TP 6 2016 - Campus Virtual - Universidad Nacional de Tucumán

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia
Universidad Nacional de Tucumán
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Nº 6
Inmunohematología
2
SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS
La expresión sistema de grupos sanguíneos se asocia históricamente a los
sistemas de antígenos y anticuerpos eritrocitarios; sin embargo, el término es
igualmente válido cuando se aplica a los sistemas de antígenos y anticuerpos
leucocitarios y plaquetarios.
Existen antígenos específicos, comprometidos con una única línea celular, como los
sistemas Rh y Kidd, localizados únicamente en la membrana de los glóbulos rojos
(GR), y antígenos pluritisulares, presentes en células sanguíneas, fluidos (saliva,
leche, liquido amniótico) y tejidos, como los sistemas ABO, Lewis (Le), Kell, Lutheran
(Lu), CD55, entre otros.
ANTÍGENOS ERITROCITARIOS
Se definen como antígenos (Ag) eritrocitarios a estructuras moleculares, localizadas
en la membrana del glóbulo rojo, capaces de ser reconocidas por el sistema inmune
de individuos que carezcan de ellos, produciendo anticuerpos (Ac) específicos.
Estas moléculas tienen distintas composiciones bioquímicas.
Antígenos glucídicos. Se forman por la adición de glúcidos sobre precursores
específicos (cadenas cortas de carbohidratos), como los grupos ABO, Hh, Lewis, Ii.
En otros, los oligosacáridos se asocian a lípidos como el Ag P (glicoproteínas), o a
proteínas como el Ag Lu o Ag del sistema Kell (glicoproteínas).
Antígenos proteicos. Hay Ag que forman parte de las proteínas integrales de
membrana del eritrocito, la glucoforina A y B, y la banda 3, dando lugar a los Ag del
sistema MN, SsU y Diego respectivamente. Otros forman parte de proteínas
estructurales como la proteína Rh, Colton, Duffy (que atraviesan varias veces la
membrana del GR), o participan en el transporte de urea como los Ag del sistema
Kidd. Hay proteínas que se encuentran ancladas a la membrana por lípidos como el
glicosilfosfatidilinositol (GPI), como los Ag Cromer, que son proteínas reguladoras de
la activación del complemento, denominadas factores de la aceleración de la
declinación (FAD, CD55).
Hay Ag que se expresan débilmente en sangre de cordón, como los Ag del sistema
ABO (presenta un tercio de la expresión del adulto), Le, P1, Lu; otros tienen
expresión normal (como en el adulto), Ag de los sistemas Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS;
y Ag que tienen una expresión intensa como el i del sistema Ii.
Según la clasificación del comité de nomenclatura de la “International Society Blood
Transfusion” (ISBT), actualmente se definieron 308 Ag eritrocitarios que se
distribuyen en 30 sistemas, 3 colecciones y 2 series.
Sistemas de grupo sanguíneo: sistema formado por uno o más Ag controlados por
un único locus o por un complejo de genes homólogos estrechamente ligados que
no recombinan durante la meiosis. A esta categoría pertenecen 272 Ag. Por ejemplo
el sistema Rh está formado por 48 Ag.
Colecciones: grupo de Ag relacionados serológica, bioquímica o genéticamente,
que al momento de la clasificación no pueden adquirir el rango de sistema. Por
ejemplo Cost, ER, Lec y Led. A esta categoría pertenecen 6 Ag.
Series 700: son Ag de baja incidencia (<1%, Ag privados) que no pueden ser
incluidos en las categorías anteriores. A esta categoría pertenecen 19 Ag.
Series 900: Son Ag de muy alta incidencia (>90%, Ag públicos), los que no
pertenecen a algún sistema o colección. A esta categoría pertenecen 11 Ag.
Con el fin de estandarizar la terminología de los grupos sanguíneos, la ISBT
denomina actualmente con letras mayúsculas el sistema al que pertenece, y se
3
enumera secuencialmente cada Ag por orden de descubrimiento. Por ejemplo, el
sistema KELL: KEL1, KEL2 (antes cellano o k), KEL3, KEL4, KEL5.
Existen Ag que pueden ser usados como marcadores antropológicos porque son
privativos de poblaciones de determinado origen étnico, por ejemplo el Ag Diego, de
poblaciones indígenas asiáticas y sudamericanas.
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS PLAQUETARIOS
Existen varios Ag en la membrana plaquetaria, algunos se comparten con otros tipos
celulares. Los más significativos se clasifican en tres grupos:
Ag del sistema ABO y asociados: H, I, i y P
Ag HLA de clase I
Ag plaquetoespecíficos
A menudo se transfunden plaquetas sin tener en cuenta la compatibilidad ABO, en
algunos casos los Ac ABO de tipo IgG de título elevado del receptor (generalmente
del grupo O) podrían reaccionar con las plaquetas del donante por el Ag ABO,
reduciendo la sobrevida. Los Ac antiplaquetarios más destacados son los dirigidos
contra los Ag HLA de clase I, compartidos por plaquetas y leucocitos, pues son los
más relevantes en la refractariedad plaquetaria postransfusional.
El papel de los Ac antiplaquetarios se asemeja al de los Ac antieritrocitarios, ya que
pueden provocar trombocitopenia aloinmune neonatal, púrpura trombocitopénica
autoinmune, trombocitopenias inmunes inducidas por droga y púrpura
postransfusional tardía.
ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS GRANULOCITARIOS/NEUTROFÍLICOS
Los Ag granulocitarios específicos, expresados en la membrana de los neutrófilos,
se denominan HNA (Human Neutrophil Alloantigens).
Las reacciones transfusionales febriles, no hemolíticas, a menudo se asocian a Ac
contra el Ag HLA1 presente en granulocitos y común a varias células nucleadas.
DETECCIÓN DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO
ERITROCITARIAS
Las determinaciones de Ag del GR y el estudio de Ac en suero se basan
principalmente en pruebas que tienen como punto final la aglutinación de los GR. La
hemoaglutinación es la agregación visible de GR mediada por Ac. En ocasiones, la
unión Ag-Ac activa la vía clásica del sistema del complemento, y el resultado final es
una hemólisis in vitro, lo cual se considera un resultado positivo.
ANTICUERPOS DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS
La formación de Ac en respuesta a un estímulo antigénico se denomina
sensibilización. Esta puede ser aloinmune si el Ag proviene de otro individuo (por
embarazo, transfusión, transplante de médula ósea), o bien autoinmune si se trata
de una sensibilización contra un Ag propio, sin evento inmunizante previo. Según el
tipo de reacción en que están involucrados, de hemoaglutinación o hemólisis, se
habla de Ac aglutinantes o hemolíticos. Los primeros son aquellos capaces de
producir una reacción visible de hemoaglutinación en medio salino.
ANTICUERPOS AGLUTINANTES Y NO AGLUTINANTES
Un factor muy importante es el tipo de inmunoglobulina a la que pertenecen los Ac
reaccionantes. Se dice que un Ac es aglutinante cuando aglutina GR en solución de
4
NaCl 0,15 M (solución fisiológica). Si los Ac son del tipo IgM la aglutinación se
produce directamente. Por su tamaño molecular y la distribución de los lugares de
reacción con los Ag, pueden unirse fácilmente con varios hematíes y producir su
aglutinación (Figura N°1).
FIGURA N°1: Hemoaglutinación con Ac IgM
Molécula IgM
Hematíes aglutinados por una IgM
Los Ac no aglutinantes se fijan a la superficie de los GR sin llegar a la formación de
los grumos (aglutinados) que hacen visible la reacción. La sensibilización de GR
por Ac de tipo IgG, generalmente no produce aglutinación (Figura N°2). Existen
excepciones que están relacionadas al número y al grado de exposición de los
determinantes antigénicos como las aglutininas del ABO, el anti-D frente a GR con
fenotipos - - D - -, ccDee.
FIGURA N°2: Sensibilización de eritrocitos con Ac IgG
Molécula IgG
Hematíes sensibilizados por moléculas de IgG
La molécula de IgG es demasiado pequeña para unirse a más de un GR a no ser
que se introduzca alguna modificación técnica.
REACCIONES DE HEMOAGLUTINACIÓN
La especificidad y la reversibilidad son las características principales de la reacción
Ag-Ac y las bases sobre las cuales reposan las técnicas de inmunohematología.
Especificidad: a cada determinante antigénico le corresponde un Ac específico, lo
que implica una estrecha complementariedad entre las estructuras reactivas del Ag y
del Ac.
Reversibilidad: se produce una reacción bimolecular en equilibrio químico, en la cual
es posible disociar el complejo Ag-Ac, suministrándole la energía necesaria. La
separación de los Ac se conoce como elución.
La reacción de hemoaglutinación tiene 2 etapas: sensibilización y aglutinación.
1-Sensibilización: El Ac se une al Ag eritrocitario superficial, quedando el GR
cubierto de Ac.
Ag +Ac
Ag-Ac
Esta etapa está influenciada por las siguientes variables:
5
• Temperatura: cada sistema Ag/Ac tiene una temperatura óptima. Las IgM
reaccionan mejor a 4ºC y las IgG, a 37ºC.
• Afinidad entre Ag y Ac.
• pH: el óptimo es entre 6.5 y 7.6.
• Concentración relativa del Ag y del Ac: Puede ocurrir ausencia o disminución de
aglutinación con grandes cantidades de Ac o Ag; situación denominada “fenómeno
de prozona y postzona” respectivamente y que puede llevar falsos negativos o
reacciones débiles (Figura N°3).
FIGURA N°3: Fenómeno de prozona y postzona
Con grandes concentraciones de Ac existe mayor probabilidad de que los dos sitios
de unión al Ag se unan a determinantes en una misma célula. Ante el exceso de Ag
la situación es similar.
• Fuerza iónica del medio: Al disminuir la fuerza iónica del medio, disminuye la nube
de iones que rodea a los GR favoreciendo la unión Ag-Ac.
• Tiempo de incubación: es el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de
reacción entre Ag y Ac.
2- Aglutinación: ocurre cuando una molécula de Ac enlaza GR adyacentes
formando una red, haciendo visible macroscópicamente la reacción. Este fenómeno
depende:
• Proximidad de los GR: La superficie de los GR tiene cargas eléctricas negativas
debidas a los carboxilos del ácido siálico unido a la glicoproteína de la membrana. Si
los GR están en suspensión en un medio que contiene iones libres, los cationes
forman una envoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtiéndolos en
partículas cargadas de electricidad del mismo signo, que experimentan una fuerza
de repulsión entre ellas. Esta fuerza de repulsión se denomina potencial Zeta. Se
forma entonces una doble capa compuesta por las cargas superficiales del GR y la
nube de cationes (Figura N°4).
FIGURA N°4: Potencial Z de los eritrocitos
6
Ecuación de Pollack
q
Z=f
D
Z: potencial zeta
q: densidad de carga superficial del eritrocito
D: constante dieléctrica del medio
: fuerza iónica del medio.
• Concentración de puntos antigénicos o densidad del Ag: Es decir de la cantidad de
Ag por GR.
ANTÍGENO
A
D
E
Kell
Fy
COPIAS POR GR
1.000.000
9.900-33.000
17.900-27.500
3.500
7.000-17.000
• Naturaleza del Ac interviniente: Se refiere a la clase de inmunoglobulina
involucrada. En condiciones isotónicas, los GR no pueden aproximarse a menos de
50-100 Ǻ. En el caso de las lgM, el tamaño de estas moléculas permite la
aglutinación directa, en medio salino isotónico. Las moléculas de IgG, de menor
tamaño, no llegan a cubrir esa distancia y sensibilizan sin formación de la malla. En
este caso, se hace necesaria la utilización de distintas metodologías que disminuyan
la distancia entre los GR favoreciendo la aglutinación.
IgM (SF)
n Ag-Ac
(Ag-Ac)n
IgG
(Albúmina, enzimas, Coombs)
MÉTODOS PARA DETECTAR AC NO AGLUTINANTES
Para potenciar las reacciones de aglutinación y facilitar así la lectura e interpretación
de los resultados se emplean diversos métodos, que pueden consistir simplemente
en una centrifugación controlada en cuanto a tiempo y velocidad, para favorecer la
formación de aglutinados visibles en el momento de efectuar las lecturas. Los
métodos a los que se puede apelar para observar aglutinación con Ac no
aglutinantes son:
a) - Métodos basados en modificaciones físico - químicas.
Afectan principalmente el potencial zeta disminuyéndolo de tal forma que sea factible
la aproximación de los GR para formar el aglutinado. Son los siguientes:

Aumento de la constante dieléctrica del medio
Esto se logra agregando macromoléculas como albúmina, la cual se polariza en el
campo eléctrico creado por los GR disminuyendo las fuerzas de repulsión entre los
mismos y alterando la tensión superficial intercelular. Todo esto favorece la
aglutinación de GR recubiertos de Ac. Tiene escasa participación en la etapa de
sensibilización.

Tratamiento enzimático de los GR
Las enzimas proteolíticas bromelina, ficina, papaína y tripsina disminuyen la carga
superficial negativa de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las
cadenas polisacáridas, con lo que disminuye q (densidad de carga superficial), y
decrece el potencial zeta. La menor repulsión entre las células favorece entonces su
aglutinación. También produce el clivaje de proteínas que incrementan la tensión
7
superficial de las células. Aunque estas enzimas exaltan la aglutinación mediada por
algunos Ac (anti-Rh, anti-K, anti- Kidd), desnaturalizan ciertos Ag eritrocitarios, en
especial los M, N, S, Fya, Fyb. Es decir que las enzimas cambian la estructura
bioquímica de un Ag y su localización en la membrana eritrocitaria. Algunos Ag son
destruidos y otros se exaltan en la membrana eritrocitaria. Esta propiedad se utiliza
para identificar mezclas complejas de Ac y para caracterizar la especificidad del Ac
cuando su identificación no es evidente en las pruebas serológicas comunes.

Polietilenglicol (PEG)
Es un polímero lineal hidrosoluble usado como aditivo para aumentar la captación de
Ac; concentra los Ac promoviendo su incorporación y potenciando la reacción.

Polybrene
Es un policatión de amonio cuaternario (bromuro de exadimetrina) que neutraliza la
carga negativa de los GR produciendo una agregación reversible. Este acercamiento
de GR favorece la unión de Ac tipo IgG. Si se adiciona citrato (polianión) se
restablece la carga del GR: si el aglutinado se disocia la prueba es negativa, pero si
persiste la prueba es positiva.

Reactivos de baja fuerza iónica
La fuerza iónica es uno de los factores más importantes que determinan la tasa y la
cantidad de captación de Ac por parte de los GR. El uso soluciones de baja fuerza
iónica, como SOSBI (solución salina de baja fuerza iónica) o LISS, disminuye el
tiempo de incubación (de 60 minutos a 10-15 minutos) pues aumentan hasta en
1000 veces la afinidad entre Ag y Ac, y potencian las reacciones de los Ac sin
incrementar las reacciones inespecíficas.
b) - Métodos inmunológicos.
Utilizan suero antiglobulina humana (SAGH), conocido también como suero de
Coombs o reactivo de Coombs, el cual reconoce la fracción Fc de inmunoglobulinas
humanas. Si en una reacción hubo correspondencia entre Ag eritrocitarios y Ac no
aglutinantes (sensibilización de GR), el agregado de la antiglobulina humana
reconocerá los Ac fijados a la superficie eritrocitaria formando puentes entre células
adyacentes, permitiendo visualizar la aglutinación.
El suero de Coombs se obtiene por inmunización de animales (generalmente
conejos) con suero humano. Este reactivo puede ser:
--- Poliespecífico: el que se emplea de rutina contiene dos Ac, anti-IgG y anti-C3d
(componente del complemento).
--- Monoespecífico: presenta los Ac por separado anti-IgG, anti-C3d, anti-C3b.
Cuando se tiene una reacción positiva con el reactivo poliespecífico, luego debe
investigarse mediante los reactivos monoespecíficos, el tipo de Ac y/ o fracción de
complemento unido a los GR.
CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS
REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES
Llamados también antisueros, permiten determinar el grupo sanguíneo. Los
reactivos a los que nos vamos a referir son los más utilizados en las técnicas de
rutina del Banco de Sangre como por ejemplo anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, etc.
Pueden ser:
Policlonales: mezcla de Ac contra distintos epitopes de una misma molécula que se
obtiene por inmunización de animales o de personas sensibilizadas por
transfusiones o embarazos.
8
Monoclonales: Ac dirigido contra un único epitope que se obtienen a partir de
hibridomas.
Actualmente los reactivos hemoclasificadores que se emplean para determinar el
grupo sanguíneo del sistema ABO son de origen monoclonal y son los siguientes:
anti-A, anti-B, anti-AB.
El reactivo hemoclasificador monoclonal para detectar el Ag D del sistema Rh es el
anti-D, y puede ser monoespecífico, conteniendo Ac tipo IgM, o poliespecífico,
conteniendo mezcla de IgM más IgG (llamado blend).
Antes de emplear estos antisueros hay que realizar la valoración de los reactivos
mediante métodos que son semicuantitativos y que consisten en determinar los
siguientes parámetros:
 Titulo y score.
 Avidez
 Especificidad.
a)- TÍTULO: es la inversa de la máxima dilución en la que se observa aglutinación
macroscópicamente. Al titular un Ac se puede saber hasta qué dilución mantiene
actividad inmunológica.
b)- SCORE o PUNTAJE: es la sumatoria de los valores asignados a la aglutinación
de cada tubo de la titulación, mide la intensidad de reacción.
c)- AVIDEZ: es el tiempo en el cual se observa aglutinación al reaccionar un Ac con
su correspondiente Ag.
d)- ESPECIFICIDAD: es la capacidad que tiene un Ac de reaccionar solamente con
su correspondiente Ag.
El título, el score y la avidez pueden variar por las condiciones de almacenamiento,
contaminación, ruptura de cadena de frío, etc.
Preparación de las suspensiones de GR
Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm una muestra de sangre anticoagulada con EDTA.
Eliminar el sobrenadante. Lavar los GR 3 veces con solución fisiológica o hasta que
el sobrenadante quede límpido.
Para una suspensión de:
GR al 5% mezclar 50 μL de GR lavados + 1 mL de solución fisiológica.
GR al 10% mezclar 100 μL de GR lavados + 1 mL de solución fisiológica.
MÉTODO DE TITULACIÓN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
Sol. Fisiol.
-
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
Antisuero
a titular
(anti-A,
anti-B ó
anti-AB)
100μL
100μL
GR 5%
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
Tubos
Dilución
final
9
Se hacen diluciones dobles progresivas en solución fisiológica del antisuero a titular.
A cada tubo se agrega una suspensión de GR al 5% que presenten la especificidad
antigénica correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir que si se titula:
- antisuero anti-A → se usa una suspensión de “GR A” al 5%
- antisuero anti-B → se usa una suspensión de “GR B” al 5%
- antisuero anti-AB → se usa una suspensión de “GR A” ó “GR B” ó “GR AB” al 5%
Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm.
Finalmente, se realiza la lectura siendo el título la inversa de la dilución del último
tubo que presenta aglutinación.
Resultados:
Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener un
Título  128. Este dato, aunque tiene valor indiscutido, es muy vago: dos reactivos
pueden tener un mismo título pero aglutinar con intensidad diferente. Entonces es
importante considerar el score, que se calcula como la sumatoria de los valores
asignados a cada tubo de la titulación de acuerdo a la intensidad de aglutinación.
Aglutinado grumo único
++++ : 10
Aglutinado 2 - 3 grumos
+++ : 8
Aglutinado hasta 10 grumos ++ : 5
Aglutinación fina
+ : 2
Si dos o más reactivos de diferente marca, presentan el mismo título, tiene mayor
sensibilidad el que presente mayor score.
Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO debe tener un
Score  50.
MÉTODO DE TITULACIÓN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh
Como fue indicado antes, es fundamental conocer la naturaleza del reactivo a titular
de tal forma de respetar las condiciones en que éste produce aglutinación. Las
técnicas que se describen a continuación se utilizan en la evaluación del anti-D
“blend”.
Investigación de IgM (en medio salino):
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1/1
1/2
1/4
1/8
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1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
-
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
Anti-D
100μL
100μL
GR 5%
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
Tubos
Dilución
final
Sol. Fisiol.
Se hacen diluciones dobles progresivas en solución fisiológica del antisuero a titular.
A cada tubo se agrega una suspensión de “GR O” Rh (D) positivo al 5%.
Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm.
Finalmente, se realiza la lectura siendo el título la inversa de la dilución del último
tubo que presenta aglutinación.
10
Investigación de IgM más IgG
Se procede en forma idéntica al caso anterior, pero luego del agregado de los GR se
adiciona a cada tubo una gota de solución de bromelina o albúmina al 6%. Se incuba
10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga 1 minuto a 1000 rpm y se
lee la aglutinación.
Investigación de IgG
Es necesario hacer un tratamiento previo del anti-D a titular con 2-Mercaptoetanol,
reactivo capaz de disociar las moléculas de IgM en fracciones que no tienen
actividad inmunológica. Para ello, en un tubo de hemóIisis se colocan 2 gotas de
anti-D más 2 gotas de 2-Mercaptoetanol, se incuba 15 minutos a 37 ºC.
Se procede a titular realizando las diluciones doble progresivas del anti-D tratado y
se continúa en forma idéntica al caso anterior. Si no se dispone de bromelina se
puede hacer una prueba de Coombs indirecta.
Resultados:
Según normas internacionales los antisueros para el sistema Rh deben tener un
Título  32, y un Score  50, que se determina como fue explicado para el sistema
ABO.
AVIDEZ DE LOS REACTIVOS PARA LOS SISTEMAS ABO Y Rh
En una placa de vidrio colocar 1 gota de antisuero y a 1 cm de distancia colocar
50µL de una suspensión de GR al 10% que presenten la especificidad antigénica
correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir:
- antisuero anti-A → se usa una suspensión de “GR A” al 10%
- antisuero anti-B → se usa una suspensión de “GR B” al 10%
- antisuero anti-AB → se usa una suspensión de “GR A” ó “GR B” ó “GR AB” al 10%
- antisuero anti-D → se usa una suspensión de “GR O” Rh (D) positivo al 50%
Mezclar con una varilla y disparar simultáneamente el cronómetro. Medir el tiempo
de aglutinación.
Resultados:
Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener una
Avidez  8 segundos, y para el sistema Rh,  30 segundos.
ESPECIFICIDAD DE LOS REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO
En tres tubos de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-A con 100μL de suspensiones
de “GR A”, “GR B” y “GR O” al 5%, respectivamente. Mezclar suavemente.
Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer.
Se procede a repetir de igual manera para los antisueros anti-B y anti-AB.
Resultados:
Si el antisuero aglutina sólo los GR del grupo para el que presenta especificidad, el
resultado es el adecuado. Por ejemplo el anti-A solo debe aglutinar “GR A”.
Tubo
GR A 5%
GR B 5%
GR O 5%
Anti-A
+
-
Anti-B
+
-
Anti-AB
+
+
-
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ESPECIFICIDAD DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh
En un tubo de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-D con 100μL suspensión de “GR
O” Rh (D) positivo al 5% (Genotipo Fisher-Race: DCe/dce, Nomenclatura Wiener:
R1r). En otro tubo de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-D con 100μL suspensión
de “GR O” Rh (D) negativo al 5% (Genotipo Fisher-Race: dce/dce, Nomenclatura
Wiener: rr).
Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer.
Resultados:
El antisuero debe aglutinar sólo los “GR O” Rh (D) positivo.
DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS
Las reacciones de hemoaglutinación pueden ser realizadas en tubo o en placa.
Ambas técnicas son de igual naturaleza, aunque la reacción en tubo es más sensible
ya que la centrifugación a bajas revoluciones por minuto de los tubos favorece la
aproximación de GR sensibilizados y su aglutinación.
TIPIFICACIÓN DEL SISTEMA ABO
Consideraciones del Sistema ABO
Debido a que el sistema ABO involucra la presencia de Ag en GR (aglutinógenos) y
de Ac naturales en plasma (aglutininas) (Figura N°5), la tipificación del mismo se
realiza mediante un método directo que detecta los aglutinógenos, y un método
indirecto o inverso que identifica las aglutininas plasmáticas.
FIGURA N°5: Sistema ABO
Plasma
Ac
 Prueba directa en placa o portaobjeto
Técnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer
con urgencia el grupo sanguíneo.
12
Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensión de GR al 40% en
solución fisiológica.
Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB
Técnica:
1. Colocar 1 gota de cada uno de los antisueros en un portaobjeto limpio y seco.
2. Colocar 50uL de la suspensión de GR a 1 cm de distancia.
3. Mezclar utilizando una varilla diferente para cada reactivo, extender y balancear la
placa suavemente en forma circular durante 2 minutos observando presencia o
ausencia de aglutinación.
 Prueba directa en tubo
Muestra: suspensión de GR 5%
Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB
Técnica:
Marcar 3 tubos: A, B y AB
1- Agregar 1 gota de cada antisuero en el tubo correspondiente.
2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio a cada tubo.
3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente el botón celular observando la presencia o ausencia de
aglutinación.
Interpretación de la prueba directa
GR vs. Antisuero
Anti-A
Anti-B
Anti-AB
+
+
+
+
+
+
+
Grupo sanguíneo
O
A
B
AB
 Prueba inversa
Como las aglutininas a investigar no tienen gran avidez, la técnica no se realiza en
placa sino en tubo, pues tiene mayor sensibilidad.
Muestra: suero del paciente.
Reactivos: suspensión de GR “A”, “B” y “O” al 3-5%, comerciales o preparados en el
laboratorio.
El uso de GR “O” tiene por objeto controlar la especificidad de la aglutinación, al
carecer de Ag para el sistema ABO, estos GR no deben aglutinar (control negativo).
Si hubiera aglutinación, la reacción no es válida.
Técnica:
1. Rotular tres tubos como A, B y O.
2. Colocar 100 μL de suero del paciente en cada tubo.
3. Agregar 50 μL de la suspensión de GR “A” en el tubo A, 50 μL de GR “B” en el
tubo B y 50 μL de GR “O” en el tubo O.
4. Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
5. Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de
aglutinación. En algunos casos se observa hemólisis, lo cual se interpreta como un
resultado positivo.
13
Interpretación de la prueba inversa
Suero del paciente vs.
“GR A”
“GR B”
“GR O”
+
+
-
+
+
-
-
Grupo sanguíneo
O
A
B
AB
La importancia de realizar ambas pruebas para cada paciente tiene por objeto
obtener un dato confiable 100%. Si existe una discordancia entre los resultados
obtenidos en ambas pruebas, puede considerarse: empleo de material sucio,
contaminación de los reactivos, uso de una concentración inadecuada de GR. En
estos casos hay que repetir ambas pruebas, y si persiste la discordancia, verificar el
control de calidad de los reactivos; de ser necesario tomar una nueva muestra al
paciente. Otra causa de discordancia puede deberse a la presencia de subgrupos.
Entre los individuos de grupo “A”, se encuentran varios subgrupos, de todos ellos se
distinguen 2 categorías: A1 (80%) y A2 (18-20%), que pueden diferenciarse usando
lectinas específicas de grupo sanguíneo: Dolichos biflorus (anti-A1) y Ulex
europaeus (anti-H).
En las anemias hemoliticas autoinmunes, la prueba inversa puede dar positivo tubo
que contiene “GR O” por la presencia de anticuerpos anti-I en el suero del paciente,
el cual reacciona con el Ag I, presente en la mayoría de los GR. En este caso hay
que preincubar a 37°C el suero y los GR y realizar la prueba a 37°C.
En pacientes con quimioterapia, donde se daña la membrana del GR, pueden no
coincidir la prueba directa con la inversa.
TIPIFICACIÓN DEL SISTEMA Rh
Consideraciones del Sistema Rh
El Sistema Rh está formado por 49 Ag, no todos con la misma distribución y
frecuencia; los más importantes son D, C, E, c y e.
En la práctica de rutina, el estudio del sistema Rh queda limitado a la investigación
del Ag D, por ser el más frecuente y el más inmunogénico.
El Ag D está compuesto por aproximadamente 37 epitopes o mosaicos antigénicos,
y puede presentar variaciones cuantitativas y cualitativas (Figura N°6).
----Variaciones cuantitativas del Ag D: la calidad antigénica es normal pero la
densidad antigénica está disminuida, es decir que no todos los individuos tienen la
misma cantidad de Ag D y no todos ellos reaccionan con la misma potencia frente al
anti-D. Antiguamente se lo conocía como Ag D débil (Du). Hoy se prefiere el término
Ag D debilitado.
----Variaciones cualitativas del Ag D: en este caso existe una variante o faltan partes
de ese mosaico, es decir, faltan determinantes antigénicos. Los individuos sin algún
epitope y expuestos a un Ag D completo pueden producir un aloanticuerpo anti-D
dirigido contra la parcela ausente. Este Ag se conoce como Ag D Parcial (variante D)
que puede presentarse con o sin variaciones cuantitativas asociadas, o sea que
podemos encontrar:
 Ag D Parcial
 Ag D Parcial Débil
14
FIGURA N°6: Variaciones cuantitativas y cualitativas del AgD
común
Existen 41 tipos de D parcial, distribuidos en 7 categorías y designados con números
romanos (II, IIIa, IIIc, IVa, IVb, Va, VI), donde la VI es la más importante de detectar
por ser la más inmunogénica.
Para detectar los Ag D parciales y los Ag D debilitados se requieren modificaciones
metodológicas en las técnicas de laboratorio, ya que no son Ag lo suficientemente
intensos para producir aglutinación en presencia de cualquier antisuero anti-D.
Se considerará “detección de Ag D débiles” al estudio de Ag D parciales y D
debilitado, ya que con la metodología a emplear no se los puede diferenciar.
 Prueba directa en placa o portaobjeto
Técnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer
con urgencia el grupo sanguíneo.
Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensión de GR al 40% en
solución fisiológica.
Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el
espectro de detección y brindar seguridad.
Técnica:
1. Colocar 1 gota del antisuero en un portaobjeto limpio y seco.
2. Agregar 50 μL de sangre entera a 1 cm de distancia.
3. Mezclar utilizando una varilla, extender y balancear la placa suavemente en forma
circular durante 2 minutos observando presencia o ausencia de aglutinación.
Interpretación:
Aglutina: prueba positiva → presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa → no implica ausencia de Ag D, pues también puede
tratarse de Ag D débiles que no son detectados por esta técnica. En este caso es
necesario hacer un estudio de “detección de Ag D débiles”.
 Prueba directa en tubo
Muestra: suspensión de GR del paciente al 5%.
Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el
espectro de detección y brindar seguridad.
Técnica:
15
1- Agregar 1 gota de antisuero en un tubo de hemólisis.
2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio.
3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de
aglutinación.
Interpretación:
Aglutina: prueba positiva → presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa → no implica ausencia de Ag D, pues también puede
tratarse de Ag D débiles que no son detectados por esta técnica. En este caso es
necesario hacer un estudio de “detección de Ag D débiles”
 Determinación de Ag D débiles
Muestra: suspensión de GR del paciente 5%.
Reactivos:
--- Anti-D blend.
--- SAGH poliespecífico ó anti-IgG.
Técnica:
Identificar un tubo como D y otro como C (control).
1- Agregar 1 gota de anti-D al tubo D y 1 gota de solución fisiológica al tubo C.
2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio a cada tubo.
3- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o no de aglutinación.
Aglutina: prueba positiva → presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa → continuar el estudio
El tubo C no debe aglutinar.
5- Incubar 30 minutos a 37°C
6- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
7- Resuspender los GR observando la presencia o no de aglutinación.
Aglutina: prueba positiva → presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo
No Aglutina: prueba negativa → continuar el estudio
El tubo C no debe aglutinar.
8- Lavar los GR 3 veces con solución fisiológica.
9- Después del último lavado, descartar totalmente el sobrenadante sobre papel
absorbente y agregar 1 gota del SAGH.
10- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
11- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinación.
Interpretación:
 Aglutina: presencia de Ag D débil → paciente Rh (D débil) positivo.
 No Aglutina: ausencia de Ag D → paciente Rh (D) negativo
En ambos casos el resultado solo es válido si el tubo C no presenta aglutinación.
Nota: Si la suspensión de hematíes se prepara con una solución de baja fuerza
iónica (LISS), la incubación a 37º C se reduce a 15 minutos.
Los reactivos anti-D deben contener Ac que detecten la categoría DVI (por ser la
más inmunogénica de los Ag D parciales).
Importancia de la detección de Ag D débiles
En el acto transfusional tener en cuenta que:
 Pacientes receptores y embarazadas D débil positivo: se consideran como Rh (D)
negativo.
16
 Donantes y recién nacidos D débil positivo: se consideran como Rh (D) positivo.
Causas de error en la determinación de grupos sanguíneos
Resultados falso negativo
No se agregó el antisuero
No se agregó el suero del paciente.
Proporción inapropiada de suero y de GR
Centrifugación insuficiente.
Incubación a más de 20 -24ºC.
Interpretación o registro incorrecto de los resultados
Resultados falso positivo
Centrifugación excesiva
Uso de reactivos, GR o solución salina contaminada.
Uso de material de vidrio sucio.
Interpretación o registro incorrecto de los resultados.
PRUEBA DE COOMBS
Conocida también como Prueba de Antiglobulina Humana, permite detectar e
identificar inmunoglobulinas y/o componentes del complemento unidos a GR que no
pueden ser detectados por otros métodos. También se define como una prueba que
permite reconocer anticuerpos no aglutinantes. Hay 2 tipos: directa e indirecta.
 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (PCD)
Fundamento: llamada también prueba de antiglobulina directa, detecta Ac y/o
componentes del complemento fijados in vivo en los GR del paciente mediante el
suero de Coombs. Es decir que la PCD se emplea para demostrar que hubo una
unión de Ac a los Ag eritrocitarios (sensibilización) in vivo.
FIGURA N°7: Principio de la prueba de Coombs directa
GR sensibilizados
y lavados del paciente
SAGH
Aglutinado
Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA. Los GR deben ser lavados 3
veces con solución fisiológica, y a partir del pellet de GR se prepara una suspensión
al 3-5% en solución fisiológica.
Reactivo: SAGH poliespecífico
Técnica:
1- Identificar un tubo de hemólisis como P (paciente) y otro como C (control).
2- En cada tubo colocar 50 μL de la suspensión de GR en estudio.
17
3- Solo al tubo P agregar 1 gota de SAGH.
4- Centrifugar ambos tubos 1 minuto a 1000 rpm.
5- Desprender los GR suavemente y ver la presencia o ausencia de aglutinación.
Interpretación:
-- Aglutina: PCD positiva → el paciente tiene GR recubiertos (sensibilizados) in vivo
con Ac tipo IgG, complemento o ambos. Se debe realizar la PCD con SAGH
monoespecífico (anti-IgG, anti-C3d y anti-C3b).
-- No Aglutina: no se puede aseverar que la PCD sea negativa, pues el
complemento en algunas ocasiones tarda en reaccionar por lo que se dejan los
tubos incubando 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugan 1 minuto
a 1000 rpm y se desprenden los GR suavemente para ver la presencia o ausencia
de aglutinación. Si no aglutina, la PCD es negativa. Si aglutina la PCD es positiva y
se procede a identificar que fracción de complemento tienen los GR haciendo la
PCD con SAGH monoespecífico.
Aplicaciones de la PCD
Diagnóstico de:
– Anemias hemolíticas autoinmunes (frías y calientes).
– Enfermedad hemolítica fetoneonatal (incompatibilidad D, E, Kell, Kidd).
– Anemias hemolíticas inducidas por fármacos
– Reacciones hemolíticas postransfusionales (hemólisis aloinmune que sigue a una
transfusión incompatible).
 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA (PCI)
Fundamento: llamada también prueba de antiglobulina indirecta, detecta Ac y/o
componentes del complemento presentes en el suero del paciente que son fijados in
vitro a los GR durante un tiempo de incubación (Figura N°8).
Hay situaciones en que un paciente puede desarrollar Ac anti-eritrocitarios
(generalmente IgG, pero también hay aglutinantes) en respuesta a un estímulo
antigénico (paciente sensibilizado). Estos Ac pueden permanecer circulando en el
suero del paciente sin ocasionarle ningún trastorno, a menos que se enfrente
nuevamente con su correspondiente Ag. Para ponerlos en evidencia, se utiliza la
PCI.
FIGURA N°8: Principio de la prueba de Coombs indirecta
Muestra
GR
GR
SAGH
Aglutinado
(suero
conocidos
sensibilizados
con Ac/C3)
Como se ve, en la prueba indirecta la sensibilización de los eritrocitos ocurre in vitro y es
visualizada por el agregado del reactivo de Coombs.
18
Muestra: suero del paciente.
Reactivos:
-- Mezcla de “GR 0” Rh (D) positivos al 3-5% en solución fisiológica o en LISS. Para
asegurar la detección de todos los Ac clínicamente significativos, se emplea un pool
comercial o fabricado en el laboratorio de GR testigos o conocidos que expresen los
Ag más corrientes de los principales sistemas de grupo sanguíneo.
-- SAGH poliespecífico
Técnica:
1- En un tubo de hemólisis colocar 100 μL del suero del paciente y 50 μL de la
suspensión de GR.
2- Incubar 30 minutos a 37°C si la suspensión de GR se hizo en solución fisiológica.
Pero si fue hecha en LISS, incubar 10 minutos a 37C.
3- Lavar 3 veces con solución fisiológica. Después del último lavado, descartar
totalmente el sobrenadante sobre papel absorbente.
4- Agregar 1 gota del SAGH.
5- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm.
6- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinación.
Interpretación:
-- Aglutina: PCI positiva → el paciente tiene Ac irregulares en el suero. Se debe
realizar la titulación del Ac haciendo diluciones doble progresivas del suero en
solución fisiológica. También se puede identificar el o los Ac detectados mediante el
uso de paneles de GR identificadores.
-- No Aglutina: PCI negativa
Aplicaciones de la PCI
– Detección de Ac irregulares en suero de embarazadas, de donantes de sangre y de
pacientes con clínica de anemias hemolíticas.
– Identificación de Ac irregulares.
– Determinación de Ag eritrocitarios a través de antisueros específicos (Ag D débiles,
Ag Kell).
– Pruebas de compatibilidad pretransfusional.
– Pruebas de compatibilidad conyugal.
Observaciones:
Ventajas de utilizar LISS o SOSBI
 Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs en la detección de la mayoría de
los Ac de significación clínica.
 Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad que con la técnica
convencional pueden perderse en los lavados previos a la adición del reactivo de
Coombs.
 Permite reducir el tiempo de incubación de la prueba de Coombs de 30-45 minutos
a 10 minutos.
Desventajas de utilizar LISS o SOSBI
 La solución LISS debe ser sometida a un estricto control de la osmolaridad para
evitar la fijación inespecífica de complemento.
 Los GR resuspendidos en LISS no pueden ser utilizados luego de las 24hs desde
su preparación.
19
Causas de error en la prueba de Coombs
Falsos positivos
1. Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto de Ac naturales o del complemento
cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4C antes de su análisis.
2. Lavado insuficiente de los GR.
3. GR autoaglutinados
4. Sobrecentrifugación.
Falsos negativos
1. Tiempo insuficiente de la prueba que no permite alcanzar la aglutinación
eritrocitaria.
2. Omitir incubación de 10 minutos a temperatura ambiente para demostrar la
presencia de complemento.
3. Cuando el Ac es de naturaleza IgA, tener en cuenta que los SAGH normalmente
empleados carecen de anti- lgA.
4. SAGH de mala calidad debido a mala conservación o contaminación bacteriana.
5. Lavado inadecuado de los GR, lo que facilita la neutralización del SAGH por las
inmunoglobulinas plasmáticas o el complemento.
6. Cantidad de moléculas de IgG y C3d presentes en la membrana del GR por
debajo del umbral de detección del SAGH (150-500 moléculas por célula).
Titulación del SAGH
1. Preparación de GR sensibilizados con anti-D de origen inmune (anti- IgG):
 Realizar un pool de 3 muestras de “GR O” Rh(D) positivo. De allí tomar 500 μL
de GR lavados y mezclarlos con 500 μL de suero humano con aloanticuerpos de
especificidad anti-D (de embarazada o donantes, con un título entre 64 y 256).
Incubar 60 min a 37ºC.
 Homogeneizar cada 5 minutos, para que los GR entren en contacto con los Ac
del suero.
 Sacar una alícuota de 300uL de GR presuntamente sensibilizados, lavarlos 3
veces con solución fisiológica y realizar una suspensión al 3%.
 De esa suspensión tomar 50 μL y agregarle 100 μL de SAGH. Centrifugar y leer.
 Se debe obtener una aglutinación tal que permita visualizar reacciones débiles,
lo ideal es obtener una intensidad de 2+.
2. Realizar diluciones doble progresivas en S.F. del SAGH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
-
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
100μL
SAGH
100μL
100μL
-
-
-
-
-
-
-
-
Suspensión
de GR
sensibilizados al 3%
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
Tubos
Dilución
final
Sol. Fisiol.
.
3. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, leer y determinar título en el tubo con la mayor
dilución de SAGH que presente aglutinación macroscópica.
20
INVESTIGACIÓN DE CRIOAGLUTININAS.
Las anemias hemoliticas autoinmunes (AHAI) constituyen un grupo de citopenias en
las que hay una destrucción de GR por mecanismos inmunológicos. Se denominan
autoinmunes por la presencia de Ac dirigidos contra los propios Ag eritrocitarios.
Las características serológicas de los Ac implicados permite clasificarlos en:
• AHAI por Ac calientes.
• AHAI por Ac fríos: - enfermedad de las aglutininas frías.
- hemoglobinuria paroxística a frigore.
En la enfermedad de las aglutininas frías, los Ac responsables son aglutinantes
(IgM), y actúan a una temperatura menor a 37ºC, siendo su rango óptimo entre 0C y
10C. Su especificidad está dada contra los Ag del sistema eritrocitario I i. Estos Ag
se hallan en casi todos los GR. El Ag I se encuentra en grandes cantidades en los
GR del adulto, mientras que por el contrario los Ag i son abundantes en los GR del
recién nacido. El cambio i por I tiene lugar en los primeros 18 meses de vida.
Método:
Muestra:
----Suero del paciente obtenido a 37°C para evitar el atrapamiento de los Ac en el
coágulo a bajas temperaturas. El tubo con sangre sin anticoagulante recién extraído
se coloca rápidamente en baño a 37°C 2 horas. Separar el suero con pipeta pasteur
y centrifugar en otro tubo.
----Suspensión de GR del paciente al 5% en solución fisiológica.
Reactivos:
----Suspensión de GR fenotipo OI (adulto) al 5% en solución fisiológica
----Suspensión de GR fenotipo Oi (bebé) al 5% en solución fisiológica.
Técnica:
1- Realizar diluciones doble progresivas del suero del paciente en solución
fisiológica en tres hileras de 12 tubos cada una.
2- Enfrentar los tubos de la primera hilera con la suspensión de sus propios GR.
3- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensión de GR OI.
4- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensión de GR Oi.
Tubos
Dilución
final
Sol.Fisiol.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
-
100μL
100μL
Suero del
100μL 100μL
paciente
GR al 5%
50μL
50μL
-
50μL
10
11
1/512 1/1028
12
1/2048
100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL
-
-
-
-
-
-
-
-
-
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
50μL
5- Incubar 18 a 24 horas a 4C (técnica de sedimentación).
6- Sacar los tubos de la heladera de a uno por vez y observar inmediatamente la
presencia de aglutinación ya que es reversible.
Interpretación
Se considera positividad patológica cuando el título es igual o superior a 1/64.
21
Nota: para preparar las suspensiones deben lavarse los GR tres veces con solución
fisiológica precalentada a 37C.
BIBLIOGRAFIA
 Human blood groups. Daniels G. Oxford, England: Blackwell Scientific
Publications. 2nd edition. 2002
 Williams Hematology. Kenneth Kaushansky, Marshall A. Lichtman, Thomas J.
Kipps, Uri Seligsohn, Josef T. Prchal. 8th edition. 2010
 Dacie and Lewis Practical Haematology. Barbara J Bain, Imelda Bates, Michael A
Laffan, S. Mitchell Lewis.11th edition. 2011
 Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. Regueiro González J.R.,
López Larrea S., González Rodríguez S. Editorial Médica Panamericana. 3a edición.
2004.
 Essential Guide to Blood Groups. Geoff Daniels, Imelda Bromilow. 2007.
 Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Richard A.
McPherson, Matthew R. Pincus. 22th edition. 2011