock genes studied was CLOCK (circadian locomotor output cycles kaput
gene). Mutant mice for this gene display severe metabolic alterations, including
hypercholesteronemia, hypertriglyceridemia, hepatic steatosis, and hyperglycemia
(Turek et al., 2005). The Clock protein is part of the positive regulatory arm of the
circadian system. It belongs to a family of proteins that generates auto-regulatory
mechanisms of positive and negative transcriptional feedback loops (Albrecht & Eichele
2003).
Several studies have examined the association between CLOCK gene variants and
obesity or other related diseases (Sookoian et al., 2008; Garaulet et al., 2009, 2010a).
Specifically, the 3111T/C locus (rs1801260) has been studied concerning mood, eating
disorders and obesity (Benedetti et al., 2003; Mishima et al., 2005; Benedetti et al.,
2007; Tortorella et al., 2007). Some intervention studies with obese subjects have
reported that this polymorphism might influence the weight loss response. It appears
that obese carriers of the C allele are more resistant to weight loss than TT subjects.
Also they showed shorter sleep duration, delayed breakfast time, evening preference
and less compliance with a Mediterranean dietary pattern (Garaulet et al., 2010b;
Garaulet et al., 2011; Garaulet et al., 2012).
The association of the 3111T/C SNP of CLOCK gene with BMI or obesity has been
examined in cross-sectional studies. (Scott et al., 2008) stated that in Caucasian men, a
haplotype including the C allele of this gene variant could protect against obesity. These
authors also noted that this haplotype including the C allele of the 3111T/C genetic
variant was less prevalent in subjects with the metabolic syndrome and in those with
119 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
increased waist circumference, and was related to lower BMI (Scott et al., 2008).
Moreover, in Caucasian women with eating disorders, (Tortorella et al., 2007) showed
an association of the C allele of this SNP with lifetime lower body weight. Negative
results for this association are also described in the literature (Monteleone et al., 2008).
Epidemiological studies have suggested that in addition to genetic factors, a variety of
lifestyle factors such as dietary composition and physical activity (PA) levels may
modify the obesity risk linked to genetics. Some papers document the association
between 3111T/C SNP of CLOCK gene and fatty acid intake or energy intake (Garaulet
et al., 2009, 2010a).
The inverse association between PA and obesity is well documented. In fact, PA is the
most common environmental factor assessed in gene x environmental studies
concerning obesity phenotypes (Lee et al., 2011). Previous genotype-PA interactions on
BMI have been reported for several polymorphisms of genes including ADRB2
(Corbalan et al., 2002; Macho-Azcarate et al., 2002), ADRB3 (Marti et al., 2002), MC4R
(Jozkow et al., 2011), INSIG2 (Andreasen et al., 2008b), LIPE (Garenc et al., 2009) ,
PPARGC1A (Ridderstrale et al., 2006), UCP2 (Berentzen et al., 2005), UCP3 (Otabe et
al., 2000; Berentzen et al., 2005), FTO (Andreasen et al., 2008a; Rampersaud et al.,
2008; Hakanen et al., 2009; Jonsson et al., 2009; Vimaleswaran et al., 2009; Lee et al.,
2010; Liu et al., 2010; Ruiz et al., 2010; Scott et al., 2010; Demerath et al., 2011). In
recent years, the role of physical activity in modulating an increased BMI associated
with the strongest obesity-related gene variant, FTO: rs9939609, has been characterized
(Razquin et al., 2011). Specifically, after conducting a meta-analysis including data
from 218,166 subjects Kilpelainen et al. (2011) showed a significant FTO-PA
interaction, meaning that the minor FTO allele increased the odds ratio for obesity less
in the physically active group (odds ratio = 1.22/allele) than in the inactive group (odds
ratio = 1.30/allele). They concluded that the odds of obesity linked to this rs9939609
FTO gene variant were attenuated by 27% in physically active adults.
Clock gene variants appear to be associated with other environmental factors such as
energy intake, fatty acid consumption, sleep duration, or evening preference. On the
other hand, it has been shown in animals that PA contributes to important timing
120 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
information for synchronization of circadian clocks throughout the body (Wolff & Esser
2012). Thus, our aim was to evaluate the association of the 3111T/C SNPs of CLOCK
gene with obesity risk and examine its interaction with physical activity levels in an
elderly population within the SUN Project.
Cohort studies have proved to be a very useful tool for identifying the incidence and
natural history of diseases. These can be used to examine multiple outcomes after a
single exposure (Grimes & Schulz 2002). The SUN Project (Seguimiento Universidad
de Navarra-University of Navarra Follow-up) is a prospective multi-purpose
Mediterranean cohort designed to study the association of lifestyle factors with various
health outcomes including cardiovascular disease, diabetes or obesity (MartinezGonzalez et al., 2002; Segui-Gomez et al., 2006).
SUBJECTS AND METHODS
Sample population
This work has been conducted within the framework of the SUN Project (MartinezGonzalez et al., 2002). The SUN Project was initiated in December 1999 in Spain and
recruitment is permanently open. All participants are university graduates and about
50% of them are health professionals. MDs, pharmacists, nutritionists, dentists,
odontologists, psychologists, nurses, and ophthalmologists are included as “health
professional” in the SUN cohort. Specifically, 6.4% of participants (mean age 67) had a
Nursing Degree and they may have been exposed to shift work until the age of 55.
Lifestyle and dietary data were collected by biennially mailed self-report questionnaires
(Alonso et al., 2005; Bes-Rastrollo et al., 2005; Martinez-Gonzalez et al., 2005). Dietary
intake was assessed using a semi-quantitative food frequency questionnaire (136 food
items) included at baseline. The validity and reproducibility of this questionnaire has
recently been re-evaluated (de la Fuente-Arrillaga et al., 2010).
Physical activity (PA) was ascertained through a baseline 17-item questionnaire. The
index of metabolic equivalent task hours per week (METs-h/week) was computed by
using the time spent engaging in 17 activities and multiplying the time spent by the
121 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
resting metabolic rate (MET-score) specific for each activity. The METs-h/week for all
activities were combined to obtain a value of total METs-h/week, which adequately
correlated with the objectively measured energy expenditure in a validation study in a
subsample of the cohort (Martinez-Gonzalez et al., 2005).
Elderly participants in the SUN Project (more than 55 years old when the baseline
questionnaire was completed) were invited to participate in a genetic study. In May
2008, 1085 participants agreed to participate. Each of them received a kit designed to
collect saliva and 986 kits were received back. Finally, 972 volunteers were correctly
genotyped for the rs1801260 SNP (CLOCK). Among them, 69 subjects who reported
their total energy intake outside of predefined values (<800 kcal/d for men, <500 kcal/d
for women or >4000 kcal/d for men, >3500 kcal/d for women) were excluded, leaving a
total of 903 participants available for the analysis (Figure 1).The mean age was 69 years
(70% male). Anthropometric data was collected from the baseline questionnaire. Selfreported information on BMI (body mass index, kg/m2) had been previously validated
in a subsample of the SUN Project (Bes-Rastrollo et al., 2005). Specific written
informed consent was requested to participate in this study. The study protocol was
performed in accordance with the ethical standards of the Declaration of Helsinki (as
revised in Hong Kong in 1989, in Edinburgh in 2000 and in South Korea in 2008), and
was approved by the IRB (Institutional Review Board) of the University of Navarra
Moreover, the experimental protocol is in conformity with international ethical
standards (Portaluppi et al., 2010) and the Spanish legislation (LEY 14/2007 de
Investigación biomédica, BOE-A-2007-12945).
Genotyping
Saliva samples were collected with specially designed kits (Oragene®ADN SelfCollector kit-OG250) and DNA was extracted according to the manufacturer’s
instructions. A total of 106 SNPs including 6 tag SNPs are described in the CLOCK
gene in Caucasian populations based on the information obtained from HapMap release
24/phase II, on NCBI B36 assembly, dbSNP b126. Moreover, the 3111C/T SNP of
CLOCK gene (rs1801260) is the only tag-SNP in which several potential microRNA
target
sites
122 | P á g i n a
are
annotated
by
RANDA
and
Sanger
(FuncPred,
Resultados: Capítulo 3
http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm). The genotyping for this SNP was performed
using Taqman assays with allele-specific probes on the ABI Prism 7900HT Sequence
Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to
standardized laboratory protocols. We obtained an average genotyping success rate of
more than 95% and an average genotyping accuracy of more than 98% by regenotyping
25% of the samples.
Statistical analysis
Hardy-Weinberg equilibrium was tested using a Chi-square test. This test was also used
to analyze if there were differences in the genotype distribution according to obesity
status. The threshold for statistical significance was p < 0.05.
The Odds Ratios (OR) for obesity associated with genotype (dominant model) were
fitted with an unconditional logistic regression model after adjustment for sex, age
(years, continuous), PA (METs-h/week, continuous) and total energy intake (kcal/day,
continuous) as covariates. The associations between the genotypes and BMI were
analyzed using linear regression models after adjusting for the same potential
confounders. We also evaluated the relationship between the variant 3111C/T
(rs1801260) of CLOCK gene and PA practice (sex-specific dichotomized at the median)
with regard to obesity risk. Interactions for obesity risk were estimated with the
likelihood ratio test. Product terms between the CLOCK gene variant and lifestyle
factors were calculated with the corresponding variables as continuous trait. Interactions
between the CLOCK gene variant and lifestyle factors on BMI were also analyzed.
RESULTS
The frequency of the C allele of the 3111T/C gene variant of the CLOCK gene was 29%
in our elderly population. Specifically, 51% of the subjects had the TT genotype, 41%
were heterozygous for the mutation (TC) and 8% were homozygous (CC genotype).
The allele distribution fulfilled the Hardy-Weinberg equilibrium (Table 1). In
overweight/obese women the TC/CC genotype (43%) was slightly less frequent than in
normal weight subjects (55%, p=0.075).
123 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
The characteristics of elderly participants in the SUN Project (n=903) according to the
3111T/C genotype (dominant model) are shown in Table 2. Interestingly, subjects
carrying the C allele had lower BMI than TT subjects, but this difference was only
marginally significant (p=0.062). As shown in Table 3, after stratifying by sex, BMI
differences were marginally significant in women (p=0.059) but not in men (p=0.444).
Moreover, the linear regression analysis showed an association of the C minor allele
with lower BMI levels (Table 4). There is also a significant interaction between the
3111T/C SNP and sex (p<0.001) for obesity risk assessed by the likelihood ratio test.
When men and women were analyzed separately, the logistic regression analyses
showed that women with at least one C allele of the gene variant showed a trend to
lower overweight/obesity risk than TT genotype women (OR=0.61, 95%CI=0.36-1.04,
p=0.069) (Table 4). In this context, the linear regression coefficients (Table 4) showed a
lower BMI, -0.89 kg/m2 (95%CI= -1.80-0.02, p=0.056) for women with the C allele
compared to women with the TT genotype which is equivalent to -2.43 kg for a woman
1.65 m tall.
It was also observed that among physically active women (higher than the median, more
than 16.8 METs-h/week) those who were carriers of the C allele had a significantly
lower BMI (-1.36 kg/m2 95%CI= -2.57-(-0.15), p=0.028) than TT (active) women.
However, no significant interaction was observed for BMI between the 3111T/C gene
variant of the CLOCK gene and PA practice (p=0.137) in women after the analysis of
covariance. On the other hand, there was a significant interaction for overweight/obesity
risk (likelihood ratio test) between the 3111T/C SNP and PA (p for interaction CLOCK
*PA=0.015) in women. In this context, we observed that in high PA levels women
(>16.8 METs-h/week) carriers of the C allele had a significantly lower
overweight/obesity risk (OR=0.36, 95%CI=0.17-0.79, p=0.011) than non carriers (TT
genotype).
DISCUSSION
This study found that the C allele of the 3111T/C SNP of CLOCK gene could be
associated with a decreased overweight/obesity risk in women from an elderly
124 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
population of the SUN Project. Moreover, this association seemed to be reinforced by
high physical activity levels.
Our study has strengths and limitations. A potential limitation in our study is the selfreported outcome, although self-reported weight and BMI had been previously validated
(Bes-Rastrollo et al., 2005). Another limitation is that there is no population group for
replication of findings and that identifying interactions between genetic variants and
lifestyle factors may require a larger sample size (Smith & Day 1984). Moreover, it
could be more informative to examine a number of SNPs in clock related pathway genes
and not just one. On the other hand, some strengths of our study deserve to be
mentioned. The 3111T/C SNP is one out of six tag SNPs that are described in the
CLOCK gene, with potential functional relevance. Other strengths are the homogeneity
of the SUN participants with regard to socioeconomic status, which helps to better
control for confounding factors, and the higher educational level of the participants in
the cohort, which ensures a higher validity in self-reported information (Willett &
Colditz 1998; Beunza et al., 2010; Sayon-Orea et al., 2011).
Sex could be considered as an “environmental” risk factor, which incorporates
established anatomical, physiological, and behavioral differences between males and
females (Ober et al., 2008). It is plausible that sex may interact with common genetic
variants resulting in allelic associations that differ between males and females (Magi et
al., 2010). Our study found an interaction between sex and the 3111T/C gene variant for
overweight/obesity risk, and sex-specific associations of the C allele were observed.
Women presented a lower overweight/obesity risk associated with the C allele, while no
association was observed in men. Interestingly, a sexual dimorphism has also been
reported for clock genes expression levels in human adipose tissue (Gomez-Abellan et
al., 2012)
The effect of some genetic variants on obesity phenotypes has been reported to be
modulated by gender. For instance, several studies with the Pro12Ala SNP of the
PPARG gene or rs4712652 adjacent to the prolactin gene found associations with
obesity risk or BMI, but only in men (Ben Ali et al., 2009; Nilsson et al., 2011). Some
authors have reported different associations in women (Tortorella et al., 2007) and in
125 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
men (Scott et al., 2008) between the 3111T/C CLOCK gene variant and obesity. It has
been suggested that sex-specific lifestyle components such as diet, alcohol consumption,
physical activity practice or smoking habits could act as modifiers of the association of
gene variants with obesity.
Our results confirmed an association between the 3111T/C CLOCK gene variant and
obesity risk in line with the literature. The C allele of CLOCK gene was associated with
lower overweight/obesity risk in women was observed. This finding agrees with those
of Tortorella et al. (2007), who described an association of the C allele of this SNP with
lifetime lower body weight in a group of Caucasian women with eating disorders.
Interestingly, our work identifies an interaction between PA levels and the 3111T/C
variant of CLOCK gene, which is important because it states that genetic susceptibility
to obesity is modifiable by lifestyle factors. In the literature there are few studies
concerning this CLOCK gene variant and PA. Recently, Tsuzaki et al. (2010) reported
an association between the 3111T/C gene variant and small dense low-density
lipoprotein that was independent of several factors, including physical activity.
On the other hand, concerning obesity, one of the most studied SNPs is the rs9939609
of the FTO gene. In a large meta-analysis Kilpelainen et al. (2011) found that obesity
risk linked to the FTO risk allele was reduced by 27% in physically active compared
with non active subjects. Our study suggested a similar decreased obesity risk in women
with high PA levels who were carriers of the C risk allele of CLOCK gene.
One potential explanation of the biological meaning of the interaction between PA and
CLOCK gene variant could derive from the observation that scheduled PA seems to
modulate circadian rhythms and clock gene expression (Wolff & Esser 2012). It appears
that this gene variant could potentially work to synchronize rhythms in humans, thus
lowering obesity risk, since there is an increasing association between clock disruption
and metabolic diseases. However, more studies need to be performed to elucidate this
important question.
In summary, our study suggests that the C allele of the 3111T/C gene variant of CLOCK
gene might be associated with a decreased overweight/obesity risk, and that physical
activity may strengthen this association, but only in women.
126 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
ACKNOWLEGMENTS
The SUN Study has received funding from the Spanish Government (Grants PI01/0619,
PI030678, PI040233, PI042241, PI050976, PI070240, PI070312, PI081943, PI080819,
PI1002658, PI1002293, RD06/0045, G03/140 and 87/2010), the Navarra Regional
Government (36/2001, 43/2002, 41/2005, 36/2008) and the University of Navarra,
Línea Especial, Nutrición y Obesidad (University of Navarra), Carlos III Health
Institute (CIBER project, CB06/03/1017) and RETICS network. The scholarship to C.
Galbete from the Asociación de Amigos de la Universidad de Navarra is fully
acknowledged. The authors have no competing interests.
DECLARATION OF INTEREST
The authors declare no conflict of interest.
127 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
TABLES
Table 1: Prevalence (%) of the 3111T/C polymorphism of the CLOCK gene in an elderly SUN
population according to BMI
WHOLE POPULATION (n=903)
Allele T
Normal
weight
516 (69.5%)
Overweight/
Obesity
789 (72.7%)
Allele C
226 (30.5%)
TT
CT
CC
TT
TC/CC
181 (48.8%)
154 (41.5%)
36 (9.7%)
181 (48.8%)
190 (51.2%)
*Chi-square test
128 | P á g i n a
WOMEN (n=246)
MEN (n=657)
Normal
weight
209 (67.0%)
Overweight/
Obesity
133 (73.9%)
297 (27.3%)
103 (33.0%)
47 (26.1%)
278 (52.2%)
217 (40.8%)
37 (7.0%) 0.274
278 (52.3%)
254 (47.7%) 0.305
70 (44.9%)
69 (44.2%)
17 (10.9%)
70 (44.9%)
86 (55.1%)
51 (56.7%)
111 (51.6%)
31 (34.4%)
85 (39.5%)
8 (8.9%) 0.203 19 (8.9%)
51 (56.7%)
111 (51.6%)
39 (43.3%) 0.075 104 (48.4%)
p*
p*
Normal Overweight/
weight
Obesity
307 (71.4%) 640 (72.4%)
p*
123 (28.6%) 255 (27.6%)
227 (51.4%)
186 (42.1%)
29 (6.5%) 0.534
227 (51.4%)
215 (48.6%) 0.948
Resultados: Capítulo 3
Table 2: Characteristics of an elderly SUN Population according to the
3111T/C polymorphism of CLOCK gene
TT
(n = 459)
74
69 ± 6
74.2 ± 12.0
26.1 ± 3.3
2256 ± 660
1014 ± 398
410 ± 114
762 ± 264
24.1 ± 21.3
7.7 ± 1.0
7.2 ± 1.0
0.4 ± 0.8
TC + CC
(n = 444)
72
69± 6
73.1± 11.6
25.7± 3.0
2232 ± 637
981 ± 357
408 ± 113
777 ± 275
23.7 ± 20.4
7.5 ± 0.8
7.2 ± 0.9
0.4 ± 0.7
p
0.546
0.916
0.153
0.062
0.581
0.180
0.811
0.414
0.770
0.115
0.277
0.346
Male (%)*
Age (years)
Weight (kg)
BMI (kg/m2)
Total energy intake (kcal/day)
Carbohydrates (kcal/day)
Proteins (kcal/day)
Fat (kcal/day)
Physical activity (METs h/week)
Sleep time (hours/day)
Night (hours/day)
Nap (hours/day)
Smoking (%)*
Current smokers
13
15
Former smokers
54
49
0.203
Data are shown as mean±SD. n for sleep time is 402 for TT genotype and 394
for TC+CC genotype.
*Chi-square test
129 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
Table 3: Characteristics of an elderly SUN population according to sex and the rs1801260
polymorphism of the CLOCK gene
Age (years)
Weight (kg)
BMI (kg/m2)
Total energy intake (kcal/day)
Carbohydrates (kcal/day)
Proteins (kcal/day)
Fat (kcal/day)
Physical activity (METs h/week)
Sleep time (h/day)
Night (hours/day)
Nap (hours/day)
Smoking (%)*
Current smokers
Former smokers
Data are shown as mean±SD.
*Chi-square test
130 | P á g i n a
WOMEN
TT
TC + CC
(n = 121)
(n = 125)
67 ± 5
67 ± 5
63.5 ± 9.9
61.6 ± 8.8
24.97 ± 3.75
24.10 ± 3.45
2194 ± 625
2276 ± 644
986 ± 370
1023 ±348
415 ± 118
417 ± 116
763 ± 276
810 ± 315
19.7 ± 14.1
20.3 ± 17.8
7.7 ± 1.1
7.5 ± 1.1
7.4 ± 0.8
7.1 ± 0.9
0.4 ± 1.0
0.4 ± 0.8
7
37
13
32
p
0.908
0.112
0.059
0.313
0.411
0.868
0.211
0.743
0.114
0.035
0.961
0.090
MEN
TT
TC + CC
(n =338)
(n =319)
70 ± 6
70 ± 6
78.1 ± 10.3
77.6 ± 9.1
26.5 ± 3.0
26.3 ± 2.6
2279 ± 671.7
2216 ± 634
1024 ± 408
963 ± 359
408 ± 113
405 ± 112
762 ± 259
764 ± 258
25.7 ± 23.1
25.1 ± 21.2
7.6 ± 1.0
7.5 ± 1.0
7.2 ± 0.8
7.2 ± 0.9
0.4 ± 0.8
0.4 ± 0.6
15
60
16
56
p
0.950
0.552
0.444
0.216
0.042
0.678
0.928
0.696
0.388
0.990
0.251
0.561
Resultados: Capítulo 3
Table 4: Odds Ratios (OR) for overweight/obesity risk and linear regression coefficients (B) for the
association between the rs1801260 of CLOCK and BMI gene in elderly participants in the SUN
project
OR (95% CI)
p value
p for
interaction*
B (95% CI)†
p value
p for
interaction ‡
WHOLE POPULATION
WOMEN
TT
TC/CC
MEN
TT
TC/CC
< 0.001
1 (ref.)
0.61 (0.36-1.04)
1 (ref.)
1.00 (0.72-1.39)
0.139
0.069
0 (ref.)
-0.89 (-1.80-0.02)
0.056
0.996
0 (ref.)
-0.19 (-0.62-0.24)
0.387
0 (ref.)
-0.43 (-1.80-0.95)
0.542
0 (ref.)
-1.36 (-2.57-(-0.15))
0.028
0 (ref.)
-0.33 (-0.95-0.30)
0.303
0 (ref.)
0.063 (-0.66-0.53)
0.834
PHYSICAL ACTIVITY PRACTICE (METs-h/week)
WOMEN
Low (< 16.8 METs-h/week)
TT
1 (ref.)
TC/CC
0.97 (0.47-2.06)
0.970
High (>16.8 METs-h/week)
TT
1 (ref.)
TC/CC
0.36 (0.17-0.79)
0.011
MEN
Low (< 20.6METs-h/week)
TT
1 (ref.)
TC/CC
0.77 (0.48-1.25)
0.291
High (> 20.6METs-h/week)
TT
1 (ref.)
TC/CC
1.26 (0.80-1.99)
0.312
0.015
0.957
0.137
0.887
Adjusted for gender, age, physical activity and total energy intake
* p value for Likelihood Ratio Test for obesity risk. † Adjusted differences in average BMI (kg/m2)
between genotypes. ‡ p value for interaction for BMI (as continuous variable)
131 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
FIGURE
19,919 SUN Participants
1919 proposed to participate
(age more than 55)
1247 answered
108 decide not
to participate
1085 decide to participate
987 saliva-kits received
972 correctly genotyped
69 out of predefined values for
total energy intake
903 participants fully
available
Figure 1: Flow chart of participants included in the analysis
132 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
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He M, Kutalik Z, Kumari M, Stancakova A, Meidtner K, Balkau B, Tan JT,
Mangino M, Timpson NJ, Song Y, Zillikens MC, Jablonski KA, Garcia ME,
Johansson S, Bragg-Gresham JL, Wu Y, van Vliet-Ostaptchouk JV, OnlandMoret NC, Zimmermann E, Rivera NV, Tanaka T, Stringham HM, Silbernagel
G, Kanoni S, Feitosa MF, Snitker S, Ruiz JR, Metter J, Larrad MT, Atalay M,
Hakanen M, Amin N, Cavalcanti-Proenca C, Grontved A, Hallmans G, Jansson
JO, Kuusisto J, Kahonen M, Lutsey PL, Nolan JJ, Palla L, Pedersen O, Perusse
L, Renstrom F, Scott RA, Shungin D, Sovio U, Tammelin TH, Ronnemaa T,
Lakka TA, Uusitupa M, Rios MS, Ferrucci L, Bouchard C, Meirhaeghe A, Fu
135 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
M, Walker M, Borecki IB, Dedoussis GV, Fritsche A, Ohlsson C, Boehnke M,
Bandinelli S, van Duijn CM, Ebrahim S, Lawlor DA, Gudnason V, Harris TB,
Sorensen TI, Mohlke KL, Hofman A, Uitterlinden AG, Tuomilehto J, Lehtimaki
T, Raitakari O, Isomaa B, Njolstad PR, Florez JC, Liu S, Ness A, Spector TD,
Tai ES, Froguel P, Boeing H, Laakso M, Marmot M, Bergmann S, Power C,
Khaw KT, Chasman D, Ridker P, Hansen T, Monda KL, Illig T, Jarvelin MR,
Wareham NJ, Hu FB, Groop LC, Orho-Melander M, Ekelund U, Franks PW,
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136 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
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Resultados: Capítulo 3
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138 | P á g i n a
Resultados: Capítulo 3
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139 | P á g i n a
DISCUSIÓN GENERAL
Discusión general
1. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO
En los últimos años la prevalencia del sobrepeso y la obesidad ha alcanzado
proporciones epidémicas en todo el mundo lo que conlleva problemas de salud de
diferente índole (Finucane et al., 2011). Por un lado aparecen complicaciones desde el
punto de psicológico y estético pero más importantes son las complicaciones
metabólicas a las que este trastorno puede acompañar. Entre éstas se encuentran la
diabetes, la hipertensión, alteraciones inflamatorias, aumento de riesgo de padecer
cáncer, insuficiencia respiratoria u osteoartritis, entre otras. Además, en la personas de
mayor edad aunque el riesgo de mortalidad asociado a la obesidad es menor que en el
rango de población de adultos de mediana edad, los gastos en sanidad debidos a esta
patología son muy elevados en este rango de población (Wee et al., 2005; Salas-Salvado
et al., 2007)
Según el estudio ENRICA España es uno de los países europeos con las tasas más
elevadas de sobrepeso y obesidad, casi el 40% de la población adulta padece sobrepeso
y más del 20% obesidad (Gutierrez-Fisac et al., 2012). En este sentido se cuenta
también con los datos de Basterra-Gortari et al. (2011) que demuestran que la
prevalencia autodeclarada de obesidad mórbida en España aumentó de un 1,8% en 1993
a un 6,1% en 2006 según los datos de la Encuesta Nacional de Salud (2006).
Como ya se ha comentado en la introducción el desarrollo de la obesidad se debe a
un desequilibrio en el balance energético que conlleva una acumulación anormal o
excesiva de grasa (Martinez, 2000; OMS, 2011). Sin embargo, es evidente que no todos
los sujetos responden de la misma manera a los estímulos externos, es decir, nuestro
perfil genético nos puede hacer más o menos susceptibles a desarrollar una determinada
patología. Así, estudios en familias de adopción demostraron que el peso de los hijos
adoptados se correlacionaba con el del los padres biológicos pero no con el de los
padres adoptivos (Stunkard et al., 1986). Esto hizo pensar que la genética tenía un
importante papel sobre la adiposidad corporal. Sin embargo, un estudio desarrollado en
34 gemelos monocigóticos separados al nacer concluyó que eran los factores
ambientales durante el crecimiento y no la predisposición genética lo que determinaba
el grado de adiposidad en la madurez (Price & Gottesman, 1991).
143 | P á g i n a
Discusión general
Todos estos datos sugieren que el peso corporal viene determinado por una
combinación de factores genéticos y ambientales relacionados con el estilo de vida, así
como por las interacciones entre ellos (Marti et al., 2008; Hetherington & Cecil, 2010).
En este trabajo hemos estudiado la relación entre diversas variantes genéticas y
diferentes factores ambientales con el riesgo de desarrollar sobrepeso y obesidad en un
estudio observacional transversal englobado dentro de la cohorte SUN.
2. LA COHORTE SUN: FORTALEZAS Y DEBILIDADES
El presente trabajo forma parte del Proyecto SUN, una cohorte dinámica iniciada en
el año 1999 y diseñada con el propósito de estudiar mediante la evidencia científica los
beneficios de la Dieta Mediterránea en relación con la aparición de enfermedades. Al
inicio se enfocó hacia el estudio de la dieta sobre la prevención de ciertas enfermedades
pero finalmente se amplió para abarcar algunas cuestiones sobre el estilo de vida. Se
trata de una cohorte multi-propósito que permite la evaluación de condiciones tales
como la obesidad, la hipertensión, la diabetes, enfermedad cardiovascular y cáncer. En
la actualidad cuenta con más de 20.000 participantes, todos graduados universitarios,
hecho que aporta una mayor fiabilidad y validez, junto con mayores tasas de retención
(Willett & Colditz, 1998; Martinez-Gonzalez et al., 2002; Segui-Gomez et al., 2006).
Para este subestudio se contó con la participación voluntaria de 986 sujetos de la
cohorte SUN con una edad media de 69 años. Este tipo de estudios transversales resulta
muy adecuado cuando se examinan factores de riesgo que no se alteran en el tiempo, en
este caso las variantes genéticas, anteriores al desenlace, la obesidad.
Además, el alto nivel educativo de nuestros participantes, todos ellos graduados
universitarios, aumenta su validez interna y hace que disminuya la confusión asociada al
estatus socioeconómico. Este factor se asocia con una mayor calidad en la exposición
principal así como en las covariables y en el desenlace.
Otro punto fuerte del estudio es la validación previa de nuestras variables
principales como son el peso y el IMC (Bes-Rastrollo et al., 2005), la actividad física
(Martinez-Gonzalez et al., 2005) y el cuestionario semi-cuantitativo de frecuencia de
144 | P á g i n a
Discusión general
consumo de alimentos (CSFC) varias veces validado en España (Martin-Moreno et al.,
1993; de la Fuente et al., 2010; Fernandez-Ballart et al., 2010).
El hecho de que los datos sean auto-referidos, lo que facilita mucho el trabajo
realizado, es cierto que puede ser considerado como una cierta limitación. En el caso del
IMC se sabe que existe una tendencia de los participantes a infraestimar su peso y
sobreestimar su estatura, y una tendencia a la preferencia de cifra (Mikolajczyk et al.,
2010). Sin embargo, los estudios previos de validación (Bes-Rastrollo et al., 2005)
constatan la validez de los datos, no afectando a la infraestimación de nuestras medidas
de asociación.
Otra de las limitaciones de este estudio la encontramos en los cuestionarios de
actividad física y en el CSFC. Aunque han sido previamente validados este problema es
inherente a la evaluación del ejercicio físico y de la ingesta dietética, ya que son
variables difíciles de medir en epidemiología debido a que los individuos pueden
cambiar su actividad física o su dieta de un día para otro.
Los datos obtenidos provienen de una población muy concreta y podría pensarse
que los resultados observados no son aplicables o generalizables a toda la población.
Sin embargo, el objetivo de este trabajo fue estudiar los posibles efectos causales de una
exposición (variantes genéticas y estilos de vida) sobre un desenlace (niveles de IMC y
riesgo de sobrepeso/obesidad) por lo que los resultados podrían ser aplicados a otros
colectivos, pues no hay datos que nos hagan pensar que los mecanismos implicados
serán diferentes en otras poblaciones (Rothman, 2008).
En este sentido, un problema del estudio SUN sería la validez externa, es decir, si
se puede extrapolar los datos de una cohorte basada en universitarios a la población
general (Rothman & Greenland, 1998). Lo ideal serían estudios de cohorte de base
poblacional tales como los de Noruega (Lund et al., 2003), la cohorte multiétnica de
Hawái y Los Ángeles (Kolonel et al., 2000), el estudio del millón de mujeres en el
Reino Unido (The Million Women Study, 1999), la cohorte de mujeres holandesas (van
den Brandt et al., 1990), la Malmö en Suecia (Manjer et al., 2001) etc. Pero también
hay muchas cohortes, entre las que se encuentra el Proyecto SUN, que se han realizado
145 | P á g i n a
Discusión general
con poblaciones concretas como enfermeras (Belanger et al., 1980; Willett et al., 1981;
Myers et al., 1987) profesoras francesas (Clavel-Chapelon et al., 1997) , adventistas del
séptimo día (Phillips et al., 1980) y profesores de California (Bernstein et al., 2002).
El problema de la validez externa ocurre no sólo en las cohortes basadas en grupos
especiales (médicos, enfermeras, universitarios) sino también en aquellas de base
poblacional. Así, por ejemplo, una cohorte de base poblacional como el EPIC
(European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) podría tener problemas
de validez externa, ya que la muestras se obtuvieron de donantes de sangre (Rohrmann
et al., 2012).
El proceso de comprobación de la validez externa de una cohorte poblacional es
extremadamente costoso desde el punto de vista económico ya que implica el estudio de
los no respondedores mediante entrevistas o encuestas postales y la comparación de los
respondedores con los no respondedores mediante la conexión (record linkage) de
registros (Lund et al., 2003). Además podría haber cuestiones éticas, relacionadas con el
uso de información de personas que muchas veces por cuestiones de privacidad se han
negado a responder la encuesta.
La baja participación en el primer cuestionario de la cohorte podría dar lugar a un
sesgo de selección lo que se ha denominado “efecto voluntario”. Aquellas personas más
preocupadas por la salud, y más propensas a controlar el peso, hacer ejercicio físico y
llevar un estilo saludable serían aquellas que participan más en la encuesta. El problema
de la baja participación ocurre tanto en las cohortes de base poblacional como en las
cohortes de poblaciones especiales, así la cohorte de base poblacional holandesa tuvo
una participación relativamente baja de un 30%, y la multiétnica un 20% en los latinos.
A pesar de todos estos inconvenientes la fortaleza de los estudios de cohorte radica
en la validez interna, en poder probar que la exposición ha ocurrido antes que la
enfermedad.
A continuación se expondrá por separado la parte correspondiente a la discusión de
los tres capítulos en los que se divide la presente Memoria.
146 | P á g i n a
Discusión general
3. ESTUDIO DE LAS VARIANTES GENÉTICAS ASOCIADADAS CON
OBESIDAD
3.1. Efecto del polimorfismo Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2
El primer capítulo de este trabajo examina el efecto del polimorfismo Pro12Ala del
gen PPARG2 sobre el IMC. Este SNP ha sido extensamente estudiado en relación con la
obesidad. Algunos estudios avalan su asociación con la adiposidad (Masud & Ye, 2003;
Danawati et al., 2005; Tanko et al., 2005; Tonjes et al., 2006; Mattevi et al., 2007)
aunque otros presentan resultados negativos (Weiss et al., 2005; Ereqat et al., 2009).
Por otro lado, en la plataforma GIANT (Genetic Investigation of Anthropometric Traits)
no se ha encontrado asociación significativa de esta variante genética con el IMC a
pesar de que se combina información de casi 250.000 sujetos.
Con el objetivo de conseguir resultados concluyentes se ha recopilado la
información disponible en la literatura (Pubmed) –junto a los datos de 972 sujetos del
estudio SUN- en un meta-análisis para cuantificar el efecto del polimorfismo Pro12Ala
del gen PPARG2 sobre el IMC.
En el meta-análisis de Masud & Ye (2003), que incluye 31 estudios y un total de
19.136 sujetos, se concluye que el alelo 12Ala de esta variante genética está relacionado
con un IMC significativamente mayor (+0,066 kg/m2). En nuestro meta-análisis, con 75
estudios y 49.092 sujetos, encontramos un efecto muy similar para el alelo 12Ala sobre
el IMC, +0,065 kg/m2, lo que correspondería con 189 g en una persona de 170 cm de
altura. Sin embargo, este efecto sigue siendo modesto si se compara con el incremento
del riesgo por alelo observado (+0,170 kg/m2) en un “score” genético que incluye 32
variantes genéticas asociadas al IMC en el mayor meta-análisis de GWAS de obesidad
que incluye 249.796 sujetos (Speliotes et al., 2010).
La variante genética Pro12Ala del gen PPARG2 no es la única para la que se
encuentran resultados controvertidos en la bibliografía sobre su asociación con la
adiposidad (Allison et al., 1998; Fujisawa et al., 1998; Kurokawa et al., 2001; Heo et
al., 2002; Masud & Ye, 2003; Marti et al., 2006; Qi et al., 2006; Kurokawa et al.,
147 | P á g i n a
Discusión general
2008). Es por ello, en los últimos años el meta-análisis se ha convertido en una
herramienta muy útil que aporta resultados concluyentes sobre estas asociaciones.
Tonjes et al. (2006) realizaron otro meta-análisis sobre esta variante genética en
relación con la diabetes. Recopilaron 55 estudios (29.214 sujetos) y concluyeron que el
alelo de riesgo 12Ala se asociaba con un mayor IMC en la población caucásica, aunque
no incluían información cuantitativa sobre el efecto del polimorfismo sobre el IMC.
En ambos meta-análisis se observa heterogeneidad entre los estudios recogidos pero
no sesgo de publicación (Golder et al., 2011). Con el fin de controlar la heterogeneidad
realizamos el análisis por subgrupos. La magnitud del efecto del alelo de riesgo 12Ala
sobre el IMC en nuestro estudio es más consistente en varones de origen caucásico
(+0,090 kg/m2 = 260 g en un sujeto de 170 cm de alto). Además, en este subgrupo no se
encontró heterogeneidad entre los estudios incluidos.
El estudio de Masud & Ye et al. (2003) encontró diferencias significativas en el
IMC debidas al alelo de riesgo 12Ala del gen PPARG2 en sujetos con IMC mayor de 27
kg/m2, pero no en los sujetos con un IMC menor. Nuestro estudio confirma de forma
parcial estos resultados, así en sujetos caucásicos con IMC mayor de 30 kg/m2 (obesos)
los portadores del alelo 12Ala tenían niveles significativamente mayores de IMC.
Nuestro meta-análisis presenta limitaciones y fortalezas. La falta de información
sobre factores del estilo de vida así como sobre las interacciones gen-gen son algunas de
las limitaciones de este estudio. En concreto, se debería tener en cuenta el efecto de los
hábitos dietéticos ya que pueden modificar la asociación entre las variantes genéticas y
la obesidad (Razquin et al., 2011).
Una de las ventajas de este trabajo es el número total de sujetos, más de 49.000. Se
incluyen 75 estudios y 109 poblaciones de diferente tamaño, entre 30 y 3.080 sujetos.
Además, únicamente se incluyen estudios cuyas poblaciones presentan frecuencias del
alelo de riesgo 12Ala (2% - 33%) similares a la anotada en la base de datos HapMap.
En estudios de intervención se ha puesto de manifiesto la relevancia clínica del
alelo 12Ala del gen PPARG2. Así, Lindi et al. (2002) y Franks et al. (2007) observaron
que aquellos sujetos portadores del alelo de riesgo 12Ala perdían más peso tras la
148 | P á g i n a
Discusión general
intervención. Sin embargo, Adamo et al. (2007) mostraron resultados opuestos: el alelo
12Ala del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 era más frecuente en sujetos
“resistentes” a la pérdida de peso. Otros estudios no observaron efecto del alelo 12Ala
en la pérdida de peso (Nicklas et al., 2001; Matsuo et al., 2009), debido quizás a las
características específicas de los sujetos: uno solo incluye mujeres y en el otro la
prevalencia del alelo de riesgo 12Ala era muy baja.
En conclusión, el presente meta-análisis muestra que el alelo 12Ala del
polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 aumenta el IMC en población general y el
efecto es más consistente en varones de origen caucásico.
3.2. Efecto combinado de las variantes genéticas: Pro12Ala del gen
PPARG2 y rs9939609 del gen FTO
En este capítulo se examina el efecto conjunto de los polimorfismos Pro12Ala
(rs1801282) del gen PPARG2 y rs9939609 del gen FTO sobre la obesidad, así como las
posibles interacciones con la dieta y la actividad física.
La variante genética Pro12Ala del gen PPARG2 es una de las más estudiadas en
relación a la obesidad como se ha descrito en la Introducción de esta memoria. Estudios
previos describen interacciones entre este polimorfismo y la ingesta dietética, sobre todo
con un alto consumo de algunos macronutrientes (Marti et al., 2002; Robitaille et al.,
2003; Soriguer et al., 2006). Así, Marti et al. (2002) describieron interacción entre esta
variante genética y el consumo de carbohidratos (HC) sobre el riesgo de obesidad en un
estudio de casos y controles.
La principal observación de este estudio es que un alto consumo de HC parece
aumentar el riesgo de obesidad asociado al alelo de riesgo 12Ala del gen PPARG2 en la
población mayor de 55 años de la cohorte SUN. Las bases moleculares no se conocen
pero parece ser que en presencia de un balance energético positivo, el alelo de riesgo
12Ala supera la capacidad adipogénica del alelo Pro. Este efecto ligado a la dieta podría
afectar a vías de señalización de la adiponectina a través de otras moléculas coreguladoras de la transcripción junto a PPARG (Anderson et al., 2010).
149 | P á g i n a
Discusión general
Por otro lado, se observa que la actividad física es capaz de modular el efecto del
alelo de riesgo 12Ala sobre el riesgo de desarrollar obesidad. Se mostró que el riesgo
inicial de desarrollar obesidad asociado a este alelo se veía incrementado en aquellos
sujetos con bajos niveles de actividad física. En este grupo de sujetos el alelo 12Ala
incrementaba en casi una unidad los valores de IMC respecto a los sujetos Pro12Pro.
Sin embargo, la interacción entre el locus Pro12Ala del gen PPARG2 y los niveles de
actividad física no alcanzó significación estadística.
Sobre la segunda variante genética, rs9939609 del gen FTO, no encontramos
asociación con el IMC o la obesidad. Aunque estos resultados parecen contrarios a lo
observado en la literatura (diversos estudios muestran que el alelo de riesgo A se asocia
con mayor adiposidad corporal), hay trabajos que avalan nuestros resultados. Así,
Hardy et al. (2010) describen una asociación débil entre este polimorfismo y el IMC en
una población adulta mayor de 50 años y proponen que el efecto de esta variante
genética sobre la adiposidad se atenúa con la edad. En este sentido Jacobsson et al.
(2011) obtuvieron resultados similares y concluyeron que ningún SNP o haplotipo
estudiado del gen FTO estaba relacionado con la adiposidad o con el consumo total de
energía en una población mayor de 70 años de edad.
Esta variante genética se asoció con adiposidad por primera vez en el año 2007
mediante estudios de GWAS (Frayling et al., 2007; Scuteri et al., 2007) y tras su
descubrimiento estos resultados se replicaron en diversas poblaciones caucásicas,
incluida la población infantil (Rendo et al., 2009). Hasta la fecha se ha sugerido que el
efecto parece estar mediado por un incremento en el consumo total de energía (Cecil et
al., 2008; Tanofsky-Kraff et al., 2009) pero se necesitan estudios post-transcripcionales
y post-transduccionales para entender el mecanismo molecular de este polimorfismo del
gen FTO.
En una segunda fase se analizó el efecto conjunto de los alelos de riesgo 12Ala del
gen PPARG2 y A del gen FTO sobre el IMC así como la posible interacción con
factores del estilo de vida. En el caso de la dieta, un alto consumo de HC incrementó el
riesgo de obesidad asociado a la co-presencia de ambos alelos de riesgo en más de tres
veces en comparación con sujetos no portadores de los alelos de riesgo (grupo de
150 | P á g i n a
Discusión general
referencia, OR=1). Algo similar ocurría con los niveles de IMC, la presencia conjunta
de ambos alelos, 12Ala (PPARG2) y A (FTO), hacía que los niveles de IMC se
incrementasen en más de una unidad, lo que en un sujeto de 170 cm de alto se
correspondería con algo más de tres kg de peso.
Resultados similares se observan en los sujetos con niveles bajos de actividad
física. El riesgo de obesidad se duplica en sujetos con poca actividad física y portadores
de los alelos 12Ala y A de los genes PPARG2 y FTO, respectivamente; en comparación
con los no portadores. El IMC de estos sujetos aumentó en más de 1,5 unidades lo que
se corresponde con casi cinco kg de peso en un individuo de 170 cm de alto.
En resumen, en nuestra población mayor de 55 años de la cohorte SUN el alelo
12Ala del polimorfismo Pro12Ala del gen PPARG2 se asocia con un mayor riesgo de
desarrollar obesidad. Además, se observa una interacción significativa con los HC de la
dieta de forma sujetos con un alto consumo de HC presentan un mayor riesgo de
obesidad. Por otro lado, la presencia conjunta del alelo de riesgo A del gen FTO y el
12Ala del gen PPARG2 incrementó el riesgo de obesidad así como los niveles de IMC.
3.3. Efecto del SNP 3111T/C (rs1801260) del gen CLOCK
El gen CLOCK codifica para un factor de transcripción implicado en la regulación
de los ritmos circadianos, y es un elemento positivo imprescindible para el correcto
funcionamiento de éstos. Estudios previos han demostrado la asociación de este
polimorfismo con la obesidad pero los resultados son controvertidos (Tortorella et al.,
2007; Monteleone et al., 2008; Scott et al., 2008; Garaulet et al., 2011). Así, Garaulet et
al. (2011) describieron diferencias en las horas de sueño, alteraciones en el
comportamiento alimentario y preferencias nocturnas en aquellos sujetos que portaban
el alelo minoritario C de este polimorfismo y sugirieron que estos sujetos eran más
resistentes a la pérdida de peso tras una intervención. Sin embargo, en nuestro estudio
no observamos diferencias en las horas de sueño entre los sujetos portadores del alelo C
y los no portadores, y tampoco observamos diferencias en cuanto a los niveles de
actividad física.
151 | P á g i n a
Discusión general
En nuestra población del estudio SUN encontramos que el alelo C del gen CLOCK
parece estar relacionado con un menor riesgo de sobrepeso/obesidad en mujeres y que
esta asociación parece estar modulada por los niveles de actividad física.
Tortorella et al. (2007) observaron asociación entre el alelo C del polimorfismo
3111T/C del gen CLOCK y un menor peso corporal en un grupo de mujeres con
trastornos de la conducta alimentaria. Además, Scott et al. (2008) propusieron que un
haplotipo que incluía el alelo C de esta variante genética podría proteger frente al
desarrollo de obesidad en un grupo de hombres caucásicos. Otros estudios no
encontraron ninguna asociación de este locus con el desarrollo de la obesidad
(Monteleone et al., 2008).
Se han observado diferencias para el efecto de diversos polimorfismos sobre la
adiposidad entre los sexos (Ben Ali et al., 2009; Nilsson et al., 2011). Además de las
diferencias fisiológicas se sugiere que hay componentes del estilo de vida dependientes
del sexo como la dieta, el consumo de alcohol, la actividad física o el hábito tabáquico
que podrían explicar este efecto modulador (Ober et al., 2008). Además es posible que
el sexo interaccione con ciertas variantes genéticas dando lugar a diferentes
asociaciones en varones y mujeres (Magi et al., 2010). En nuestro estudio se observa
una interacción significativa entre el sexo y el locus 3111T/C del gen CLOCK sobre el
riesgo de sobrepeso/obesidad y que el efecto protector existía únicamente en las
mujeres. Además, parece ser que los niveles de expresión de los genes clock (PER2,
BMAL1 y CRY1) en el tejido adiposo son mayores en mujeres que en varones (GomezAbellan et al., 2012) lo que corrobora que hay diferencias según el sexo en los genes
clock.
En el análisis observamos además una interacción entre la variante genética
3111T/C del gen CLOCK y la actividad física para el riesgo de desarrollar
sobrepeso/obesidad. De forma que el efecto protector sobre la adiposidad observada se
acentúa en el grupo de mujeres con una mayor actividad física, superior a la mediana
(16,8 METs-h/semana). Una posible explicación deriva del trabajo de Wolff & Esser
(2012) que indica que la actividad física programada puede modular los ritmos
circadianos y los niveles de expresión de CLOCK. Se puede sugerir que esta variante
152 | P á g i n a
Discusión general
genética contribuya una sincronización correcta de los ritmos biológicos ejerciendo un
papel protector frente a la obesidad.
No obstante, se necesitan nuevos trabajos experimentales que aclaren la relación
entre el gen CLOCK, los ritmos circadianos y la obesidad.
4. COROLARIO
En este trabajo se recogen evidencias sobre la influencia de diversas variantes
genéticas en el desarrollo de obesidad (Pro12Ala del gen PPARG2, rs9939609 del gen
FTO y 3111T/C del gen CLOCK) así como la interacción de estas con el estilo de vida
(dieta y actividad física). El conocimiento de las variantes genéticas implicadas en la
adiposidad no solo nos ayuda a comprender los mecanismos implicados en el
mantenimiento del peso corporal sino que también nos aporta luz sobre su prevención y
tratamiento (Walley et al., 2009).
El objetivo de la nutrigenética es proporcionar recomendaciones dietéticas
personalizadas basadas en la carga genética del individuo (Ordovás et al., 2005). Para
conseguir este propósito es necesario conocer las variantes genéticas implicadas y sus
interacciones con el estilo de vida, lo que requiere grandes tamaños muestrales por la
complejidad de la evaluación de los estilos de vida (hábitos dietéticos y de actividad
física). Estudios llevados a cabo mediante colaboraciones internacionales, como el de
Kilpelainen et al. (2011) que reúnen información de más de 200.000 sujetos, resultan
muy útiles para confirmar interacciones entre variantes genéticas y el estilo de vida. Por
otro lado, para conocer los mecanismos moleculares implicados en las interacciones
observadas son necesarios trabajos in vitro e in vivo.
Con todo esto, el conocimiento de las variantes genéticas implicadas en el
desarrollo de la obesidad y de sus interacciones con los estilos de vida cambiará la
manera de prevenir y tratar la enfermedad a través de recomendaciones sobre dieta o
ejercicio físico, lo que supondrá un fuerte impacto en la salud pública (Ordovás et al.,
2005).
153 | P á g i n a
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CONCLUSIONES
Conclusiones generales
CONCLUSIONES GENERALES
1.
En el meta-análisis de 49.092 sujetos sobre la asociación entre el polimorfismo
Pro12Ala (rs1801282) del gen PPARG2 y el Índice de Masa Corporal (IMC) se
encontró que el alelo de riesgo 12Ala aumentó de forma significativa el IMC
(+0,065 kg/m2, p=0.001). Dicho efecto fue mayor en el subgrupo de varones de
origen caucásico (+0,090 kg/m2, p=0.002).
2.
En la población mayor de 55 años de la cohorte SUN el alelo 12Ala del gen
PPARG2 se asoció con un mayor riesgo de desarrollar obesidad. Además, se
observó una interacción significativa entre este polimorfismo y el consumo de
carbohidratos, viéndose todavía más afectados por la presencia de este alelo los
sujetos con un alto consumo de hidratos de carbono.
3.
La variante genética rs9939609 del gen FTO no se asoció con un mayor riesgo
de obesidad ni con mayores niveles de IMC en una población adulta-mayor del
estudio SUN.
4.
La co-presencia de los alelos de riesgo A (rs9939609) del gen FTO y 12Ala del
gen PPARG2 incrementó el riesgo de desarrollar obesidad observado para la sola
presencia del alelo 12Ala del gen PPARG2.
5.
Un elevado consumo de carbohidratos, así como bajos niveles de actividad
física, aumentaron de forma significativa el riesgo de desarrollar obesidad ligado
a la presencia conjunta de los alelos A (rs9939609) del gen FTO y 12Ala el gen
PPARG2.
165 | P á g i n a
Conclusiones generales
6.
Se encontró una interacción significativa sobre el riesgo de sobrepeso/obesidad
entre el sexo y el alelo C (rs1801260) del gen CLOCK. Se observaron menores
niveles de IMC en las mujeres portadoras del alelo C de esta variante genética
frente a las no portadoras.
7.
En mujeres físicamente activas y portadoras del alelo C el riesgo de
sobrepeso/obesidad disminuyó de forma notable, observándose una interacción
significativa entre el SNP 3111T/C del gen CLOCK y la actividad física.
166 | P á g i n a
ANEXOS
ANEXO 1
Consentimiento informado
“DETERMINANTES NUTRICIONALES Y METABÓLICOS DEL DESARROLLO DE DETERIORO COGNITIVO”
Marca, por favor, la opción que desees (sólo una):
1) Deseo participar en este nuevo subestudio (dos llamadas telefónicas y envío de saliva).
2) Deseo recibir sólo las dos llamadas telefónicas pero NO enviar la muestra de saliva.
3) Deseo enviar la muestra de saliva, pero NO deseo recibir las dos llamadas telefónicas.
4) NO deseo participar en ningún aspecto del nuevo estudio.
- Si has contestado la opción 1 ó la 2 indica el número de teléfono al que deseas que te llamemos y tu
preferencia de horario y día de la semana:
Teléfono:______________
Horario: _______a _______
Día de la semana: _________________
- Si has contestado la opción 1 ó la 3, por favor firma este consentimiento, junto con un testigo de la
firma, que es necesario para cumplir los requisitos legales de confidencialidad y consentimiento informado.
Por la presente AUTORIZO a la Universidad de Navarra a procesar estas muestras únicamente para propósitos
científicos y de investigación y CERTIFICO que he leído y entiendo el consentimiento anterior y que las
explicaciones requeridas fueron hechas a mi satisfacción (estamos a tu disposición para aclarar cualquier otro
aspecto*), por todo ello ACEPTO VOLUNTARIAMENTE participar en este estudio.
Firma del testigo:
Firma del voluntario:
Nombre y apellidos:
Nombre y apellidos:
_____________________________
_____________________________
*Si tienes cualquier duda, puedes escribirnos un correo electrónico: sunmemoria@unav.es o llamarnos por teléfono.
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ANEXO 2
Cuestionario basal C_0
ANEXO 3
The effect of the Mediterranean diet on plasma brain-derived
neurotrophic factor (BDNF) levels: The PREDIMED-NAVARRA
randomized trial
Sanchez-Villegas, A., Galbete, C., Martinez-Gonzalez, M., Martinez, J., Razquin, C., SalasSalvado, J., & ... Marti, A. (n.d). The effect of the Mediterranean diet on plasma brain-derived
neurotrophic factor (BDNF) levels: The PREDIMED-NAVARRA randomized trial. Nutritional
Neuroscience, 14(5), 195-201.