Inmunol 24/4 -68p 21/3/06 14:51 Página 390 Agammaglobulinemia ligada al sexo. Reconstitución in vitro M.C. García Rodríguez, R. Pérez de Diego, G. Fontán Casariego Servicio de Inmunología. Hospital Universitario «La Paz». Madrid (España). La agammaglobulinemia ligada al cromosoma X (ALX) se debe a un bloqueo en el desarrollo de los linfocitos B y se caracteriza porque los pacientes no producen inmunoglobulinas, tienen una susceptibilidad aumentada a infecciones por bacterias y enterovirus y su cifra de linfocitos B está muy disminuida o ausente. El gen responsable de la misma es el de la protein-tirosin-kinasa de Bruton (BTK) cuyas mutaciones dan lugar al fenotipo clásico de la enfermedad o a veces presentaciones atípicas por razones hoy desconocidas. Es una enfermedad rara,1 de cada 50.000-100.000 nacidos vivos, y hay pocas series en la literatura que describan en un amplio grupo de pacientes su clínica, analítica y estudio del defecto molecular y proteico. En nuestro grupo hemos estudiado 69 pacientes de 52 familias no relacionadas y tratamos de ver si existe en ellos una correlación genotipofenotipo. Una vez que se sospecha la enfermedad basándonos en los datos clínicos, analíticos y la historia familiar si la hubiere, estudiamos en primer lugar la expresión de BTK por Western blot o por citometría de flujo, y posteriormente hacemos el diagnóstico molecular del paciente y las posibles portadoras en la familia. Hemos encontrado en total 48 mutaciones diferentes, el 45% de las cuales son de novo, y las más frecuentes las missense (un 40%). Las clasificamos entre más severas o menos severas y en todos los casos hemos estudiado la capacidad para producir proteína, encontrando que únicamente siete pacientes presentaban una expresión proteica normal o disminuida, lo que ha permitido hacer en ellos estudios de fosforilación. Mayoritariamente dan lugar a un fenotipo clásico de la enfermedad, aunque también hemos encontrado presentaciones poco frecuentes. Dentro de los afectos en una misma familia existen diferencias en su presentación clínica y analítica e incluso alguno de ellos permanece asintomático en edad adulta. Hemos podido observar que algunos de los que 390 tienen una mutación de las consideradas menos severas conservan una cifra normal de alguna de las inmunoglobulinas y actividad cinasa residual, lo que puede explicar que algunos de dichos pacientes expresen un fenotipo más benigno de la enfermedad. Quizá los diversos fenotipos estén relacionados con el tipo de mutación o su localización, pero es posible que en las diferencias intrafamiliares y en las formas de presentación menos graves intervengan otros factores hoy desconocidos. Al hacer la correlación genotipo-fenotipo en la serie encontramos que aquellas mutaciones menos severas tenían unas cifras de inmunoglobulinas al diagnóstico más elevadas que las más graves, una edad al diagnóstico mayor y un menor número de hospitalizaciones antes de comenzar su tratamiento con gammaglobulina intravenosa. Sin embargo, algunas de las menos severas se asocian a fenotipos clásicos y hemos visto también cómo mutaciones con ausencia de expresión proteica se asocian a fenotipos menos severos, por lo que creemos que, comparando paciente a paciente, el papel que puede tener el tipo de mutación en la evolución de la enfermedad es desconocido y que el pronóstico de la enfermedad se verá favorecido únicamente con el diagnóstico temprano de la enfermedad, así como con la instauración precoz del tratamiento adecuado. La expresión de BTK estudiada por Western blot y citometría de flujo muestra que 7 de ellas expresan proteína, por lo que analizamos la actividad cinasa de estos casos mediante Western blot con detección del residuo tirosina223 de BTK fosforilado. Se observa que mutaciones fuera del dominio cinasa (R28C, R288W y K374N) permiten la autofosforilación de la tirosina 223 implicada en la activación de la BTK, mientras que mutaciones en dicho dominio (K430E y F540S) no presentan autofosforilación. Las mutaciones R544G y R544S, a pesar de estar en el dominio cinasa, muestran autofosforilación, debido a que dicha arginina está implicada en mantener inactiva a la BTK. Inmunol 24/4 -68p 21/3/06 14:51 Página 391 VII MEETING OF THE SPANISH GROUP FOR PRIMARY IMMUNODEFICIENCIES Por otra parte, hemos estudiado si la coexpresión de proteína normal y mutada puede producir efecto dominante negativo, para ver qué tipo de mutaciones serían potencialmente tratables en un futuro mediante terapia génica. Para ello hemos usado un modelo celular, el linfoma B de pollo DT40, cuya respuesta a la vía anti-IgM-BCR por ausencia de BTK es similar a humanos. Para los pacientes que expresan proteína, se reproducen sus mutaciones mediante mutagénesis dirigida en los vectores pApuro y pSGT, que posteriormente son transfectados por electroporación. Los clones son seleccionados por resistencia a puromicina en células DT40 salvaje y DT40 deficiente en BTK. Se realizan Western blot de BTK para detectar la presencia de proteína, y se miden los niveles de calcio mediante citometría de flujo con los marcadores Fluo-4 y Fura Red. Observamos que la transfección del gen mutado en células DT40 deficiente en BTK no corrige los niveles de calcio tras estimulación con Anti-IgM, mientras que la transfección del gen normal si lo hace. La coexpresión de proteína normal y mutada no produce en ningún caso efecto dominante negativo que afecte a la señal de calcio en respuesta a anti-IgM, incluso con niveles de expresión de BTK mutada muy elevados. CORRESPONDENCIA: Dra. M.C. García Rodríguez Servicio de Inmunología Hospital La Paz Paseo de la Castellana 268 28046 Madrid BIBLIOGRAFÍA 1. Conley ME, Howard V. Clinical findings leading to the diagnosis of X-linked agammaglobulinemia. J Pediatr 2002; 141: 566-571. 2. López Granados E, Pérez de Diego R, Ferreira Cerdán A, Fontán Casariego G, and García Rodríguez MC. A genotype-phenotype correlation study in a group of 54 patients with X-linked agammaglobulinemia. J Allergy Clin Immunol 2005; 116:690-677. 3. Nisitani S, Kato RM, Rawlings D, Witte ON, Wahl MI. In situ detection of activated Bruton´s tyrosine kinase in the Ig signalling complex by phosphopeptide-specific monoclonal antibodies. Proc.Natl. Acad.Sci.USA 1999; 96:2221-2226. 4. 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