SPANISH NATIONAL RESEARCH COUNCIL (CSIC) Detección por RT-PCR múltiple de la respuesta inflamatoria dependiente e independiente de interferón El CSIC ha diseñado una RT-PCR múltiple para la detección de la activación no específica de genes relacionados con la inflamación, dependientes e independientes de interferón, cuando se transforman las células con RNA o con oligodesoxinucléotidos (ODN) fosforotioatos para lograr el silenciamiento genético. La concentración de Mg+2, temperatura de alineación, número de ciclos, diseño de cebadores y cantidades relativas de cada una de las 5 parejas de los mismos se han optimizado para permitir la detección de esta activación en diferentes tipos celulares transformados con diferentes RNAs u ODN. Se buscan compañías interesadas en una licencia de patente Nueva herramienta útil en los estudios de silenciamiento genético La introducción en las células de algunos RNA o de oligonucleótidos fosforotioatos para inhibir la expresión de genes específicos con fines experimentales o terapéuticos puede provocar una respuesta inflamatoria inespecífica que condiciona y puede llegar a hacer inviable las aplicaciones deseadas. El CSIC ha desarrollado una RT-PCR múltiple para la detección simultánea de la expresión de 3 genes de la respuesta a interferón (OAS2, ISG56 e IFNα ó IFNβ) y del gen de la citoquina proinflamatoria IL-8 (independiente de interferón), así como de un control (GAPDH) en condiciones no convencionales, optimizadas respecto a la concentración de Mg+2, temperatura de alineación, número de ciclos, diseño de cebadores y cantidades relativas de cada una de las 5 parejas de los mismos. Esta RT-PCR múltiple es eficaz para determinar en una única reacción, si se activa la respuesta inflamatoria y si esta es dependiente de interferón o no con diferentes líneas celulares (derivadas de linfocitos, glias, y células renales) y con distintos tipos de ácidos nucleicos (ssRNA, dsRNA sintético poli I:C, siRNA) y un oligonucleótido fosforotioato (ODN2006). 1 2 3 4 5 OAS2 IFNα IL-8 GAPDH ISG56 Resultados obtenidos por mRTPCR en muestras de RNA de la línea celular 293T. Carril 1, sin transfectar (control). Carril 2, transfectada con ssRNA. Carril 3, transfectada con dsRNA. Carril 4, expresando establemente TLR9 (Control). Carril 5, expresando establemente TLR9, estimulada con OD2006. Principales aplicaciones y ventajas • • • Permite determinar simultáneamente la respuesta a interferón y la respuesta inflamatoria no dependiente de interferón. Estado de la patente Al estar basado en una RT-PCR múltiple, se determina simultáneamente la expresión de 5 genes en una única reacción, lo que hace que sea un método sencillo, rápido, seguro, sensible, reproducible y económico. Para más información: Requiere una menor manipulación de las muestras por lo que disminuye los errores de manipulación y el riesgo de contaminaciones. Solicitud de patente española Iratxe Cano, Ph.D. Área de Ciencias de la Vida Vicepresidencia Adjunta de Transferencia de Conocimiento Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Tel.: + 34 – 958181600 ext 177 E-mail: iratxe.cano@eez.csic.es