Cinética Enzimática de la ureasa

Universidad Nacional Abierta y a Distancia-UNAD
Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente-ECAPMA
Programas: Zootecnia , Agronòmica e Ingeniería Agroforestal-IA
Laboratorio de Bioquímica Metabólica-BM
Prof: Jairo Granados.,MSc
Cinética Enzimática de
la ureasa
I. Objetivos
 Producir la hidrólisis de la urea por medio de la enzima
amidohidrolosa denominada UREASA.
 Analizar el electo que produce la variación de la concentración
del sustrato (UREA), corn respecto a !a velocidad de la reacción
enzimática
 Determinar por mélodo experimental los principales parámetros
que rigen la cinética enzimática, tales como: constante de
Michaelis; velocidad máxima, constante de velocidad y energía
de activación.
II.Conceptos Previos
¿Oué significan los siguientes términos:
Biocatalizador; proteína; Enzima; Cinética química; Velocidad de
reacción; específica de velocidad, Energía de activación; Sustrato;
Hidrólisis; Incubación; pH; Solución buffer; Tilulación; lnhibidores
enzimáticos?
III.Fundamento Teórico
La UREASA es una enzima amídohidrolosa de peso molecular:
480.000 Daltons, punto isoeléctrico: 5.0 y pH óptimo entre 6 y 7.
Cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico,
hidróxido de amonio, seqún la reacción
Ureasa
H2N-CO-NH2 + 3H2O
2NH4OH + CO2
pH=7,0,T=37°C
En presencia de una solución buffer de_fosfatos con pH = 7.0 y a una
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Cinética Enzimática de
la ureasa
temperatura de incubación de 25°c, la ureasa presenta una
constante de Michaelis de 10,5 mmol/L.
Los principales inhibidores de su actividad enzimática. Son los iones
metálicos pesados tales corno la plata (Ag +1) el mercurio (Hg+2) e
igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea Se encuentra en varios
tejidos vegetales como en el haba de soya lo cual implica que pueda ser
usada en análisis de alimentos para determinar urea, ya Sea por el
método de Kjeldhal o por titulación del amonio liberado. De esta forma, al
titular el hidróxido de amonio producido por la hidrólisis, se puede calcular la
cantidad de urea hidrolizada, utilizando el método estequiométrico, puesto
que se producen 2 moles de NH4OH por cada mol de urea desdoblada. Por
lo tanto, esta reacción puede utilizarse con éxito en la determinación de
urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgánicos. Dada la alta
especificación por el sustrato sobré el que actúa, la reacción permite
observar el curso de la cinética de Míchaelis-Menten. Para ello, se varía
!a concentración de la urea con respecto a la ureasa, posteriormente, las
soluciones se incuban durante un tiempo determinado, a! cabo de! cual
se proceden a titular con He! de concentración conocida. Así, a partir de la
cantidad de urea hidrolizada y el tiempo de reacción se calcula la velocidad de
la hidrólisis en rnicromol/minuto.
CINÉTICA DE MICHAELIS-MENTEN
El efecto de la variación de la concentración del sustrato sobre !a
velocidad do una reacción enzimática puede describirse gráficamente
así:
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la ureasa
Gráfica 2.Curva cinética de Michaelis Menten
La cual indica, que a bajos concentraciones de sustrato, la velocidad
de la reacción varía directamente proporcional a este, comportándose
como una cinética de primer orden. A medida que se incrementa el
sustrato, los centros activos de la enzima se saturan y por lo
consiguiente se establece un límite de velocidades denominada
velocidad máxima (V máx), que representa una cinética de orden cero
puesto que es constante.
Un parámetro útil en este análisis, lo constituye una constante denominada de
michaelis (Km), la cual está relacionadas con la concentración del sustrato en el
cual la velocidad es la mitad de la velocidad máxima. La ecuación de la hipérbola
anterior es:
.
Como se puede observar, la expresión anterior se caracteriza por dos valores
prácticos: Vmáx y Km
Para determinar estos parámetros, se utiliza frecuentemente e! método de
Linneweaver y Burk, llamado de la doble recíproca, puesto que utiliza el inverso de la
concentración del sustrato y de la velocidad para relacionarlos en una gráfica
aproximadamente lineal:
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Gráfica
1:Gráfica
de
la
doble
recíproca
de
Linneawer
and
Burk
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Se puede demostrar que la pendiente de esta gráfica es equivalente al cociente entre
Km y Vmáx y el intercepto vertical representa el inverso de la velocidad máxima,
por lo tanto, Sí la gráfica se linealizanpor el método estadístico de los mínimos
cuadrados, los parámetros Michaelianos se determinan así:
Otro método para encontrar Km y Vmáx es el propuesto por Eadie-Hofstee. En el
cual se gráfica velocidad contra el cociente entre V y concentración del sustrato. La
pendiente de la gráfica nos proporciona la constante de Michaelis
Otros parámetros cinéticos que se pueden determinar por método experimental son:
la constante de velocidad específica de la reacción, que se puede calcular a partir
de la velocidad máxima y la concentración inicial de la enzima, es decir:
como:
Vmáx = K3[ E ]; entonces:
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Además, si el experimento se realiza a dos temperaturas diferentes, se puede
encontrar la energía de activación (Eac) y el factor de frecuencia (A) por la ley de
Arrhenius Así:
IV.Lista de Materiales y Reactivos
1. Lista de Materiales:Tubos de ensayo con gradilla, pinzas para bureta,
erlenmeyer de 125mL, pipetas de 5 y 10mL,matraz aforado de 100mL, baño
termostatado, beaker de 400mL ,bureta de 25mL , soporte universal.
2. Lista de Reactivos:Ureasa al 0,1 % en buffer, fosfato de pH = 7.0, Urea
0,25M, HgCl2 al 1% , HCl 0,1N , indicador de Tashiro
V.Procedimiento
1. Alistar 6 tubos de ensayo, rotularlos así: B, 1, 2, 3, 4, 5 y colocarlos en la
gradilla
Reactivos(mL) / Tubos
B
1
2
3
4
5
Urea 0,25M
5,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Buffer fosfatos pH=7,0
5,0
8,5
7,5
6,5
5,5
4,5
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HgCl2 (Gotas)*
4
-
-
-
-
-
Agitar los tubos (10seg) ,colocarlos en baño de maría a 37°C,durante
3min,luego,sin sacarlos adicionar:
UREASA (mL)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
4
4
Dejar en baño de maría a 37°C,durante 20min, al final adicionar:
HgCl2 (Gotas)
-
4
4
4
Agitar vigorosamente los tubos(10seg) ,adicionar 2 gotas de indicador de Tashiro
y volver a mezclar(15seg) un color azul- verdoso indicará prueba positiva para la
actividad ureásica en la RBE ;posteriormente, sacar el blanco y depositar la
solución en un erlenmeyer.
2. Preparar el baño termostatado a una temperatura de 37°C (sí no dispone
de éste, alistar el equipo para baño de María (mechero, trípode, malla
de asbesto y un beaker de 400 a 600 mL.) controlar la temperatura del
baño con un termómetro.
3.Pipetear en el orden dado, los reactivos, de acuerdo a la siguiente tabla:
4.Alistar el montaje de titulación: lavar, purgar ,cargar y enrasar la bureta con HCl
0,1N
5.Colocar el erlenmeyer que contiene la solución blanco, debajo la bureta y
adicionar lentamente el HCl, hasta que aparezca y permanezaca un color rosadovioláceo. Esto indica que los equivalentes-gramo del hidróxido de amonio fueron
neutralizados por los equivalentes-gramo del ácido clorhídrico.
6.Registrar en su tabla de datos, los mL de HCl gastados en la titulación del
blanco.
7.Repetir el procedimiento anterior, con el tubo 1 y anotar los mL empleados de
HCl
8.Continuar el proceso con los tubos 2,3,4,5 y registrar los mL gastados de HCl
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en la tabla de datos.
VI. Tabla de Datos
Tabla 1.Volúmenes de HCl 0,1N,empleados en la titulación del NH4OH
Tubos
mL de úrea 0,25 M
mL gastados de HCl 0,1N
B
1
2
3
4
5
8