genética Identificación genética de componentes biológicos en alimentos El trabajo presentado corresponde a una nueva línea de investigación puesta en marcha por AZTI, financiado por el Dpto. de Agricultura y Pesca del Gobierno de Vasco, con la creación de un nuevo laboratorio de genética, ante la demanda existente para este tipo de estudios, que permiten identificar los productos pesqueros y alimenticios una vez procesados y evitar el fraude en el etiquetado. Los análisis genéticos se han revelado los últimos años como una poderosa herramienta que es capaz, no sólo de identificar especies, sino incluso de caracterizar poblaciones de la misma especie, variedades y razas. Estas técnicas se basan en el análisis del ácido desoxirribonucleico (ADN) que se utiliza como marcador molecular MIGUEL ANGEL PARDO GONZÁLEZ (AZTI) TESTUA: as necesidades de control de calidad de los alimentos exigen en muchas ocasiones verificar la identidad genética de sus componentes. Si bien esta identificación no suele revestir problemas cuando se trata de alimentos frescos, resulta cada vez más complicada conforme aumenta el grado de procesamiento de los alimentos. En principio, la morfología o la composición química de un organismo pueden permitir su identificación a nivel de especie e incluso al nivel de raza o variedad. Sin embargo, cuando se trata de alimentos procesados o que contienen mezclas de distintos componentes biológicos, la molécula de ADN (ácido desoxiribunucleico) es la que presenta mayor estabilidad y la que contiene mayor cantidad de información para determinar la especie e incluso la variedad a la que pertenece cada componente alimentario. Cuando el procesamiento del alimento ha elimina- L do cualquier traza de ADN de sus componentes biológicos su identificación se hace prácticamente imposible. Para poder llevar a cabo esta tarea es necesario tener cierto conocimiento de la estructura genómica de muchas especies así como del nivel de variabilidad nucleotídica en distintas regiones genómicas. Además hay que desarrollar distintas aplicaciones de la PCR (Polymerase Chain Reaction) para poder analizar la variación genética y de este modo, poder solucionar los problemas de identificación que puede requerir la industria alimentaria. Los problemas a resolver van desde la autentificación de especies y variedades para detectar fraudes por sustitución de componentes a la detección de componentes no declarados en la composición del alimento. ¿Cómo es la estructura del ADN y su organización en el genoma? El ADN es una macrómolécula muy larga de aspecto filamentoso y formada por un gran número de desoxiribonucleótidos, ca- da uno de ellos compuesto por una base nitrogenada (adenina, guanina, timina y citosina), un azúcar y un grupo fosfato. Las bases de las moléculas del ADN son las portadoras de la información genética, en tanto que los grupos de azúcares y fosfato tienen un papel estructural. Esta macromolécula presenta una estructura tridimensional de doble hélice cuyo aspecto más importante es la especificidad del emparejamiento de las bases situadas en el interior de la misma. La función del ADN es la de almacenar la información genética en la célula. Esta información se almacena en lo que se denomina gen (la unidad genética fundamental) y que junto a la proteína (unidad bioquímica compuesta de aminoácidos) conforman los dos pilares fundamentales de los seres vivos. La proteínas son los ladrillos fundamentales que dan forma a las células y que ejecutan las reacciones biológicas, mientras que los genes son las instrucciones que permiten a las células cons- FIGURA 1. BASES NITROGENADAS DEL ADN FIG. 2. ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL ADN El código genético es la relación entre la secuencia de millones de bases en el ADN y la secuencia de aminoácidos en las proteínas, deduciéndose que cada aminoácido se traduce leyendo un triplete de bases (codon). Finalmente, se puede generalizar diciendo que un gen codifica una proteína, siempre y cuando consideremos que la mayoría de los genes eucariotas son discontinuos. Esto quiere decir que las secuencias que codifican proteínas (exones) están embebidas en un mar de secuencias espaciadoras no codificantes (intrones), por lo que no toda la información contenida en el ADN se traduce a proteínas (en mamíferos solo un 4% de los genes codifican proteínas). sustrai 69 truir las proteínas y transmitir la información hereditaria de generación en generación. La manera que tiene la célula de relacionar ambas unidades fundamentales es mediante lo que se denomina como código genético. Hasta ahora hemos visto que la información genética de la célula se almacena en forma de ADN en la célula, pero ¿cómo se estructura la información en el genoma?. Estudiemos, por ejemplo, el genoma humano que contiene 3000 millones de bases. Todo ADN eucariota contiene un 10% de ADN satélite que son millones de repeticiones de secuencias de unas 300 pb, un 20% de lo que se denomina como fracción intermedia que son secuencias repetidas entre cien y mil veces, y un 70% de la fracción lenta que esta muy poco repetida. Haciendo un balance, aproximadamente un 30% son secuencias repetitivas. Esta gran cantidad de secuencias repetitivas no codificantes dentro del genoma hacen que el ADN sea una herramienta másMA útil que las proteínas a la hora de encontrar marcadores moleculares que nos sirvan como herramienta para identificar el origen de los componentes biológicos en los alimentos o en cualquier otra muestra biológica. ¿Qué son los marcadores moleculares? Los marcadores moleculares son biomoléculas que se pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que se pueden relacionar son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el ADN (genes conocidos, fragmentos de secuencia y función desconocida). Los primeros marcadores fueron desarrollados en los 70 y se basaron en la identificación de proteínas e isoenzimas por electroforesis. Pero esta técnica no es suficientemente polimórfica para diferenciar variedades o especies próximas debido a que las proteínas son el resultado de la expresión génica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, 70 sustrai.64 de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una época del año a otra. Los avances de la tecnología del ADN recombinante han permitido desarrollar marcadores moleculares basados en el ADN que son los que presentan mayor estabilidad y contienen mayor cantidad de información para determinar la especie e incluso la variedad a la que pertenece cada componente alimentario. Un marcador molecular puede ser monomórfico que es invariable en todos los organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimática, estructura o sitios de restricción se dice que es polimórfico. Cuando el marcador presenta un gran número de polimorfismos se dice que es hipervariable. En los últimos años se han descrito muchas regiones de interés como marcadores. De entre todas ellas se puede destacar el gen citocromo b mitocondrial que ha sido muy utilizado en la identificación de componentes biológicos en alimentos. Este gen se encuentra en el genoma mitocondrial. Las celulas eucariotas presentan unos orgánulos denominados mitocondrias que son los encargados de generar energía. Estos orgánulos tienen un genoma propio que presenta unas características especiales que le hacen muy interesante a la hora de ser utilizado en la identificación de especies. Estas características son su alto número de copias, su alta tasa de mutación y la ausencia de recombinación genética (ya que se hereda vía materna). ¿Para que se utiliza la técnica PCR (polimerase chain reaction)? Una vez seleccionado el marcador genético adecuado se debe de aislar de entre todo el genoma para su posterior análisis. Para ello se utiliza la técnica denominada reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando el investigador Kary Mullis concibió su idea en 1983 revolucionó las técnicas en biología molecular que existían hasta entonces. Básicamente, se le ocurrió una sencilla forma para empezar y parar la acción de un enzima polimerasa (cataliza la reparación y formación de ácidos nucleicos en la célula) y en consecuencia una manera de amplificar y seleccionar una secuencia de ADN exponencialmente (millones de veces) de entre todo el genoma. Una vez tengamos el marcador amplificado se analizan los polimorfismos que presenta mediante técnicas genéticas. Para poder llevar a cabo esta tarea existen una gran variedad de técnicas que nos permiten analizar los marcadores genéticos. Una de las más utilizada es la técnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que consiste en una digestión con enzimas de restricción (tijeras biológicas) de los marcadores genéticos amplificados por PCR y posterior análisis en geles electroforéticos que separan a los fragmentos de ADN según su tamaño. De este modo se obtienen diferentes patrones de bandas que se corresponden con una especie concreta. Autentificación de túnidos en conserva: una necesidad compartida de la industria y los consumidores Como ya se ha comentado, la identificación de especies de interés comercial está tomando mucha importancia en la industria agroalimentaria para evitar fraudes en el etiquetado de productos procesados. AZTI está desarrollando varios proyectos de investigación orientados a la identificación de la especie de origen en productos marinos. Se ha estimado que en el mundo se comercializan cerca de veinticinco mil especies de productos marinos que carecen de control en cuanto a su denominación exacta de origen, lo que presta a un etiquetado fraudulento. FIGURA 3. ESQUEMA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA La técnica PCR consiste en una desnaturalización de las dos hebras del ADN, seguida de la unión específica de unos cebadores a las hebras de ADN sobre la que actúa la polimerasa y una fase final de elongación en la que el enzima alarga la hebra obteniéndose una copia idéntica a la original. Todo esto es un ciclo que se repite entre 30 y 40 veces, de este modo la amplificación del fragmento deseado es exponencial. Esta técnica tiene una serie de características que delatan su amplia expansión en los últimos 15 años: es versátil (aplicable a la medicina forense, investigación bioquímica, industria alimentaria, etc...), barata, rápida (en unas horas se pueden llegar a amplificar un fragmento millones de veces) y no requiere un ADN molde puro (de hecho puede utilizarse incluso ADN fósil altamente degrada- La identificación de especies de interés comercial está tomando mucha importancia en la industria agroalimentaria para evitar fraudes. FIGURA 4. ESPECIES DE TÚNIDOS CON MAYOR INTERÉS COMERCIAL En este contexto, las conservas de túnidos tienen una gran importancia en cuanto al volumen de ventas y su importancia económica en el sector de la alimentación. Además, en los últimos años se ha extendido la comercialización de productos de alto valor añadido susceptibles de fraude. Atendiendo a la regulación europea 1536/92 el término "atún blanco" incluye exclusi- vamente a la especie Thunnus alalunga. Por lo tanto, aquellos productos que se comercialicen con esta denominación, o la más popular en la CAPV "bonito del norte", deben de proceder de esta especie y no de ninguna otra. La denominación "atún claro" debe ser incluida en aquellos productos que contengan únicamente Thunnus albacares, conocido vulgarmente como ‘yellow- fin’ o ‘rabil’. Por último, dentro de la denominación de "atún" se puede incluir cualquier especie perteneciente al género Thunnus o especies afines como Katsuwonus pelamis (listado). El tratamiento térmico al que se somete una conserva es tan fuerte que incluso el ADN se encuentra altamente degradado. Este hecho es un problema a la hora de poder autentificar por técnicas genéticas este tipo de productos ya que los fragmentos que se obtienen no son mayores de 200 pb (pares de bases). Esto dificulta enormemente el encontrar un marcador suficientemente polimórfico como para poder ser usado en la identificación de especies afines filogenéticamente, como en el caso de las especies del género Thunnus. En este trabajo hemos amplificado un fragmento del gen del citocromo b mitocondrial de 276 pb mediante la técnica Nested Primer PCR. Este fragmento obtenido es suficientemente polimórfico y grande como para desarrollar un método de identificación de especies de túnidos en conservas por PCR-RFLP, que pueda detectar fraudes de manera sencilla y rápida que beneficien al consumidor y a la industria conservera. Actualmente se está analizando el ADN mitocondrial de más de do). Sin embargo, presenta los inconvenientes de conocer parte de la secuencia a amplificar y además de tener en cuenta muchas variables como la concentración de los sustratos de la reacción, la temperatura, la presencia de inhibidores, el número de ciclos, la especificidad de los cebadores que franquean la secuencia a amplificar, etc... La técnica Nested Primer PCR es una modificación de la PCR y consiste en dos amplificaciones secuenciales utilizando dos pares de cebadores. En la primera reacción se obtienen un fragmento que es utilizado como ADN molde de una segunda reacción de amplificación. En esta segunda reacción se utilizan dos cebadores internos que nos permiten obtener un fragmento interno que es el que finalmente se utiliza como marcador molecular. De este modo se aumenta mucho la especificidad de la reacción y el rendimiento final de la misma es mayor. Además se evitan efectos inhibitorios en la reacción de PCR, algo muy habitual en los alimentos. diez especies comerciales de gádidos (bacalaos) para desarrollar un método de identificación de estas especies en fresco y en alimentos procesados. Agradecimientos Este trabajo ha sido subvencionado por el Dpto. de Agricultura y Pesca del Gobierno Vasco. Bibliografía Bartlett, S. E.; Davidson, W. S. Identification of Thunnus tuna species by the polymerase chain reaction and direct sequence analysis of their mitochondrial cytochrome b genes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 1991, 48, 309-317. Céspedes, A.; et al. Identificación de especies de pescado. II Técnicas genéticas. Alimentaria, Octubre 99/67. Quinteiro, J.; Sotelo, C. G.; Rehbein, H.; Pryde, S. E.; Medina, I.; Pérez-Martín, R. I.; Rey-Méndez, M.; Mackie, I. M. 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