La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT)

CARACTERIZACIÓN DE LOS RECEPTORES 5HT5A DURANTE LA ONTOGENIA
DEL SISTEMA NERVIOSO DE LA RATA
Valencia Ojeda C. (1); Berumen L.C. (1); García-Alcocer G. (1); Rodríguez A. (1); Castillo
Ramos N. (1); Escobar Cabrera J.E. (1); Roman Maldonado E.E. (2)
(1) Facultad de Ciencias Químicas / Universidad Autónoma de Querétaro
(2) Unidad Académica de Ciencias Químicas/ Universidad Autónoma de Zacatecas.
RESUMEN
La serotonina (5-HT) es un neurotransmisor que se sintetiza principalmente en los núcleos de
rafe del tronco cerebral y se localiza en el sistema nervioso central. Este neurotransmisor ha
sido relacionado con diversos mecanismos fisiológicos e inhibiciones conductuales en
mamíferos, además en el ser humano se ha demostrado que éste posee efectos en el humor y
el estado mental, siendo estos efectos difíciles de determinar. La gama de efectos que la
serotonina posee puede ser explicada debido a la existencia de hasta 14 subtipos diferentes de
receptores. En este trabajo se analizó el receptor 5-ht5A, uno de los receptores de serotonina
menos estudiados y comprendidos. Para este trabajo se utilizó la corteza cerebral de ratas
embrionarias de 14, 16 y 18 días y ratas post- natales de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 días; se realizó
una electroforesis SDS-PAGE y un “Western Blot”, dando como resultado la banda esperada
correspondiente a la proteína (de aproximadamente 41kDa), además de otras proteínas de
menor peso molecular posiblemente de interés que el anticuerpo identificó como receptores 5ht5A.
INTRODUCCIÓN
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) regula una gran variedad de funciones sensoriales,
motoras y las funciones de comportamiento en el sistema nervioso central de mamíferos. Este
neurotransmisor es sintetizado por las neuronas de los núcleos del rafe del tronco cerebral que
se proyectan en todo el sistema nervioso central, con la mayor densidad en los ganglios
basales y las estructuras límbicas (Steinbusch, 1984). La serotonina presenta una gran
diversidad de efectos que son mediados por su unión a diversos receptores específicos de
membrana. Tanto la serotonina como sus receptores están presentes en el sistema nervioso
central y en el sistema nervioso periférico, así como en numerosos tejidos no neuronales del
intestino, sistema cardiovascular y células sanguíneas (Iceta, 2008). Hasta el momento, se han
identificado hasta siete miembros dentro de la familia de receptores de serotonina (5-HT1 a 5HT7) y diversos subtipos incluidos algunos de estos miembros. Ello ha conducido a la
descripción y consideración de un total de hasta 14 tipos distintos (Hoyer y Martin, 1997).
El neurotransmisor 5-HT también ha sido implicado en tener un papel en la fisiopatología de
los trastornos como la depresión, la ansiedad, la esquizofrenia y el trastorno obsesivocompulsivo. Un amplio espectro de acciones pueden ser explicadas por la existencia de los
diferentes subtipos de receptores 5-HT con localizaciones y funciones distintas dentro del
sistema nervioso central (Barnes y Sharp, 1999). Farmacológica y funcionalmente, hay una
mayor comprensión de las familias de receptores 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, y 5-HT4 que de los
subtipos 5-HT5, 5-HT6 y 5-HT7. Las familias de receptores 5-HT son receptores acoplados a
proteínas G a excepción de 5-HT3 que actúa a través de mecanismos de canales iónicos. La
familia 5-HT5, más relacionados con los receptores 5-HT1D comprende a los receptores 5-ht5A
y receptores 5-ht5B. Estudios sobre la localización del RNA mensajero, principalmente en el
cerebro humano, y de forma limitada en el cerebro de rata, han mostrado una amplia
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distribución central de estos subtipos (Kinsey y col., 2001), a pesar de ello los receptores 5HT5 son probablemente los menos estudiados de todos los receptores de serotonina y existen
pocos estudios realizados acerca de la respuesta fisiológica y el sitio especifico de unión de
éstos receptores (Iceta, 2008).
METODOLOGÍA
Preparación de muestras
Ratas Sprague Dawley embrionarias de 14, 16 y 18 días (correspondiente a tres camadas) y
ratas post- natales de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 días (correspondiente a 3 ratas macho por muestra)
fueron sedadas con anestésico comercial y decapitadas para la disección y obtención de su
corteza cerebral. La corteza obtenida fue homogenizada con buffer de extracción Tris (5OmM
pH 7.4) en presencia de inhibidores de proteasas, todo eso se realizó en un baño de hielo para
evitar la destrucción de la proteína.
Para la electroforesis a las muestras se les adicionó amortiguador de muestra según la
cantidad de proteína presente, se hirvieron 5 minutos y centrifugaron.
Electroforesis
Se realizó una electroforesis SDS-PAGE con geles de acrilamida (gel separador al 10% y gel
concentrador al 4%), se utilizaron peines de 1 mm de grosor y 15 pozos. Se cargaron 15µL de
la solución de proteína y amortiguador por pozo en el siguiente orden: embrionarias (E) de 14,
16 y 18 días, ratas post- natales (P) de 0, 7, 12, 21, 60 y 120 días y 15µL de marcador de peso
(PM). Una vez cargados los geles , se colocaron en la cámara de electroforesis con buffer de
electrodo 1X y se corrieron a 100V durante 10 minutos para alcanzar el gel separador y a
150V durante 50 minutos.
Transferencia (Western Blot)
Los geles se equilibraron en el amortiguador de transferencia durante 15 minutos. En un
recipiente diferente, se equilibraron 2 membranas, 4 papeles filtro y 4 fibras; en este
recipiente se armó el cassette de transferencia colocando el lado negro del cassette, una fibra,
un papel filtro, el gel, la membrana, un papel filtro, una fibra, lado blanco del casette,
teniendo especial cuidado en evitar la formación de burbujas y la contaminación de la
membrana, el cassette se cerró y se colocó en la cámara de trasferencia ubicando la base del
cassette negro hacia la parte negra y la blanca hacia la roja. Se colocó un agitador magnético y
un recipiente con hielo dentro de la cámara y se llenó con buffer de transferencia. Se corrió a
200mA durante una hora sobre un agitador magnético para homogenizar la temperatura.
Una vez terminada la corrida se sacó el cassette y se retiró la fibra y el papel filtro, además se
marcaron las orillas del gel para poder localizarlo en la membrana así como el flujo de
electrones. Las membranas se lavaron 3 veces con PBS 1X durante 10 minutos en un
recipiente con tapa y en agitación, después de los lavados se bloqueó la membrana con suero
de leche al 3% preparado en PBS por 1 hora; trascurrido el tiempo se retiró la solución de
leche y se realizaron 3 lavados con PBS, igualmente en agitación constante, una vez
terminados los lavados se incubó la membrana con el primer anticuerpo de conejo 5HT5A
SEROT (5µL de anticuerpo en 20mL de PBT) durante toda la noche. Por la mañana se
recuperó el anticuerpo y la membrana se lavó 3 veces con PBT durante 10 minutos, después
de los lavados se procedió a colocar el segundo anticuerpo (7µL de anticuerpo Conjugado
cabra Anti-conejo HRP en 20mL de PBT) durante dos horas; transcurridas las 2 horas se
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recuperó el segundo anticuerpo y la membrana fue lavada 2 veces con PBT por diez minutos
y 2 veces mas con PBS. Terminados los lavados se procedió a revelar.
El revelado fue realizado en un cuarto completamente oscuro para evitar el velado de las
placas. La membrana se incubó en ECL durante un minuto y se colocó en una bolsa de
plástico cuidando que no hubiera burbujas que interfirieran. Las luces se apagaron y se colocó
la placa fotográfica sobre la bolsa, se expuso durante 10 segundos cuidando no mover la placa
al colocarla la primera vez debido a la intensidad de la exposición. Una vez expuesta se pasó
al líquido revelador durante un minuto, al agua durante un minuto y al líquido fijador durante
un minuto más, una vez terminada la secuencia se paso a un recipiente de agua y se
encendieron las luces para observar resultados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Posterior al revelado se observó la banda más densa alrededor de los 38kDa, correspondiente
al peso correspondiente para 5-ht5A de alrededor 41kDa, además se observaron diversas
bandas de menor peso molecular que resultan ser de interés (Figura 1).
Figura 1. Bandas inmuno reactivas para receptor a serotonina, se indica con A la línea de
bandas con mayor densidad correspondientes a 5-ht5A. Se muestran otras bandas de interés
(B). Edades embriones de 14 días (E14), 16 días (E16), 18 días (E18), ratas recién nacidas
(P0), ratas de 7 días (P7), de 12 días (P12), de 21 días (P21), de 60 días (P60), de 120 días
(P120)
Se observa que las bandas correspondientes a los embriones presentan una menor densidad y
no existe un aumento significativo de los receptores durante esta etapa. Mientras en los postnatales de 0, 7 y 12 días se observa una mayor cantidad de receptores respecto a los
encontrados en las ratas embrionarias así, además se observa una disminución de los
receptores a partir del día 21 hasta el día 120 donde la concentración es mucho menor a la
mostrada en el día 0. En cuanto a las bandas de interés, se cree que pueden ser resultado de
otra forma de la proteína (splicing) con un menor peso molecular. Cabe destacar, además que
la aparición de una segunda banda de menor peso molecular a las señaladas como posibles
splicing coincide con el comienzo de la disminución de la banda originalmente estudiada (5ht5A) lo que podría sugerir una perdida de maquinaria para la producción de receptores ya que
al no haber información sobre este tipo de receptor no es posible concluir si las bandas
encontradas resultan ser proteínas funcionales, splicing alternativos o residuos de receptores.
CONCLUSIÓN
La comprensión de los diferentes tipos de receptores a serotonina es fundamental para poder
explicar la regulación de los diferentes sistemas y comportamientos a los que da lugar y poder
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así poder dar un tratamiento clave a algunos trastornos dependientes a la serotonina. En este
trabajo se encontró información sobre el desarrollo de los receptores durante la ontogenia de
la rata, así como la posible existencia de diferentes formas del receptor basados en la idea de
la selectividad del anticuerpo; sin embargo es necesaria la realización de mas estudios
referentes a este receptor para poder afirmar o negar lo antes dicho y para una mejor
comprensión del mecanismo con el que actúa.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Barnes, N.M., Sharp, T., “A review of central 5-HT receptors and their function.”
Neuropharmacology. 38 (8), 1083–1152. 1999
Hoyer, D., Martin G. R., “5-HT receptor classification and nomenclature: towards a
harmonization with the human genome”. Neuropharmacol., 36 (4-5): 419-28. 1997
Iceta-Echave, R. “Caracterización del transportador de serotonina humano en celulas CACO2: Estudio de los mecanismos de regulación fisiológica” Tesis de Doctorado, Universidad de
Zaragoza, España, 2008
Kinsey A. M., Wainwright A., Heavens R., Sirinathsinghji D.J.S, Oliver K. R., “Distribution
of 5-ht5A, 5-ht5B , 5-ht6 and 5-HT6 receptor mRNAs in the rat brain”, Molecular Brain
Research. 88, 194–198, 2001
Steinbusch, H. “Win Handbook of Chemical Neuroanatomy: Classical Transmitters and
Transmitter Receptors in the CNS”, Elsevier, Amsterdam, 1984
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