GENOMAS: Información biológica necesaria para construir y

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GENOMAS: Información biológica necesaria
para construir y mantener un organismo
Flujo de
información
Genoma
Transcriptoma
ARN : copia de genes que
codifican proteínas
Proteoma
Repertorio de
proteínas celulares
1
ADN: Molécula portadora de la Información Biológica
¾ 1865
Mendel : GenesÆ factores particulados
¾ 1869
Miescher : Descubrimiento del Ácidos Nucleicos
¾ 1903
Sutton, Bovery : Teoría Cromosómica: cromosomas unidades
hereditarias (factores hereditarios en cromosomas)
¾ 1911
Morgan: Teoría cromosómica de la herencia
¾ 1944
Avery, Mac Leod, Mc Carty : ADN material genético de
bacterias
Hershey y Chase: ADN material genético de bacteriófagos
2
3
UNIDAD BÁSICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
4
¾1953
Watson y Crick: Modelo de doble hélice del ADN
-Datos de Difracción de rayos X Æ naturaleza helicoidal del ADN
(Rosalind Franklin y Wilkins)
-Densidad del ADN
-Proporción de G=C y A=T (Chargaff)
- Doble Hélice (enrollamiento a la derecha)
-Polinucleótidos unidos por puentes H entre bases (Uniones
permitidas: A-T y G-C)
- 2 cadenas de polinucleótidos interaccionan en direcciones
opuestas Æ Antiparalelas
- Esqueleto de azúcar y fosfatos hacia el exterior Æcargas negativas
- Bases en el interior: interacciones hidrofóbicas
5
6
7
8
•bp = par de bases ( bp corresponde aprox a 3.4 Å)
•kb (= kbp) = kilo par de bases = 1,000 bp
•Mb = mega par de bases = 1,000,000 bp
•Gb = giga par de bases = 1,000,000,000 bp
9
Tm
50% del ADN
desnaturalizado
Tm genomas entre 85-95ºC
Depende del contenido de GC del genoma
10
ARN
•
•
•
Unidades: ribonucleótidos
Bases: adenina, citosina, guanina y uracilo
En general: un único polipéptido
Uniones fosfodiester 3’-5’ del ARN
menos estables por efecto
indirecto del OH en la posición 2’
del azúcar
11
Contenido de ARN en las células
12
Procesamiento de precursores de ARN
-Modificaciones de los extremos (ARNm eucariotas: CAP y polyA)
- Corte y empalme: eliminación de segmentos internos del ARNm que no
contienen información biológica.
- Eventos de clivaje: procesamiento de ARNr y ARNt
-Modificaciones químicas de las bases (ARNr, ARNt y ARNm): agregado
de grupos químicos a nucleótidos específicos
13
Tipos de ARN
•ARNt
-50-85 nt
-Estructura secundaria y
terciaria conservada
-Bases inusuales
•ARN ribosomal
•ARN mensajero
•Pequeños ARN citoplasmáticos y nucleares
14
Contenido de DNA de genomas haploides (Valor C) y complejidad
Valor C: Cantidad total de ADN en el genoma haploide
15
Tamaños mínimos de
genomas
16
CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN DEL DNA
Renaturalización del DNA: apareamiento de bases complementarias
ƒDepende de :
ƒ La concentración del DNA
ƒ la temperatura de reasociación
ƒ la concentración de sales.
ƒLa velocidad de renaturalización de secuencias de DNA en solución depende del
encuentro al azar de las cadenas complementarias.
ƒLa velocidad de reasociación de una secuencia en particular es proporcional al
número de veces que se encuentra presente
17
•
Co = concentración de DNAsc al inicio de la reacción de reasociación
(moles de nucleótido/litro)
•
t = tiempo de reasociación (medido en segundos)
•
C/Co = cantidad de DNA sc remanente.
•
k = constante de la velocidad de reasociación.
1
C/Co =
1 + k Cot
Describe la cinética de reasociación del DNA
•Cuando el 50% del DNA está reasociado (C/Co =1/2):
Cot 1/2 =
1/k
18
METODOLOGÍA
•
A) DNA fraccionado en fragmentos de aprox. 450pb (por sonicación)
•
B) El DNA se alicuota en tubos con una concentración determinada de DNA
•
C) Desnaturalización del DNA
•
D) Reasociación del DNA a distintos tiempos. (se colocan los tubos en un
baño de agua a una temperatura adecuada, por ejemplo Tm-25ºC).
•
E) Calculo del % del DNAsc remanente para cada valor de Cot.
•
F) Se grafica el % de DNAsc remanente en función del valor de Cot
(logaritmo)
Æ Curva Cot
19
La velocidad de reasociación es inversamente
proporcional al largo del ADN con secuencia diferente
Complejidad cinética
20
Tamaño de genomas/Complejidad de genomas
El valor de Cot ½ aumenta con la complejidad del genoma
COMPLEJIDAD Largo total de secuencias diferentes
Complejidad del genoma de E.coli = 4 x 106
Cot ½ genoma X
Cot ½ E.coli
=
Complejidad genoma X
4 x 106
21
Curva Cot
genoma eucariota
Cot ½ E.coli= 4
Complejidad E.coli= 4,2 x 106
Genoma total: 6,7 x 108
ƒcomponente lento: 3 x 10 8
ƒcomponente intermedio: 2 x 10 8
ƒcomponente rápido: 1,7 x 10 8
22
•La velocidad de reasociación de una secuencia de DNA es
directamente proporcional al número de veces que ocurre en el
genoma.
•Secuencias repetitivas reasocian con valores de Cot menores que
secuencias de copia única.
•En los genomas eucariotas la complejidad del componente lento
puede servir para estimar el tamaño del genoma
23
• Mediante el análisis de la curva Cot se puede
determinar:
• El tamaño del genoma
• La proporción relativa de secuencias de copia única y
secuencias repetitivas
• La fracción del genoma que representa cada
componente
• La complejidad media de las secuencias de cada
componente.
24
ƒ 1er componente :
Complejidad 2000pb (1 especie
de ARN)
ƒ2ndo componente:
Complejidad 15kb (7 a 8 tipos
distintos de ARNm)
ƒ3er componente: complejidad
26Mb (13000 ARNm distintos)
25
Desnaturalización de los distintos componentes
del genoma
Componente no repetitivo: curva de desnaturalización similar al
genoma total (Tm similar)
Componente repetitivo: curva de desnaturalización muy
extendida (componentes con distintos Tm)
Secuencias apareadas no idénticas
La modificación de las condiciones de
reasociación (cambio en la
rigurosidad) puede determinar un cambio en la proporción de los distintos
componentes
26
Proporción de los distintos
componentes en los
genomas eucariotas
(altamente repetitivo, repetitivo, no repetitivo)
Species
Sequence Distribution
Bacteria
99.7% Single Copy
Mouse
60% Single Copy
25% Middle Repetitive
10% Highly Repetitive
Human
70% Single Copy
13% Middle Repetitive
8% Highly Repetitive
Cotton
61% Single Copy
27% Middle Repetitive
8% Highly Repetitive
Corn
30% Single Copy
40% Middle Repetitive
20% Highly Repetitive
Wheat
10% Single Copy
83% Middle Repetitive
4% Highly Repetitive
55% Single Copy
Arabidopsis 27% Middle Repetitive
10% Highly Repetitive
Máximo contenido de ADN no repetitivo: 2 x 109 pb
27
28
DNA altamente repetitivo
Repeticiones en tandem
ORIGEN
ƒErrores en la replicación
ƒRecombinación desigual
– DNA satélite:
• secuencias de DNA cortas repetidas en la
misma orientación sin secuencias
intermedias
• 5-200pb
• Alrededor del centrómero
– Ej: DNA alfoide (centrómero humano)
unidades de 171pb (ricas en AT)
29
– Minisatélites (VNTR)
• Unidades repetidas de hasta 25pb
• Segmentos de DNA de hasta 20kb
• Ej: telómeros (humano TTAGGG aprox 100copias)
– Microsatélites (SSR)
• Unidades repetidas < 13pb (1, 2, 3 o 4pb repetidas 10-20 veces)
• Segmentos de DNA < 150pb
• Polimórficos Æ número de repeticiones variables en distintos
miembros de una sp (perfil genético)
Trinucleótidos (CAG, CCG): tipo de microsatélites relacionados
con enfermedades genéticas (X Fragil, Huntington, distrofia
miotónica)
30
Perfil Genético
31
DNA altamente o
moderadamente repetitivo
Repeticiones dispersas
– Retrotransposones
• LINES -> LINE-1 (genoma humano) 6.1kpb, 516.000copias
• SINES-> <300pb Alu (humano) 1 x 106 copias
– Transposones
32
DNA moderadamente repetitivo
• Genes rRNA
– E.coli Æ
• 7 copias dispersas
– EucariotasÆ
• >100copias
• Grupos de copias repetidas en
tandem
• Ej: genoma humanoÆ
– 5 grupos en 5 cromosomas
– 150 a 200 copias
– Polimórfico
33
• 5s rRNA
• tRNA
• Sc RNA
• Ej 7SL RNA : 3copias + >100 pseudogenes
• Sn RNA
• Familias multigénicas
•
•
•
•
•
Globina (cluster)
Histona (dispersas)
Tubulina
Actina
Inmunoglobulinas
34
35
36
Species
Tamaño de Genomas
con secuencia completa
o borrador publicada
Eukaryotes
Arabidopsis thaliana
(plant)
Caenorhabditis elegans
(nematode worm)
Drosophila melanogaster
(fruit fly)
Homo sapiens (human)
Saccharomyces cerevisiae
(yeast)
Bacteria
Escherichia coli K12
Mycobacterium
tuberculosis H37Rv
Mycoplasma genitalium
Pseudomonas aeruginosa
PA01
Streptococcus pneumoniae
Vibrio cholerae El Tor
N16961
Yersinia pestis CO92
Archaea
Archaeoglobus fulgidus
Methanococcus jannaschii
Size of
Approximate
genome (Mb) number of genes
References
125
25 500
AGI (2000)
97
19 000
CESC (1998)
180
13 600
Adams et al. (2000)
3200
30 000 40 000
12.1
5800
IHGSC (2001);
Venter et al. (2001)
Goffeau et al. (1996)
4.64
4.41
4400
4000
Blattner et al. (1997)
Cole et al. (1998)
0.58
6.26
500
5700
Fraser et al. (1995)
Stover et al. (2000)
2.16
4.03
2300
4000
4.65
4100
Tettelin et al. (2001)
Heidelberg et al.
(2000)
Parkhill et al. (2001)
2.18
1.66
2500
1750
Klenk et al. (1997)
Bult et al. (1996)
37
38
Organización
genética
39
Segmento del genoma humano
40
41
42
43
Genes interrumpidos en eucariotas
44
Tamaño de genes en levaduras, insectos y mamíferos.
45
Mamíferos
Levaduras
46
Largo de exones e intrones
47
Gen humano promedio: 27kb con 9 exones
48
Estructura y anatomía de los genomas
Bacterias
Procariotas
- < 5x106pb
- Molécula única de DNAcirc
Archae
- 1x107pb – 1x 1012pb
Nuclear
Eucariotas
- 2 o + moléculas de DNA linear
Genoma
Organelas
-DNA circular
-Múltiples copias
49
Estructura
Genoma Procariota
Estructura
Genoma Eucariota
• Organización compacta (poco
espacio entre genes)
• Genoma compuesto por 2 o
más moléculas de ADN linear
(cromosomas)
•Información adicional en plásmidos
• DNA no codificante en pequeños
segmentos dispersos en el genoma
(<11%)
• No hay intrones
• Organización menos compacta
• DNA repetitivo (disperso y en
tandem)
• Intrones
• Organización en operones (E.coli
aprox 600 operones con 2 o más
genes)
50
Genoma de Organelas
•
Herencia “no medeliana”, segregación somática
•
Origen endosimbiótico
•
Moléculas de DNA circular, en general
•
Número de copias por organela elevado (10- 100)
•
Tamaño variable
– Mitocondrias: 16,5kb mamífero – 366kb en plantas (2400 kb en algunas plantas)
– Cloroplastos: 100-200kb
•
Contenido genético
– Proteínas involucradas en procesos de la organela
– RNA ribosomales y de transferencia
•
Acumulación de mutaciones diferente a DNA genómico
– En mamíferos tasa de mutación mayor, en plantas menor.
51
• Genoma mitocondria
•Genoma cloroplastos
– Tamaño variable
• Mamíferos 16,5 kb
• Levaduras 84kb
• Plantas superiores: de
100 a 2400kb (Maiz 570kb)
– 5 a 90 genes (37 genes en
•100- 200kb
•Aprox 200genes
•20 a 40 copias/ organela
•20 a 40 organelas /célula
•Intrones
mamíferos)
– Intrones
– Sec.intergénica
– Duplicaciones
– Círculos subgenómicos
52
Comparación del genoma mitocondrial de levadura y
mamífero
Mamífero
ƒ16kb Extremadamente compacto
ƒSin Intrones
ƒAlgunos genes superpuestos
ƒ13 genes codifican proteínas (cad
respiratoria)
Levadura
ƒ84kb
ƒIntrones
53
Genoma mitocondria (levadura)
54
Genoma cloroplasto (arroz)
Cloroplasto
ƒ120-190kb
ƒ Intrones
ƒ87-183 genes
ƒ4 RNA rib
ƒ30-32 ARNt
ƒ genes codifican proteínas aprox 50
ƒProt ribosomales
ƒRNA polimerasa
ƒFotosíntesis
55
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