BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD. ALCANCES Y LIMITACIONES Prof. Dra. Marta Ana Carballo CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y GENETICA TOXICOLOGICA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires ENTORNO / AMBIENTE EVENTOS BIOLÓGICOS TEMPRANOS EVENTOS BIOLÓGICOS TARDÍOS ENFERMEDAD CLÍNICA La Genética Toxicológica es la unión de dos grandes áreas del conocimiento como son la Toxicología y la Genética. Identifica y analiza la acción de los agentes con toxicidad dirigida hacia los componentes hereditarios de los organismos vivos. • • • • 1927 - Muller - radiaciones 1947 - Auerbach - agentes químicos 1953 - Watson y Crick - ADN 1969 - Alexander Hollaender - EMS •Determina el impacto que los distintos agentes (físicos, químicos, biológicos) pueden tener sobre el material genético •Trata de establecer la relación entre mutagenesis e iniciación del proceso neoplásico Componentes celulares proclives a los procesos mutagénicos Si hay una lesión en el ADN … Reparación del ADN Proliferación normal Errores en la reparación del ADN Daño severo del ADN Arresto del ciclo celular Proliferación anormal 9Micromutaciones 9Macromutaciones Apoptosis Necrosis Tipos y frecuencias de daño en el ADN Tipo Tipode dedaño dañoen enADN ADN Eventos/día/célula Eventos/día/célula % %de dedaño dañototal totaldiario diario (SSB) (SSB)Ruptura Rupturade desimple simplecadena cadena 7 Metilación Metilaciónde delalaGuanina GuaninaNN7 120.000 120.000 84.000 84.000 50,9 50,9 35,6 35,6 Depurinación Depurinación 6 Metilación Metilaciónde delalaGuanina GuaninaOO6 24.000 24.000 3.120 3.120 10,2 10,2 1,3 1,3 Oxidación Oxidacióndel delADN ADN Depirimidación Depirimidación 2.880 2.880 1.320 1.320 1,2 1,2 0,5 0,5 Deaminación Deaminaciónde delalaCitosina Citosina (DSB) (DSB)Rupturas Rupturasde dedoble doblecadena cadena 360 360 99 0,2 0,2 0,01 0,01 AGENTE AGENTEGENOTOXICO GENOTOXICO Rayos RayosXX ROS ROS Agentes Agentes alquilantes alquilantes RI RI Luz LuzUV UV Agentes Agentes antitumorales antitumorales Luz LuzUV UV Hidrocarburos Hidrocarburos policíclicos policíclicos aromáticos aromáticos Errores Erroresde de replicación replicación LESIONES LESIONES 8-oxidG 8-oxidG Rupturas Rupturasde de simple cadena simple cadena Fotoproductos Fotoproductos Aductos Aductos Dímeros Dímerosde de pirimídinas pirimídinas PROCESOS PROCESOS Reparación Reparaciónpor por escisión escisiónde de bases bases (BER) (BER) Reparación Reparaciónpor por escisión escisiónde de nucleótidos nucleótidos (NER) (NER) Enlaces Enlaces cruzados cruzados Rupturas Rupturasde de doble doblecadena cadena DE DE A-G A-G T-C T-C Inserciones Inserciones Deleciones Deleciones REPARACION REPARACION Recombinación Recombinación Homóloga Homóloga(HR) (HR) Reunión de Reunión de extremos extremosno no homólogos (NHEJ) homólogos (NHEJ) Reparación Reparaciónde de Mal Mal apareamiento apareamiento (MMR) (MMR) B I O M A R C A D O R E S DE EXPOSICIÓN: Señala presencia de sustancia exógena o metabolitos, o producto de interacción entre agente y molécula blanco. INTERNO DE DOSIS : Indica que el tóxico ha entrado al orgsnimo.. DE SUSCEPTIBILIDAD: Indicador de limitación adquirida o inherente de un organismo para responder a la exposición a un xenobiótico. DE DAÑO BIOLOGICO EFECTIVO: Indica que el tóxico ha producido algún tipo de daño en el organismo. DE EFECTO: Indicador de una alteración bioquímica, fisiológica o genética, resultado de la exposición a un xenobiótico. tico DE RESPUESTA BIOLOGICA: estadíos del proceso alteraciones genéticas DE ENFERMEDAD: tempranas de la enfermedad. de daño. representa Representan manifestaciones preclínicas o EVALUACION NIVELES DE COMPLEJIDAD CRECIENTE PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I) SECUNDARIO (Cultivo de células) (II) TERCIARIO (Organismo entero) (III) CUATERNARIO (Epidemiológico) (IV) Niveles de Evaluación SEGUNDO NIVEL (II) PRIMER NIVEL (I) ) ) Nivel Molecular o bacteriano Ensayos en procariotes o eucariotes inferiores ) Ejemplo: Test de Ames ; Bacillus subtilius ) ) Ensayos en cultivos de células eucariotas ) Ejemplo: Líneas celulares CHO, V79, Hela , Linfocitos de Sangre Periférica CUARTO NIVEL (IV) TERCER NIVEL (III) ) Nivel “In vivo” ) ) Ensayos organismo entero Ejemplos: Plantas, animales (invertebrados o vertebrados) y humanos expuestos Nivel “In vitro” ) ) Nivel Epidemiológico Ensayos en poblaciones expuestas ) Ejemplo: exposición accidental, terapéutica o laboral de individuos expuestos Principales Ensayos Utilizados en Genética Toxicológica • Mutaciones Génicas Test de Ames Ensayo de reversión a triptofano en E.coli Mutaciones génicas en cultivo de células de mamífero (HPRT o TK) Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila • Evaluaciones citogenéticas en células de mamífero Ensayo de aberraciones cromosómicas Ensayo de intercambio de cromátides hermanas Ensayo del micronúcleo Evaluación de Aneuploidías • Otros ensayos Daño y reparación en células de mamífero Estudios de recombinación mitótica en levaduras y/o Drosophila Ensayo del locus específico en ratón Ensayo del letal dominante Análisis citogenético y Ensayo de traslocaciones heredables Ensayo de alteraciones esqueléticas en ratón ALCANCES DISEÑO DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA CARACTERIZACION DE DAÑO EN SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA Las agencias internacionales de regulación han seleccionado grupos de biomarcadores de efecto con el objeto de lograr la mejor y más segura caracterización del daño, evaluando tanto “in vitro” como “in vivo” la genotoxicidad potencial. OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC SUBSTANCES (EPA) OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT (FDA) Guidelines S2A: Aspectos específicos de regulación de Ensayos de genotoxicidad S2B: Genotoxicidad: Una batería standard para el ensayo de genotoxicidad de productos farmacéuticos Los Comité Internacionales de Armonización (ICH) sugieren la realización de baterías de ensayos constituidas por: ◊ un ensayo de reversión en bacterias ◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas) o un estudio in vitro para mutaciones génicas) ◊ un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas o test de micronúcleo en ratón) Test de Salmonella o Test de Ames Desarrollo de cepas de S.typhimurium auxótrofas para histidina que permiten evaluar la retromutación de este organismo a histidina (+ ). Es decir que una especie que ha perdido una característica, vuelve a adquirirla en base a otra mutación. TA100, TA98, TA1535, TA1537, TA102, TA104 rfa, ∆uvr B, plásmido pKM101, plásmido pAQ1 UN ESTUDIO CITOGENETICO PARA DETECTAR DAÑO CROMOSOMICO (TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS ) O UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR MUTACIONES GENICAS (MOUSE LYMPHOMA ASSAY) ABERRACIONES CROMOSÓMICAS • Detecta alteraciones numérica y estructurales. • Se basa en evidenciar cambios en la morfología de los cromosomas o en su número pudiendo detectar modificaciones de ploidía. • Se utiliza para determinar el efecto clastogénico y/o aneunógeno de las drogas en estudio. • Es el test más utilizado históricamente para evaluación de drogas. Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Periférica con Aberraciones Cromosómicas Metafase Parcial de línea celular CHO con Aberraciones Cromosómicas IM =Nºcel en estadíos de mitosis/Nº total cel interfase Técnica de coloración diferencial de cromátide o FPG- fluorescencia plus giemsa IR= Nº cél. M1+2 Nº cél. M2 + 3 Nº cél. M3/100 Ensayo de Mutaciones Génicas en Células de Mamífero Se puede realizar en distintas líneas celulares L5178Y linfoma de ratón (TK) TK6 línea linfoblastoide humana (HGPRT) Ambos ensayos se basan en la adquisición de resistencia a un producto. Línea normal→no crece en presencia del producto. Línea mutada→ crece en presencia del producto. Para TK se seleccionan por resistencia a Trifluorotimidina. Las células deficientes en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina. UN TEST IN VIVO PARA GENOTOXICIDAD QUE DETECTE DAÑO CROMOSOMICO (ABERRACIONES CROMOSOMICAS O TEST DE MICRONUCLEO EN RATON) Evento Genotóxico Mala segregación Daño al ADN Defectos en: • Huso mitótico • Centrómero • Mala condensación cromosómica • Roturas de ADN • Errores de reparación MN MN Guidelines S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e Interpretación de datos para Productos farmacéuticos de uso Humano ◊ un ensayo de reversión en bacterias ◊ un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas o , o TEST DEL MICRONÚCLEO in vitro o ensayo de mutaciones génicas) ◊un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón, TEST DEL COMETA) ◊ un ensayo de reversión en bacterias ◊ un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS , uno que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY) AGENTES GENOTÓXICOS Ensayo de MNCB Inhibe la polimerización de actina CITOCALASINA B No se forma el anillo contráctil BLOQUEO DE LA CITOCINESIS Célula Binucleada con MN MICRONÚCLEOS CARACTERÍSTICAS Redondo u oval Borde liso y uniforme Igual plano focal que núcleo No ser refringente 1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo Igual coloración y textura que núcleo No superpuesto ni conectado Se analizan 1000 células BN Expresión de resultados: • Nº MN/1000 células BN • Frec. células BN con MN en 1000 BN DETECTA • Roturas de ADN simple cadena. • Roturas de ADN doble cadena. • Sitios Alcali lábiles. • ADN-ADN y ADN-prot cross linking. • Roturas simples asociadas con mecanismos de reparación incompletos ANALISIS DE RESULTADOS CONTEO VISUAL Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 células por muestra. Estableciendo Categorias de Daño: 1:< 20 micras 2: 20-40 micras 3: 40-80 micras 4: > 80 micras • ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4, siendo n la cantidad de células dañadas que se registraron para cada una de las cuatro categorías. SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA Inestabilidad cromosómica: ¾ Rearreglos, comportamiento citogenético anormal. ¾ Causas: • Mutaciones de proteínas involucradas en la replicación y reparación del ADN. • Fallos en puntos de control del ciclo celular. • Anomalías centrosómicas. • Defectos en la segregación. • Mal funcionamiento de los telómeros. • Recombinación homóloga vinculada a la reparación de roturas de ADN de doble hebra. Clasificación ¾ Síndromes clásicos • Anemia de Fanconi • Síndrome de Bloom • Ataxia Telangiectasia ¾ Síndromes menos frecuentes • • • • Nijmegen breakage ICF Cockayne Xeroderma Pigmentosa • • • • • Riyadh Rothmund-Thompson Radial-renal Craniostenosis-Microcefalia Dubowitz ¾ Otros factores intrínsecos hereditarios Carcinogénesis Ambiental exposición a agentes carcinogénicos Defectos en la replicación o Reparación del ADN Incremento en el riesgo de cáncer Dependiendo del síndrome, el comportamiento anormal tomará la forma de: • • • • Frecuencia elevada de aberraciones espontáneas Niveles elevados de intercambio de cromátides hermanas Hipersensibilidad cromosómica a Xenobióticos Rearreglos cromosómicos estables o recurrentes Características en común Predisposición a tumores Inmunodeficiencia Retardo en el crecimiento SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA SINDROME DE BLOOM Es autosómica recesiva. Mayor frecuencia en judíos Askenazi y japoneses. Presentación: microcefalia, alteraciones de piel y deficiencia inmunológicas. Poseen inteligencia normal. Riesgo: desarrollan distintos tipos de cáncer y leucemias agudas. Pronóstico de vida: la edad promedio de vida son los 24 años (14 a 49). Características citogenéticas:: rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e intercambio de cromátides hermanas. El diagnóstico citogenético se hace mediante ICH espontáneo, (90 o más) . El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1 ANEMIA DE FANCONI Autosómica recesiva. Presentación.: retardo mental, malformaciones esqueléticas, anomalías en piel, anemia severa. Riesgo: desarrollan sindromes mielodisplásicos y LMA Pronóstico de vida: La edad de sobrevida es hasta los 16 años y la causa de muerte es hemorragia y sepsis asociado a sindromes mielodisplásicos. Tipos: 7 grupos . Los genes involucrados se describen como FANC y se adicionan las letras que van desde A hasta G. Por ahora los de peor pronóstico son los del grupo G. Características citogenéticas: alteraciones estructurales espontáneas que se ven incrementadas cuando se exponen los cultivos a agentes inductores de cross-linking. Para el diagnóstico se utiliza DEB. ATAXIA TELANGIECTASIA Autosómica recesiva, Ataxia cerebelar y telangiectasia ocular, nariz y orejas No reconocen mecanismos de reparación de DSB Presentación: segundo año de vida con ataxia cerebelar progresiva, disartria y distonía. Riesgo: de leucemia y linfomas y tumores de piel, ovario, mama y estómago. Pronóstico de vida: hasta la 4ª década con medicación permanante. Características citogenéticas: Incremento de alteraciones tipo cromátide, roturas cromosómicas, triradiales y cuadriradiales Gen ATM 11q22-q23.1 Diagnóstico citogenético mediante exposición a rayos X o radiomiméticos (BLM) BIOMONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOS Edad Tiempo de trabajo Sexo Manifestaciones clínicas A 28 2 años F Lagrimeo/ rinorrea y descamación en piel B 32 3 años M Lagrimeo/ fotofobia C 32 9 años M Irritación visual/sequedad nasal/oligoazoospermia D 33 2 años F Irritación visual/sequedad en pie E 54 9 años F Sin síntomas F 46 25 años F Sequedad conjuntival G 36 2 años F Descamación/blefaritis/sequedad conjuntival MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOS IM IR ICH MN A 2.5 1.6 7.3± 0.48 3.92 B 2.2 1.5 5.94± 1.28 2.88 C 2.3 1.48 7.46± 0.65 12.66 D 3.6 1.65 6.9± 0.98 11.99 E 3.2 1.61 6.18± 0.64 15.29 F 2.5 1.45 7.93± 1.13 32.50 G 2.7 1.38 8.42± 020 16.20 CONTROL: IM:1.5 -6.8 IR: 1.3-2.4 ICH : 2-7.8 MN: 3-23 ESTRATEGIAS • 5 de los individuos presentan valores en el rango de los controles históricos y de la literatura • En tres casos alguno o varios de los biomarcadores se encuentran modificados con respecto a los valores control • Se sugiere la repetición luego de pasado un mínimo de 6 meses para analizar comportamiento celular con el mismo biomarcador alterado y/o la introducción de una nueva metodología que aporte mayor sensibilidad. LIMITACIONES MOTIVO DE APLICACIÓN DEL ESTUDIO ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORES ANAMNESIS INTERPRETACION DEL RESULTADO FACTORES CONFUNDENTES Muchas Gracias por su atención !!! CIGETOX Prof. Dra. Marta Ana Carballo Dra. Marcela López Nigro- Bioq. Victoria Arroyo Lic. y Ms. Susana Bartolotta Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada; Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia Casanova Becarios Iniciación: Med. Gabriel Angeleri- Lic. Erika Portmann Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana Curieses- Estud. Natalia Balarino