Utilidad de los derivados de la tetracic1ina como inhibidores de la angiogénesis tumoral en· neoplasias del sistema nervioso. Estudio experimental sobre un tumor neuroectodérmico indiferenciado J. Vaquero; M. Zurita; S. Coca y S. Oya. Unidad de Investigación en Neurociencias de la Fundación Mapfre-Medicina. Laboratorio de Neuro-oncología experimental del Servicio de Neurocirugía del Hospital Universitario Clínica Puerta de HielTo. Madrid. Resumen KEY WüRDS: Tetracycline. Minocycline. Experimental brain tumor. Tumor angiogenesis. Se ha realizado un estudio experimental sobre un modelo de tumor neuroectodérmico indiferenciado, con el propósito de conocer el posible efecto antitumoIntroducción Documento descargado de http://www.revistaneurocirugia.com el 19/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier m ral de un derivado de la tetraciclina (minociclina) con capacidad para inducir una inhibición de la angiogéEn los últimos años se están ensayando múltiples esnesis tumoral. La administración intratumoral de mitrategias para tratar de controlar el crecimiento de los tunociclina sobre el tumor experimental IL-7, durante 4 mores malignos. Puesto que el crecimiento de estos tumosemanas, no modificó el crecimiento del tumor ni su res está condicionado en gran parte por la neoformación de vasos sanguíneos en el seno del tumor l -4, una de dichas patrón de angiogénesis. Estos resultados sugieren la escasa utilidfld de líneas de investigación que traten de estrategias consiste en la utilización de fármacos capaces controlar él crecimiento de neoplasias indiferenciadas de inhibir la angiogénesis turnaraIS. Por otra parte, es codel Sistema Nervioso basándose en una supuesta inhinocido que los tumores malignos del Sistema Nervioso y en particular los gliomas de alto grado, presentan una rica bición de la angiogénesis tumoral inducida por derivavascularización, lo que teóricamente les hace susceptibles dos de la tetraciclina. de ser tratados mediante inhibidores de la angiogénesis. PALABRAS CLAVE: Tetraciclina. Minociclina. Tumor En esta línea de investigación, se han publicado recientecerebral experimental. Angiogénesis tumoral. mente evidencias experimentales a favor de que ciertos derivados de la tetraciclina, con efecto antiangiogénico, pueden ser útiles para controlar el crecimiento de tumores Effects of tetracycline derivates as inhibitors of del sistema nerviosoI 3.1 4 • tumor angiogenesis (C.N.S.). Experimental study Teniendo en cuenta la disponibilidad de un tumor muon an undifferentiated neuroectodermal tumor rino con características de tumor neuroectodérmico primitivo y capaz de crecer en el espacio subcutáneo de ratas l2 singénicas , nos hemos planteado la realización de un esSummary tudio experimental sobre dicho tumor, para tratar de comAn experimental study on a model of undifferentiaprobar la posible eficacia de la administración intralesioted neuroectodermal tumor has been accomplished in nal de un derivado de la tetraciclina (minociclina) con coorder to know the possible antitumor effect of a tenocido efecto antiangiogénico. tracycline derivative (minocycline), with capacity to induce an inhibition of the tumor angiogenesis. The inMaterial y métodos tratumoral administration of minocycline on the experimental tumor IL-7, during 4 weeks, it did not modify Para la realización del presente trabajo experimental the growth of the tumor neither its pattern of angiogehemos utilizado el tumor IL-7_ Se trata de una línea tumonesis. These results suggest the scarce usefulness of reral estable, obtenida a partir de un tumor indiferenciado search that try of controlling the growth of undiffereninducido por etilnitrosourea en la rata Wistar y capaz de tiated neoplasias of the Nervous System by means of a mantenerse en criopreservación, con características de nesupposed inQibition of tumor angiogenesis induced by oplasia neuroectodérmica indiferenciada. El tumor crece tetracycline derivatives. en el 100% de los casos tras su implante, en forma de pequeños bloques de tejido, sobre el espacio subcutáneo de Neurocirugía 1997; 8: 178-182. ratas singénicas recién nacidas". 178 Utilidad de los derivados de la tetraciclina como inhibidores de la angiogénesis tumoral en neoplasias del sistema nervioso... 20 5 -... I!II O Tratados Controles Tratados O Controles - ... .!>< G) 3 'Q.o ca O CJ~ E G) lIIIilI ca O e c. ~ fI) ca - o E 4 CJ CJ :::J Neurocirugía 10 G) "C 2 ...o Documento descargado de http://www.revistaneurocirugia.com el 19/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier m G) E E -o ':::J '::J Z > O~-- o-F---Fig. 1.- Volumen tumoral medio en cada uno de los grupos experimentales al finalizar las 4 semanas del tratamiento. No se observaron diferencias estadísticamente significativas. El estudio fue realizado sobre 16 animales (ratas Wistar singénicas inmunocompetentes). A los 3 días del nacimiento se les implantó 1 rnm 3 de tumor IL-7 criopreservado, sobre el espacio subcutáneo epicraneal. A partir de los 20 días, en todos los casos se observó una tumoración palpable, con evidentes signos de crecimiento, en la zona de implantación. A partir de ese momento se hicieron 2 grupos experimentales. Los animales del grupo «tratados» (lO animales) recibieron, durante 4 semanas, una inyección diaria, sobre el tumor, de 100 mg. de minociclina, disuelta en suero fisiológico, con un volumen total por inyección de 1 cc. Un segundo grupo estuvo formado por los 6 animales restantes, a los que se administró, con las mismas pautas, únicamente suero fisiológico (animales control). A las 4 semanas se determinó el volumen tumoral en cada uno de los animales, utilizando la fórmula de Houchens y cols. 6 y se procedió su sacrificio mediante sobredosificación anestésica con éter. Se recogieron muestras de los tumores correspondientes a ambos grupos experimentales para su estudio con técnicas histológicas convencionales y para estudios inmunohistoquímicos. Sobre preparaciones histológicas teñidas con la técnica de hematoxilina-eosina, y a un aumento de 200 X, se determinó el número de capilares en 20 campos diferentes, tomados al Fig. 2.- Número de capilares por campo microscópico, a 200 aumentos, en los tumores de cada grupo experimental. No se observaron diferencias estadísticamente significativas. azar y correspondientes a 3 tumores de cada uno de los grupos experimentales. Igualmente se determinó, sobre 100 campos microscópicos correspondientes a 4 tumores diferentes de cada uno de los grupos experimentales, el porcentaje de superficie ocupada por luces vasculares en relación con la superficie total del campo. Para esta determinación se empleó un morfómetro de imágenes MIP (Microm España, S.A.). Entre las técnicas inmunohistoquímicas, se realizaron determinaciones del índice de positividad al antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), expresado como porcentaje de células con marcaje nuclear. Para esta determinación se estudiaron 3 tumores diferentes dentro de cada grupo experimental y se analizó un mínimo de 400 células tumorales en cada una de las muestras. Los valores medios del volumen tumoral, del número de capilares y del índice dePCNA correspondientes a cada uno de los grupos experimentales fueron comparados estadísticamente por medio del programa informático GraphPad InStat para Macintosh. En todos los casos, un valor de p<O,OS fue considerado como índice de significación estadística. Resultados La Figura 1 muestra el volumen tumoral medio, al finalizar las 4 semanas de tratamiento, correspondiente a cada uno de los grupos experimentales. En el grupo de 179 Neurocirugía Utilidad de los derivados de la tetraciclina como inhibidores de la angiogénesis tumoral en neoplasias del sistema nervioso ... SO liI O O C. Tratados Controles E ca (.) - ~ :::s (.) -ca 80 60 ~ el) > .O el) .(.) ~ O Tratados Controles 'O ca - DI e 20 (.) ti) .- Z O O- ..... ca -« 100 ~ C. 10 el) C. 40 el) Documento descargado de http://www.revistaneurocirugia.com el 19/11/2016. 'C Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier m :::s el) (.) CJ) 20 'C ?fi e o -F---- o -F--- Fig. 3.- Porcentaje relativo de superficie vascular correspondiente a los tumores de los dos grupos experimentales. No se observaron diferencias estadísticamente significativas. Fig. 4.- Indice de proliferación celular (peNA) obtenido en los tumores de cada grupo experimental. No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas. animales tratados el volumen tumoral medio ± desviación standard fue de 2.2±1.6 C.c. y en el de animales control de 1.6±0.8. La media de capilares por campo microscópico a 200 aumentos fue de 10.5±3.66 en el grupo de tumores tratados y de 9.6±2.63 en los tumores del grupo control (Figura 2). El porcentaje de superficie ocupada por luces vasculares respecto a la superficie total de cada campo microscópico mostró unos valores del l2.5±5.9% en los tumores tratados y del 14.25±5.3% en los tumores del grupo control (Figura 3). Tras hacer el estudio de comparación estadística para todos estos valores, entre tumores tratados y tumores no tratados, no se observaron diferencias significativas. En cuanto a las determinaciones del índice de proliferación nuClear, se obtuvieron unos valores medios del 56.4±8.2% y 58.7±6.4%, respectivamente, para ambos grupos (Figura 4). El análisis estadístico efectuado tampoco mostró diferencias significativas. consecuencia de su capacidad para inhibir la síntesis proteica. Además de esta propiedad, se han publicado evidencias que muestran un efecto directo antitumoral de estos fármacos sobre diversos modelos experimentales 9. 11 • Por lo general, este efecto antineoplásico se ha atribuido a que las tetraciclinas y sus derivados pueden inhibir la síntesis proteica mitocondrial en las células tumorales, con lo que se frena su ciclo de división en fase G 1 13. Sin embargo, recientemente se ha descrito una nueva propiedad de estos fármacos, consistente en su capacidad para inhibir la colagenasa de la matriz extracelular, y consecuentemente inhibir la angiogénesis colágeno-dependiente?·8. Ello ha llevado a suponer que el principal mecanismo de acción antitumoral de la tetraciclina y sus derivados podría ser a través de lograr una inhibición de la neovascularización, efecto que al parecer ha sido confirmado por Tamargo y cols., al observar cómo la minociclina incorporada en polímeros bloquea la neovascularización de la córnea del conejo sobre la que previamente se ha implantado el carcinoma Discusión VX2 El presente estudio ha sido diseñado para valorar la posible eficacia antitumoral de la minociclina sobre un tumor experimental con características. anatomopatológicas de tumor nel.lroectodérmico indiferenciado. La tetraciclina y sus derivados son antibióticos utilizados ampliamente por sus propiedades antimicrobianas,. que al parecer son 180 9 • Recientemente, Weingart y cols. han descrito un efecto antitumoral de la minociclina sobre el gliosarcoma murino 9 L creciendo intracerebralmente en ratas Fischer 344, a condición de que la administración de este fármaco se realice localmente y antes de que la neoplasia tenga un cierto tamaño. A pesar de que estos autores atribuyen el Utilidad de los derivados de la tetraciclina como inhibidores de la angiogénesis tumoral en neoplasias del sistema nervioso ... Neurocirugía sobre el que se realizó nuestro estudio (unos 5 mm. de efecto antitumoral de la minociclina a una inhibición de la diámetro .al iniciar eltratamiento). Con este planteamienangiogénesis, no aportan datos a favor de que se hubiera to, los resultados negativos que hemos obtenido sugieren modificado el patrón de neovascularización en los tumoque el desarrollo de líneas de investigación neuro-oncolóres tratados 14. gicas basadas en un posible efecto antitumoral de los deriEn el presente estudio hemos partido de la hipótesis de vados de la tetraciclina sobre neoplasias indiferenciadas que si la minociclina es capaz de ejercer un efecto antitudel Sistema Nervioso tiene escasa utilidad práctica y por moral sobre tumores del sistema nervioso a través de una otra parte, aún en el caso de que, en determinadas condiinhibición de la angiogénesis, su administración intratuciones experimentales, estos fármacos lograran una modumoral debería modificar el patrón de vascularización, lo que podría ser detectado comparando el número y diámelacióndel crecimiento tumoral, parece dudoso que dicho efecto pueda ser atribuido a una inhibición de la angiogétro de los capilares entre tumores tratados y no tratados. nesis tumoral por cuanto que en los tumores tratados no Por otra parte, la disponibilidad de un tumor experimental parece modificarse significativamente ni el número de cacon características de tumor neuroectodérmico primitivo pilares ni la superficie vascular. nos permitía estudiar el posible efecto antineoplásico de la minociclina sobre dicho tumor, en busca de resultados positivos que nos pudieran llevar a plantear, en su momento, Conclusiones Documento descargado de http://www.revistaneurocirugia.com el 19/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier m su posible utilidad en clínica humana sobre tumores anáComo consecuencia del presente estudio experimental, y logos, tales como el meduloblastoma y potencialmente sode la revisión efectuada acerca de la posible utilidad de debre otros tumores indiferenciados, como los glioblastorivados de la tetraciclina sobre tumores del sistema nerviomas. Los resultados que hemos obtenido señalan que la so, creemos oportuno destacar las siguientes conclusiones: administración intratumoral de minociclina sobre nuestro 1) Existen aportaciones previas de la literatura que modelo de tumor neuroectodérmico indiferenciado, al menos con los parámetros experimentales utilizados, no momuestran un efecto antitumoral de la tetraciclina y sus dedifica el ritmo de crecimiento de esta neoplasia, puesto rivados sobre determinadas neoplasias. Entre los principales mecanismos de acción se ha señalado que estos fármaque al finalizar el periodo de estudio no se apreciaron dicos pueden modular el crecimiento tumoral por medio de ferencias estadísticamente significativas entre ambos gruuna inhibición de la angiogénesis colágeno-dependiente. pos experimentales, tanto en lo que respecta al índice de 2) En el caso de tumores del Sistema Nervioso se ha proliferación celular, medido por el marcaje del antígeno publicado recientemente un estudio experimental sobre el PCNA, como en lo que respecta al volumen tumoral. Al gliosarcoma 9L que señala cómo la administración intraanalizar indirectamente la angiogénesis tumoral, tanto por el número de capilares presentes en el tumor como por su tumoral de minociclina puede modular el crecimiento del tumor, siempre que se administre localmente y antes de superficie relativa, tampoco hemos encontrado diferencias los 5 días tras la implantación intracraneal del gliosarcosignificativas entre los dos grupos experimentales, por lo que debemos concluir que el tratamiento realizado no moma en ratas Fischer 344. 3) La experiencia obtenida con el presente estudio exdifica el patrón de angiogénesis en nuestro tumor. Cabe perimental, consistente en la administración intratumoral plantearse si la administración intralesional de la minocide minociclina, a dosis de 100 mg/día, durante 4 semanas, clina en nuestro modelo experimental hubiera sido eficaz sobre el tumor IL-7, no ha permitido confirmar que esta si se hubiera iniciado el tratamiento en el momento de la forma de tratamiento modifique el crecimiento tumoral ni implantación del tumor y no cuando éste mostró signos de su patrón de vascularización. progresión, dado que en el estudio de Weingart y cols. 14 , el 4) Estos resultados sugieren la escasa aplicación prácefecto antitumoral de la minociclina sobre el gliosarcoma tica de protocolos terapéuticos que traten de modular el 9L sólo se obtuvo cuando el tratamiento se inició antes de crecimiento de tumores indiferenciados del sistema nerlos 5 días tras la inoculación intracerebral del tumor. Opivioso por medio de derivados de la tetraciclina. namos a este respecto que, tratando de encontrar líneas de investigación aplicables a la clínica humana, se debería realizar el estudio sobre tumores ya establecidos y mostranBibliografía do signos de progresión, puesto que esas son las características que muestran habitualmente los tumores a los que 1. Folkrnan, J.: Tumor angiogenesis. In: Holland 1., et al.; nos enfrentamos. Por otra parte, cualquier citorreducción Cancer Medicine, Philadelphia, 1993; págs.: 153-170. quirúrgica difícilmente podría obtener en clínica humana 2. Folkrnan, J.: What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J. Natl. Cancer Inst. 1990; 82: 4-6. y sobre tumores malignos indiferenciados del sistema ner3. Fo1kman, J., K1agsbrun, M.: Angiogenic factors. vioso, una disminución del volumen tumoral lo suficienteScience 1987; 235: 442-447. mente importante como para alcanzar el volumen inicial 181 Utilidad de los derivados de la tetraciclina como inhibidores de la angiogénesis tumoral en neoplasias del sistema nervioso ... Neurocirugía against primary and metastatic disease. Cancer Res. 1992; 4. Folkman, M.J.: Antiangiogenesis. In: De Vita, V.T., 52: 6702-6704. HelIman, S., Rosenberg, S.A. (Eds): Biologic Therapy of 11. Van den Bogert, c., Dontje, B.HJ., Kroon, AM.: Cancer. Philadelphia. J.B. Lippincott, 1991; págs.: 743-753. 5. Guerin, C., Tamargo, RJ., Olivi, A., Brem, H.: Brain Arrest of in vivo growth of a solid Leydig-celI tumor by prolonged inhibition of mitochondrial protein synthesis. Cancer tumor angiogenesis: Drug delivery kand new inhibitors. In Maragoudakis ME (ed): Angiogenesis in Health and Disease, Res. 1983; 43: 2247-2251. 12. Vaquero, J., Oya, S., Coca, S., Zurita, M.: ExperiNew York, Plenum Press, 1992; págs.: 265-273. mental induction of primitive neuroectodermal tumours in 6. Houchens, D.P., Ovejera, AA, Bauker, A.D.: The therapy of human tumors in athymic (nude) mice. In: Houchens rats: A reappraissement of the ENU-model of neurocarcinogenesis. Acta Neurochir (Wien) 1994; 131: 294-301. D.O., and Ovejera, A.A. (eds). Proceedings of the Symposium on the use of athymic (nude) mice in Cancer Research. 13. Weingart, J., Brem, H.: Minocycline, an angiogenesis inhibitor, when delivered interstitialIy acts synergistically Gustav Fischer, New York, 1978; págs.: 267-280. 7. Maragoudakis, M., Sarmonika, M., Panoutsacopoulou, with carmustine (BCNU) to prolong survival in an intracranial 9L gliosarcoma model. Proc. Am. Assoc. Cancer. Res. M.: Antiangiogenic action of heparin plus cortisone is associated with decreased colIagenous protein synthesis in the 1993; 34: 303 (Abstract). 14. 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