Gloria Gutiérrez

Bioquímica Experimental
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Gloria Gutiérrez-Venegas.
Antecedentes
Cromatografía en Capa Fina.
La cromatografía en capa fina consiste en la separación de mezclas de moléculas mediante el
principio del reparto entre dos fases. En general, una cromatografía se realiza permitiendo que
la mezcla de moléculas que se desea separar (lo que corresponde a la muestra) interaccione
con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la
fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar"
(eluír) a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintas moléculas en la muestra
presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a los distintos componentes
con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán
eluídos más rápido que los que sean solubles en la fase estacionaria.
En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte sólido
granulado, tales como gel de sílica, alúmina, ácido silícico u otros, que se depositan sobre una
placa de vidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la
capa de fase estacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro
agente cementante. Las muestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un
pequeño círculo cerca del extremo inferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea
poner más muestra se pueden aplicar más gotas, cuidando de que la mancha no se haga
demasiado grande.
La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). La
polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se
desea separar.
En cromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera
como la fase polar.
Como sólo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase
estacionaria y asciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las
sustancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar
a la separación.
La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de
interés. La movilidad relativa o Rf es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un
compuesto, dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la
placa del solvente.
Se puede utilizar también papel para cromatografía, que se fabrica a partir de celulosa pura y
fibras de celulosa para intercambio iónico. Este papel permite separaciones eficientes y rápidas
de sustancias orgánicas o inorgánicas cargadas.
Entre los diferentes tipos de papel se encuentra el tipo DE81 que es un papel delgado
(0.20mm) con grupos funcionales de dietil aminoetilo (DEAE) celulosa. La velocidad de flujo es
de 95mm/30 min (en agua). Actúa como un intercambiador de aniones débilmente básico para
separación de aniones, nucleótidos y aminoácidos. También para ensayos enzimáticos y
aplicación de la técnica de la huella dactilar
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En un sistema de TLC bien caracterizado, las substancias pueden identificarse comparando los
valores de Rf con los de estándares, que se han analizado previamente o durante la
cromatografía.
Si se desea, las substancias pueden recuperarse raspando la sílica de la placa del lugar en el
que se detectó la mancha. Para ello, es necesario emplear métodos de revelado que no
destruyan a la muestra.
Separación de aminoácidos.
Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica,
empleando como fase móvil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Las manchas de los
aminoácidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si después de secarla se asperja
con una solución de ninhidrina.
Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin
embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una
mancha de color amarillo obscuro.
Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios
de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía
líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y tiene
mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia.
Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar
fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada
fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debe
degradarse hasta liberar los aminoácidos que la componen y luego estos se separan en una
o
placa de gel de sílica. La placa se gira 90 y se desarrolla con un segundo sistema de
solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo de ácido fosfomolíbdico
para permitir su identificación. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas
direcciones (en este caso se aplica sólo una muestra por placa) se conocen como TLC
bidimensional.
La cromatografía en capa fina de aminoácidos que presentan diferentes solubilidades como
por ejemplo glicina (Gly), leucina (Leu), ácido aspártico (Asp) y lisina (Lys), se van a separar
en función de sus diferentes solubilidades entre la fase móvil líquida, constituida por nbutanol/acetona/ácido acético/agua, y la fase estacionaria, también líquida al estar constituida
por el agua adsorbida por el material sólido de la capa fina, en este caso celulosa.
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El fundamento de la separación implica que los aminoácidos cuya cadena lateral (R) tenga un
carácter más apolar, tendrán tendencia a desplazarse con la fase móvil, mientras que los
aminoácidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, serán retenidos por la fase
estacionaria. Ello es así, porque la fase móvil está formada por solventes que son más
apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria.
Protocolo:
La cromatografía de aminoácidos se realiza en 5 etapas.
1ª Etapa: Aplicación de la muestras que se van a analizar.
La primera precaución que hay que tener en el manejo de la placa es la de procurar no tocar
con los dedos la capa de celulosa. La placa fina se maneja por los bordes de la misma.
2ª Etapa.
Posteriormente se coloca la placa en la mesa y con un lápiz y regla se traza una línea a unos
1.5 cm del borde inferior de la placa y sin tocar la superficie de la celulosa. En la línea se
señalan los puntos en donde se aplicará cada aminoácido. La aplicación se realiza con una
micropipeta o pipeta pasteur.
Es importante que para la aplicación se cada aminoácido se deben utilizar puntas diferentes.
Las pipetas se manejan de acuerdo a las normas de manejo de micropipetas o pipetas pasteur.
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Se aplica sobre la placa una gota de la muestra, procurando que no se extienda. Se seca a con
un secador de aire. Se aplica la segunda gota y se vuelve a secar. Se repite esta operación
cada vez que se vaya a aplicar la muestra.
3ª Etapa.
Después de se ha concluido la aplicación de la muestra se realiza la anotación del orden
Una vez realizada la aplicación de cada muestra es importante que se deje cada punta de
pipeta amarilla en el tubo correspondiente y que se anote en el cuaderno de laboratorio las
posiciones en las que se ha colocado cada aminoácido patrón y el problema. La cromatografía
se realiza en una cámara que contiene la fase móvil, la altura de la fase móvil no debe exceder
la línea de aplicación de la muestra.
La técnica de elusión que se va a utilizar para la realización de la cromatografía es la
ascendente, porque la fase móvil asciende por capilaridad por los poros de celulosa. La placa
que es la que contiene las muestras se introduce en la cámara. Se cierra y se espera a que la
fase móvil ascienda por la placa hasta que llegue al extremo opuesto a la parte sumergida. Una
vez realizada la elusión se abre la cámara y se retira la placa.
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