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Fluoróforos en bioquímica
• Fluorescencia intrínseca
fluorescencia natural, propia del sistema
• Fluorescencia extrínseca
agrego a la muestra un fluoróforo externo
(sonda fluorescente)
Fluorescencia en:
• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos
aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano.
Además marcado con sondas fluorescentes (FITC,
DNS). GFP y derivados.
• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se
agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr,
DAPI) o fosfolípidos marcados
• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas
liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS)
Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)
• Clorofilas
• Indicadores fluorescentes
(pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
4.7 ns en solución
(2.3 ns FMN)
0.3-1 ns unido a prot.
0.4 ns en solución
1-5 ns unido a DH
Sondas fluorescentes para proteínas
Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe y
emite en el visible, alto rendimiento,
ε=80.000 M-1cm-1
Problema: autoquenching, fotosensible, pH
DNS-Cl sensible a
polaridad del entorno,
fluorescencia polarizada
Prof. Gregorio Weber
1916 - 1997
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto
rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
http://probes.invitrogen.com/handbook/
http://probes.invitrogen.com/handbook/
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG antibody/pH 8.0
.
No
autoquenching
Fotoestable
Sondas fluorescentes para membranas
DPH = difenil hexatrieno
Liposoluble
Emisión polarizada
Ácido cis-parinárico
Ácido graso fluorescente, sensible a polaridad del solvente
Sonda fluorescente
unida al ácido graso
o fosfolípido
Colesterol = no fluorescente
Análogo fluorescente del colesterol
Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos
Bases modificadas fluorescentes
Sondas que se unen (no covalentemente) al ADN
Sondas que emiten en el NIR
Cianinas
Excitación en el visible
con laser
No autofluorescencia
Sondas fluorescentes para detectar bioanalitos
Cambio
espectral
por Ca2+
Desactivación
por cloruro Cl-
Sondas fluorogénicas
Producto de la reacción es fluorescente – especificidad -
Formaciòn de sonda fluorescente
por reacción con grupos amino
Medida de actividad
enzimática por foramción de
producto fluorescente
Sondas fluorescentes para medir potencial de membrana
Product Spectra - JC-1/pH 8.2
514/529
585/590
Adipocitos cargados con JC-1
(5 µM, 37ºC, 30 min) + 10 nM
FCCP.
Exc. = 488 nm Em = entre 515–
545 nm y 575–625 nm.
Fluoróforos de vida media larga
• Pirenos (100 – 400 ns)
• Lantánidos (0.5 – 3 ms)
Eu (III), Tb (III)
Baja absorción (10 M-1 cm-1), se usan
complejos metálicos conligandos
orgáncios.
Emisión desde orbitales 4f, transición
prohibida, lenta
Emisión no polarizada
• Complejo metal transición-ligando
Ru(II), Re(I), Os(II), ligando diimina
Eimisión por transferencia de carga metalligando, parcialmente prohibida
Emisión polarizada
τ larga, evita autofluorescencia
GFP = Green Fluorrescent Protein
Formación espontánea del fluoróforo al plegarse