- 89 - ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN HECES

Producciones agroganaderas: Gestión eficiente y conservación del medio natural (Vol. I)
ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN HECES DE RUMIANTES
MEDIANTE ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO CERCANO (NIRS)
E. ALONSO1, A. IGARZABAL2, L.M. OREGUI2 Y N. MANDALUNIZ2.
NEIKER - Dep. Agrosistemas y Producción Animal. 1Barrio Berreaga 480 Derio (Bizkaia)
2
Apdo. 46 01080 Vitoria-Gasteiz. ealonso@neiker.net
RESUMEN
El contenido de nitrógeno (N) en las heces (Nfecal) puede ser utilizado como
indicador de la digestibilidad de la dieta utilizada por animales en pastoreo. Poder contar
con una evaluación fiable, rápida y económica de este parámetro, como la aportada por la
metodología NIRS, facilitaría su utilización en la gestión de los animales en sistemas semiextensivos o extensivos. El objetivo del presente trabajo ha sido desarrollar ecuaciones
NIRS para la evaluación del Nfecal en heces de rumiantes que utilizan pastos de montaña
en condiciones extensivas. Para ello se ha dispuesto de 279 muestras de heces, 172 de
vacuno, 86 de ovino y 21 de caprino, en las que se evaluó su contenido en N mediante la
técnica Kjeldahl, y de las que se seleccionaron al azar un 10% como grupo de validación
externa. La calibración NIRS se realizó utilizando cuatro tratamientos matemáticos
diferentes, de acuerdo con la derivada de los datos espectrales (primera o segunda), el valor
del gap (4, 5 o 8 nm) y del primer suavizado (4 o 5), considerados. Las ecuaciones
obtenidas utilizando la segunda derivada son las que presentan unos coeficientes de
determinación (R2) más elevados, acompañadas de menores errores estándar (EE), tanto en
calibración (R2c=0,956-0,921 y EEc=0,085-0,105) como en validación cruzada
(R2vc=0,919-0,888 y EEvc=0,116-0,125). Los estadísticos obtenidos con la muestra de
datos de validación externa han permitido identificar la ecuación obtenida a partir de la
segunda derivada y con un gap de 8 nm, como la que permite una mejor estimación del
contenido del Nfecal en heces de rumiantes, con valores de errores estándar de predicción
de 0,096 y coeficiente de variación de 4,8%. Los resultados obtenidos permiten una
adecuada estimación del Nfecal, si bien el aumento de número de muestras, que amplíe el
rango respecto al contenido de N en heces, así como la representación del caprino, podría
mejorar su robustez.
Palabras Clave: Nitrógeno fecal, determinación, NIRS, vacuno, ovino, caprino.
RUMINANT FAECAL NITROGEN CONTENT ESTIMATION USING NEARINFRARED SPECTROSCOPY (NIRS) SYSTEM
SUMMARY
The Nitrogen content of faeces, faecal nitrogen, can be used in the estimation of diet
digestibility in grazing animals. A methodology quick, economic and accurate of faecal
nitrogen estimation could allow use this parameter in extensive grazing management. The
objective of this work was the development of NIRS calibration for ruminant faecal
nitrogen evaluation. A set of 279 samples, 172 of cows’ faeces, 86 of sheep and 21 of goats,
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XLV Reunión Científica de la SEEP (Sesión: Producción Animal)
in which N was evaluated by Kjeldahl method, were used. A 10% of samples were
randomly selected as external evaluation set. Four different mathematical treatments were
compared for NIRS calibration. These treatments resulting for combination of different
spectral data derivatisation (first or second order), gap values (4, 5 or 8 nm), and first
smoothing (values of 4 or 5). The equations using the second derivatisation of spectral data
was those with higher determination coefficient (R2) and lower standard error, both in
calibration (R2c=0.956-0.921 and EEc=0.085-0.105) or cross validation (R2vc=0.919-0.888
and EEvc=0.116-0.125). The external validation show that the equation using second order
derivatised spectral and a gap value of 8 nm, was the more accurate, resulting in prediction
standard error of 0.096 and a variation coefficient of 4.8%. According to these results NIRS
allow a good estimation of faecal nitrogen. Nevertheless the increase of sample number,
range of faecal nitrogen and goat representation could improve the robustness of equation.
Key Words: Faecal nitrogen, evaluation, NIRS, cows, sheep goats.
INTRODUCCIÓN
En estudios realizados en pastizales de montaña se ha observado una evolución
similar de la calidad de la oferta, las características de la ración, evaluada mediante análisis
micrográfico de las heces, y el contenido en nitrógeno (N) de las heces (Mandaluniz, 2003).
Este paralelismo tiene como base fisiológica la relación existente entre el N total eliminado
en heces y la cantidad de alimento ingerido tanto en dietas forrajeras (Arnold y Dudzinski,
1963; Mason, 1971), como mixtas (Giráldez et al., 1997). Por consiguiente, dado que la
producción de heces por unidad de alimento ingerido es inversamente proporcional a la
digestibilidad, la concentración de N en las mismas podría ser utilizado como estimador de
la calidad de la dieta y de la ingestión en animales en pastoreo libre, y así ha sido utilizado
para evaluar la calidad de la dieta en rumiantes salvajes (Dorgeloh et al., 1998; van der
Waal et al., 2003). Este parámetro, como indicador de las características de la dieta ingerida
por los animales, podría ser útil en el manejo del ganado que utiliza los pastos de montaña,
al permitir una comparación entre sus necesidades y los recursos obtenidos del pasto.
Para ello se precisaría una metodología que permitiera evaluar el contenido de N en
las heces de forma ajustada, rápida y económica. La tecnología de análisis por
espectroscopía en el infrarrojo cercano (NIRS) es cada vez más utilizada en producción
animal, para la evaluación de la composición química de los alimentos utilizados (Castro et
al., 2002; De la Roza et al., 1998; García-Ciudad et al., 2004), así como en la estimación de
otras características de las dietas o alimentos (Decruyenaere et al., 2004). Su empleo
requiere el desarrollo de ecuaciones de calibración, respecto a una técnica analítica de
referencia, lo que suponer definir el mejor tratamiento matemático de los espectros
obtenidos mediante pruebas de ensayo/error (Park et al., 1997).
El objetivo del presente trabajo ha sido el desarrollo de una ecuación de calibración
NIRS para heces de rumiantes que utilizan pastos de montaña, que permita estimar el
contenido de N en las mismas.
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Producciones agroganaderas: Gestión eficiente y conservación del medio natural (Vol. I)
MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se realizó a partir de una colección constituida por 279 muestras de heces
de las tres especies de rumiantes que utilizan los pastos comunales del País Vasco, vacuno
(172 muestras), ovino (86 muestras) y caprino (21 muestras). Las heces se recogieron entre
los meses de junio y octubre, en cinco zonas de pastoreo de los parques naturales del
Gorbeia e Izki, en los años 2003 y 2004. La muestra de heces frescas, recogidas
inmediatamente después de su deposición por los animales, se identificaban y conservaban
refrigeradas hasta su llegada al laboratorio. A continuación, se procedía a su desecado,
hasta peso constante, en una estufa de aire forzado a 65ºC, para posteriormente molturarse
en un molino provisto de un tamiz de 1 mm.
Sobre las muestra molidas se determinó el contenido de nitrógeno mediante la
metodología Kjeldahl (A.O.A.C., 1999). Los datos obtenidos se refirieron a materia seca
(MS), previa determinación de la humedad residual en estufa a 103ºC. Los espectros de las
muestras molidas se realizaron por duplicado (en diferentes cápsulas rectangulares) como
log 1/R, (R= reflectancia), utilizando un equipo 6500 (Foss NIRSystems, MD, USA) de
barrido continuo entre 400 y 2500 nm, (con lecturas a intervalos de 2 nm), equipado con
módulo de transporte. Se promediaron los espectros de cada muestra para obtener el de
trabajo. Los espectros resultantes fueron reducidos a la región NIR (1100-2498 nm),
utilizando para ello el programa TRIM del paquete informático WinISI II versión 1.50 (ISI,
2000).
Se seleccionaron al azar un 10% de muestras para conformar el fichero de validación
externa. Sobre las restantes se aplicaron los programas CENTER y SELECT, análisis
discriminante basado en la distancia de Mahalanobis calculada por componentes
principales, para seleccionar aquellas representativas para la calibración. Los espectros
NIRS se transformaron matemáticamente llevando a cabo la tipificación de la absorbancia
(corrección SNV), seguida de una corrección de la tendencia (Barnes et al., 1989) para
corregir los efectos de dispersión de luz.
Se derivaron cuatro modelos matemáticos (Tabla 1), descritos por cuatro dígitos. El
primero corresponde a la derivada (primera o segunda) de los datos espectrales, el segundo
a la distancia (4, 5o 8 nm) entre los puntos del espectro utilizada en el cálculo de la
derivada (gap). Los dígitos tercero y cuarto corresponden al primer y segundo segmentos de
suavizado (smooth), para la corrección de las interferencias relacionadas con la muestra o el
propio instrumento, y debidas al efecto multiplicador de las variaciones en la luz difusa. En
todas los casos el segundo suavizado se mantuvo constante, e igual a 1, variando el primero
(4 o 5). El programa utilizado fue el anteriormente indicado WinISI II versión 1.50.
Finalmente, las ecuaciones de calibración se obtuvieron por regresión MPLS
(mínimos cuadrados parciales), realizándose una validación cruzada. La validación externa
de las ecuaciones NIR se realizó mediante regresión lineal entre los resultados NIR y los
datos de referencia de las muestras seleccionadas al azar con este fin.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los valores medios, el rango y la desviación estándar del contenido de N fecal
(Nfecal) de las muestras que conforman los grupos de calibración y validación aparecen
reflejados en la tabla 1. Los valores de N fecal de las muestras en el grupo de validación
están incluidos en el intervalo de variación del grupo de calibración.
Tabla 1. Valores medios, rangos, y desviaciones estándar (d.e.) del N fecal para los
grupos de muestras de calibración y validación utilizados de las distintas ecuaciones
de estimación del N fecal a partir de la tecnología NIRS.
Parámetro
Nfecal (%MS)
Muestras de calibración
(n=252)
Media
Rango
d.e.
1,98
0,92-3,20
0,410
Muestras de validación
(n=27)
Media
Rango
d.e.
2,00
1,42-2,67
0,318
Los principales estadísticos obtenidos para la muestra de calibración-validación
cruzada, con los distintos modelos matemáticos utilizados se resumen en la Tabla 2. El
coeficiente de determinación, entre los datos de N fecal obtenidos por el método de
referencia (N Kjeldahl) y los obtenidos por la metodología NIR en las muestras de
calibración fue en todos los casos elevado, Rc2>0,90, con errores estándar en torno a 0,10.
En validación cruzada, se obtuvieron unos coeficientes de determinación (0,87<Rvc2<0,92)
algo menores y errores estándar (EEvc) ligeramente superiores, a los correspondientes de
calibración, utilizando las mismas muestras. En ambos casos los coeficientes de variación
son inferiores al 10%, con intervalos de 4,3-6,3 y 4,8-6,3, en calibración y validación
cruzada, respectivamente.
De las distintas ecuaciones utilizadas, las obtenidas utilizando la segunda derivada
(3 y 4) son las que permiten un mejor ajuste y precisión de los valores de N fecal de la
muestra de calibración (Tabla 2, Figura 1). Entre ellas la mejor es la obtenida utilizando un
valor de gap de 4 nm. En calibración cruzada destaca que mientras el coeficiente de
correlación de la ecuación (4) es inferior al de la ecuación (2), el error estándar es también
menor en la ecuación (4) que en la (2).
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Tabla 2, Estadísticos de calibración-validación cruzada y de validación externa de las
ecuaciones de predicción de los parámetros de nitrógeno fecal (Nfecal) en heces de
rumiantes.
Parámetros estadísticos
Calibración – Validación Cruzada
Tratamiento
N
EEc
Rc
(1) 1,4,4,1
88
0,121
(2) 1,5,5,1
91
(3) 2,4,4,1
(4) 2,8,4,1
2
EEvc
Rvc
0,912
0,146
0,107
0,931
110
0,085
92
0,105
Validación Externa
2
EEP
RPD
RER
0,873
0,119
2,67
9,75
0,131
0,901
0,121
2,63
9,75
0,956
0,116
0,919
0,104
1.94
7,77
0,921
0,125
0,888
0,096
3,31
12,29
N: número de muestras empleadas para crear la calibración; EEc: error estándar de calibración; Rc2:
coeficiente de determinación para el procedimiento de calibración; EEvc: error estándar de validación
cruzada; Rvc2: coeficiente de determinación para el procedimiento de validación cruzada; EEP: error
estándar de predicción; RPD: relación entre la desviación estándar del grupo de muestras de
validación externa y el error estándar de predicción; RER: relación entre el rango del método de
referencia para el grupo de validación y el error estándar de predicción.
En la misma Tabla 2 se indican los estadísticos obtenidos a partir de la muestra de
validación externa. Para los distintos tratamientos utilizados, los errores estándar de
predicción (EEP) no difieren en más de un 20% de lo correspondientes errores estándar de
calibración (EEc), lo que avala la capacidad predictiva de estos modelos (Shenk et al.,
1992). Si consideramos los valores de 3,0 y 10,0 como los mínimos recomendables para los
parámetros RPD y RER, respectivamente (Williams y Sobering, 1996), la ecuación
obtenida mediante el tratamiento (4) es la única que cumple con estos condicionantes. No
obstante, en los tratamientos (1) y (2) los valores de RPD y RER son próximos a estos
límites propuestos. Por el contrario, la ecuación resultante del tratamiento (3), que
presentaban unos mejores estadísticos, mayores R2 y menores errores estándar en
calibración y validación cruzada, presentan los peores en validación externa.
3,2
3,2
a)
b)
2,8
2,4
N Kjeldahl
N Kjeldahl
2,8
2
Vacuno
1,6
Ovino
Caprino
1,2
X=Y
2,4
2
1,6
Vacuno
1,2
Caprino
Ovino
X=Y
0,8
0,8
1
1,4
1,8
2,2
2,6
3
N NIRS
1
1,4
1,8
2,2
2,6
3
N NIRS
Figura 1. Valores de Nitrógeno fecal valorados mediante la técnica Kjeldhal de las
colección de muestras de calibración y sus correspondientes valores de N por NIRS, en
base a los tratamientos 1 (a) y 4 (b).
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Tal como puede observarse en las Figuras 1 y 2, la distribución de los datos,
contenido en Nfecal, y la relación entre la determinación laboratorial y la estimación
mediante NIRS, no parece verse afectada por la especie animal. No obstante, el número de
datos de caprino es escaso, lo que hace que esté poco representado en la muestra, en
particular en el grupo de validación externa. Sería conveniente incrementar el número de
muestras de caprino, pero también de ovino, para mejorar la robustez de la ecuación NIRS
de estimación.
3,2
3,2
a)
2,8
2,4
2,4
N Kjeldahl
N Kjeldahl
b)
2,8
2
Vacuno
1,6
Ovino
2
Vacuno
1,6
Ovino
Caprino
1,2
0,8
1
1,4
1,8
2,2
2,6
Caprino
1,2
X=Y
3
NNIRS
X=Y
0,8
1
1,4
1,8
2,2
2,6
3
NNIRS
Figura 2. Valores de Nitrógeno fecal del grupo de muestras de calibración externa,
valorados mediante la técnica Kjendhal y estimados por NIRS, de acuerdo con los
tratamientos 1 (a) y 4 (b).
CONCLUSIONES
El análisis de los espectros en el infrarrojo cercano de heces de rumiantes que
utilizan pastos de montaña ha permitido establecer una ecuación de estimación de su
contenido en N, de forma independiente de la especie. De acuerdo con los coeficientes de
correlación y errores estándar de calibración y validación cruzada, las ecuaciones NIRS
obtenidas a partir de la segunda derivada, son las más ajustadas y precisas. La validación
externa, confirma la utilidad de estas ecuaciones, en espacial la resultante de utilizar la
segunda derivada y la distancia entre los puntos del espectro (gap) de 8 nm. Su robustez en
la estimación del Nfecal, si bien adecuada para los objetivos planteados, podría ser
mejorada mediante la incorporación de muestras que amplíen el rango de variabilidad de
Nfecal, así como la representación de muestras de caprino y ovino.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo se ha realizado en el marco del proyecto “RTA-02-086-C2”
financiado por el INIA.
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